Técnicas de Biología Molecular: PCR. Ricardo Molina Gasset Hospital Virgen de los Lirios

Transcripción

1 Técnicas de Biología Molecular: PCR Ricardo Molina Gasset Hospital Virgen de los Lirios

2 P.C.R. "Polymerase Chain Reaction" "Reacción en Cadena de la Polimerasa"

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4 Organización General Individuo Órganos Tejido Células Citoplasma Diferentes orgánulos Individuo Núcleo Cromosomas (DNA)

5 Código Genético DNA Severo Ochoa RNA A G C T T A G A T A A Bases Proteína (enzimas, hormonas, HLA y otros) A3 Aminoácidos A1 A2 Proteína A1-A2-A3-...

6 Extensión DNA genómico ( bases) CCATACCCCTAGGTAC ATGGACCCCTAGGTAC ATACCCCTAGGTAC ATACTCCCTAGGTAC ATACCGGTCCTAGGTAC CCATACCCCTAGGTAC ATGGACCCCTAGGTAC ATACGCCCTAGGTAC AGTACCCCTAGGTAC ATTTACCCCTAGGTAC ATTTACCCCTAGGTAC ATTTACCCCTAGGTAC ATTTACCCCTAGGTAC vol/ 200 páginas caracteres/página

7 Transmisión de la información genética Transmisión de ADN Transcripción Núcleo ARN Procesamiento ARN mensajero Transporte ARN mensajero Citoplasma Traducción Proteína

8 Síntesis de ADN complementario ADN Transcripción Retrotranscripción ARN mensajero A G C T T A T G A T A A A G C T T A G CA T A A T G A

9 Enlaces entre bases Pares de bases Adenosina-Timidina Guanosina-Citidina

10 Análisis genético Sangre Leucocitos DNA Técnica PCR Detección del ADN Secueciacíon RFLP Southern

11 Usos de la P.C.R. Medicina Virología, Bacteriología Genética, Oncogenes Tipaje HLA y Paternidad Medicina Forense Farmacología, Biología, Veterinaria... Antropología, Arqueología... Análisis Medioambiental

12 Ventajas de la P.C.R. Especificidad Sólo se amplifica lo determinado por los "primers Sensibilidad Detecta 1 molécula amplificándola hasta obtener millones de copias Rapidez Obtención de Resultados en pocas horas

13 Sistemática de trabajo con DNA :PCR Paso 1: Obtención del DNA Paso 2: Desnaturalización del DNA Paso 3: Amplificación DNA Paso 4: Terminación ciclo Paso 5: Detección PCR

14 Extracción de DNA Procedencia Calidad Métodos Conservación del DNA

15 Tipos de muestras Sangre entera (EDTA) Plasma (EDTA) o suero generalmente en virología Células aisladas (Mononucleares, en cultivo) Tejidos (Congelar en nítrógeno líquido lo más rápido posible para evitar la degradación del RNA o DNA) Líquidos biológicos Orina o exudado cervical (C. trachomatis o N. gonorrhorae) Líquido amniótico para diagnóstico prenatal LCR Líquido pleural para el diagnóstico de metástasis cancerosas o enfermedades linfoproliferativas

16 Tipos de muestras Muestras de la pared bucal para obtener muestras de DNA Médula ósea para dg de enf. Linfoproliferativas o la detección de metástasis cancerosas. Esputo para la detección de Mycobacterium tuberculosis Pus estudio de bacterias Tejidos parafinados o fijados. Muestras de sangre en papel Guthrie

17 Conservación de las muestras Sangre entera Tejidos procesar rápidamente, si no se puede lo mejor es sumergirlo 15-20s seg en nitrógeno líquido y después conservar a 70ºC hasta la extracción de DNA. Si no tengo 70, lo corto en pedacitos pequeños para asegurarme una rápida congelación Plasma o suero congelar a 70 o 20 en alícuotas Orina estable para C. trachomatis y N. gonorreae por 4 días a 4ºC y 60 días si se congela Exudado cervical - en medio de transporte se conserva igual que orina.

18 Conservación de las muestras Bucal. En general estable a Tª ambiente, pero es conveniente realizar la extracción lo antes posible por las bacterias contaminantes Líquido amniótico. Se procesa enseguida. Si no es posible,congelar el pellet celular. Médula ósea y líquido pleural. No debe congelarse (x hemo) se puede refrigerar a 4ºC por menos de 72 horas pero lo ideal es procesarla enseguida Esputo guardar a 2-8 ºC hasta ser procesada pero debe hacerse dentro de las 24 horas de la recolección (decontaminación y concentración). Pus, se puede refrigerar o congelar si no tiene hematies. Tejido fijado. Especímen de último recurso.

19 Es Importante Diferenciar dos Conceptos Extracción: sacar los componentes desde un compartimento celular. Involucra: Lisis de las células que contienen a los AN Inactivación de nucleasas Clarificación: separación de los AN de los restos celulares (debris). Purificación: Separación de AN: De proteínas solubles De otros AN no deseados De Lípidos, carbohidratos De sales y otros compuestos orgánicos

20 EL PROBLEMA Para muchas aplicaciones que involucran manipulación de ADN es necesario disponer de éstos en estado puro. Por qué purificar? Nucleasas que se liberan al lisar las células degradan los ácidos nucléicos. Interferentes que inhiben a las enzimas que se usan en ingeniería genética. El desafío es separar los ácidos nucléicos deseados desde una mezcla compleja, manteniendo la integridad de los mismos Contaminantes: Proteínas, lípidos y carbohidratos, sales del medio, iones, etc.

21 Etapas básicas b de un procedimiento general para Extracción n y Purificación n de AN Disgregación o fragmentación del tejido Estas etapas deben ir acompañadas de medidas o agentes que inactiven nucleasas celulares Lisis celular Clarificación Purificación Durante todo el procedimiento se debe usar soluciones y material estéril, ademas de guantes Cualitativo: electroforesis Análisis Cuantitativo: espectrofotometría UV

22 1. Métodos M de fragmentación n y lisis celular para la extracción n de ADN El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para p romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadeza requerida para preservar las moléculas de interés s (ADN o ARN). Métodos físicos Homogenización mecánica, Homogenización en solución Molienda manual en mortero Bolitas de vidrio Sonicación Métodos químicos - Detergentes Métodos enzimáticos Lysozima: rompe enlaces β-1.4- entre N-acetil murámico y N-acetil glucosamina de peptidoglicán de la pared celular de bacterias Lyticasa: rompe enlaces β-1.3 de glucano de levaduras Proteasas: rompe enlaces peptídicos de prot. de pared y membrana plasmática e interacciones célula-célula.

23 Table 1. Techniques used for the physical disruption of cells. Lysis Method Ruptura Description de células Apparatus por medios físicos Mechanical Liquid Homogenization Waring Blender Polytron Dounce Homogenizer Potter-Elvehjem Homogenizer French Press Rotating blades grind and disperse cells and tissues Cell or tissue suspensions are sheared by forcing them through a narrow space Sonication Sonicator High frequency sound waves shear cells Freeze/Thaw Freezer or dry ice/ethanol Repeated cycles of freezing and thawing disrupt cells through ice crystal formation Manual grinding Mortar and pestle Grinding plant tissue, frozen in liquid nitrogen Homogenizador mecánico - polytron Homogenizador Dounce Sonicador

24 Métodos para lisar células

25 Otros componentes de una solución n de lisis Debe Incluir Etilen diamino tetracetico (EDTA). Quelante de iones Mg 2+, baja la concentación efectiva de este ión. Por lo tanto, EDTA inhibe nucleasas y minimiza la degradacion de AN durante la extración/purificación. Amortiguador de ph (7-8).

26 2. Clarificación. Eliminación n de restos celulares (debris( debris) Centifugación Filtración Método mixto: enzimas + centrifugación

27 3. Purificación Desproteinización con fenol, que al desnaturalizar las proteínas causa su precipitación. Precipitación de proteínas con sales ( salting out ) Cromatografía De intercambio iónico De adsorción a sílica De filtración Extracción de DNA desde un gel de agarosa

28 Extracción Fenólica de proteínas fenol

29 Cromatografía a de intercambio aniónico nico

30 Cromatografía a de intercambio aniónico nico

31 Cromatografía a de intercambio aniónico nico

32 Cromatografía a de adsorción

33 Cromatografía a de adsorcion DNA eluye de la sílica en agua DNA se une a la sílica en NaI

34 Metodos magnéticos

35 DNA es insoluble en solución alcohólica

36 Análisis espectrofotométrico trico de ADN Longitud de onda Razón Abs230/Abs260 debe ser menor de 0.5 (> sugiere contaminación con fenol/chcl o carbohidratos). Razón Abs260/Abs280 debe ser ~1.8 (< sugiere contaminación con proteínas, Abs320 se debe a difracción de la luz por material particulado en la muestra. Debería ser baja.

37 Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificados Cantidad de material de partida Número de copias de las moléculas de AN Cantidad de tejido Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado) Contaminantes e interferentes en el material biológico Hay un compromiso entre rendimiento/calidad/pureza

38 Conservación de las muestras de ADN El DNA purificado es relativamente estable si se encuentra en un buffer libre de DNAsas. Se ha visto que es estable a 4ºC por 3 años. Los ciclos de congelado-descongelado dañan el DNA por lo cualse recomienda alicuotar las muestras. Tips de punta estrecha pueden cortar hebras de DNA cuando se trabaja en solución.

39 Componentes de la PCR ADN polimerasa termoestable Oligonucleotidos iniciadores ( primers ) Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dntps) Cationes divalentes Buffer (para mantener el ph) ADN molde (Templado)

40 Polimerasas Llevan a cabo la síntesis de ADN dependiente del templado. Estabilidad Taq: 9 min at 97 C, Pwo >2 hr a 100 C Fidelidad Taq: baja, Pfu: alta Cantidad usada = 5 x moleculas (0.5 unidades) La más comunmente usada = Taq ADN polimerasa

41 Polimerasas Polimerasa de la DNA Fuente Biológica 5' -- 3 ' Exonuclease Actividad 3' -- 5 ' Exonuclease Actividad período 95 C (minuto) Velocidad extensión (nucleosides/s) Error Taq Thermus Aquaticus en 10^3 Pfu Furiosus de Pyrococcus en 1.3 x 10^6 Pwo Woesei de Pyrococcus - + N/A N/A N/A Tfl Thermas flavus - - rtth Themus thermophilus Tli Litoris de Thermus Tma Maritima de Thermotoga - + > 50

42 Oligonucleótidos Se conoce su secuencia Factor más importante para la eficiencia y la especificidad del proceso Deben estar presentes en exceso Requieren de un cuidadoso diseño: (a) longitud = (b) Contenido de G+C entre 40-60% (c) Evitar las secuencias repetidas (d) Valores de T m de no más de 5 C uno del otro

43 ADN molde (templado) Puede ser cadena simple o doble ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg of plasmídico Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas

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