EVALUACIÓN DE TRES PRUEBAS DE PCR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Leishmania (Viannia) EN DIFERENTES MUESTRAS BIOLÓGICAS.

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1 EVALUACIÓN DE TRES PRUEBAS DE PCR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Leishmania (Viannia) EN DIFERENTES MUESTRAS BIOLÓGICAS. MARJORIE CAROLINA MONTENEGRO ARCILA JUAN CARLOS SANTOS BARBOSA TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito para obtener el título de MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIO PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Bogotá, D.C Mayo de

2 EVALUACIÓN DE TRES PRUEBAS DE PCR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Leishmania (Viannia) EN DIFERENTES MUESTRAS BIOLÓGICAS. MARJORIE CAROLINA MONTENEGRO ARCILA JUAN CARLOS SANTOS BARBOSA APROBADO: INGRID SCHULER GARCÍA DECANA ACADÉMICA FACULTAD DE CIENCIAS JANETH ARIAS PALACIOS DIRECTORA CARRERAS DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA VETERINARIA 2

3 EVALUACIÓN DE TRES PRUEBAS DE PCR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Leishmania (Viannia) EN DIFERENTES MUESTRAS BIOLÓGICAS. MARJORIE CAROLINA MONTENEGRO ARCILA JUAN CARLOS SANTOS BARBOSA APROBADO: CLAUDIA LILIANA CUERVO PATIÑO, MsC DIRECTORA CONCEPCIÓN PUERTA BULA, Ph. D CODIRECTORA MARYLIN HIDALGO Ph. D JURADO 3

4 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la resolución No. 13 de julio de 1946: La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario a la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia 4

5 LISTA DE ANEXOS Pág ANEXO 1. Condiciones y programa PCR cisteíno proteasa / glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (GPDH)/ Cinetoplasto 48 5

6 LISTA DE FIGURAS Pág Figura 1. Figura 2. Figura 3. Clasificación taxonómica del género Leishmania Tomado de Bañuls et al, PCR de la proteasa de cisteína. Prueba de condiciones de PCR 21 PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. Prueba de condiciones de PCR 21 Figura 4. PCR del cinetoplasto. Prueba de condiciones de PCR 22 Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. PCR de la proteasa de cisteína. A. Evaluación de la sensibilidad con diferentes concentraciones de ADN desnudo de L (V.) braziliensis. B. Evaluación de la sensibilidad con diferentes concentraciones en dilución base 10 de ADN desnudo de L (V.) braziliensis 22 PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. A. Evaluación de la sensibilidad de primers A-C con diferentes concentraciones de ADN desnudo de L (V.) braziliensis B. Evaluación de la sensibilidad de primers A-C con diferentes concentraciones de ADN desnudo de L (V.) braziliensis 23 PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. Evaluación de la sensibilidad de primers B-C con diferentes concentraciones de ADN desnudo de L (V.) braziliensis. B. Evaluación de la sensibilidad de primers B-C con diferentes concentraciones en dilución base 10 de ADN desnudo de L (V.) braziliensis. 23 PCR del cinetoplasto. A. Evaluación de la sensibilidad con diferentes concentraciones en dilución base 10 de ADN desnudo de L (V.) braziliensis B. Réplica de evaluación de la sensibilidad con diferentes concentraciones en dilución base 10 de ADN desnudo de L (V.) braziliensis 24 PCR de la proteasa de cisteína. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis en buffer PBS 25 PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. A. Evaluación de la sensibilidad de los primers A-C con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis en buffer PBS. B. Evaluación de la sensibilidad de los primers B-C con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis en buffer PBS. 25 6

7 Figura 11. Figura 12. PCR del cinetoplasto. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis en buffer PBS. 26 PCR de la proteasa de cisteína. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis en sangre de canino 27 Figura 13. PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de canino. A. Primers ISVA-ISVC 27 Figura 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17. Figura 18. Figura 19. PCR del cinetoplasto. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de canino 28 PCR de la proteasa de cisteína. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de perro y preservada con clorhidrato de guanidina 29 PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. A. Evaluación de la sensibilidad con los primers ISVA-ISVC con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de canino y preservada con clorhidrato de guanidina B. Evaluación de la sensibilidad con los primers ISVB-ISVC con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de canino y preservada con clorhidrato de guanidina 29 PCR del cinetoplasto. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de canino y preservada con clorhidrato de guanidina 30 PCR de la proteasa de cisteína. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre humana en dilución 1/ PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. A. Evaluación de la sensibilidad con los primers ISVA-ISVC con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre humana en dilución 1/20. B. Evaluación de la sensibilidad con los primers ISVB-ISVC con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre humana en dilución 1/

8 Figura 20. Figura 21. Figura 22. Figura 23. Figura 24. Figura 25. Figura 26. Figura 27. Figura 28. PCR del cinetoplasto. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre humana en dilución 1/10 32 PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. A. Evaluación de la sensibilidad con los primers ISVA-ISVC con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre humana y preservada con clorhidrato de guanidina en dilución 1/20. B. Evaluación de la sensibilidad con los primers ISVB-ISVC con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre humana y preservadas en clorhidrato de guanidina 32 PCR del cinetoplasto. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre humana y preservadas en clorhidrato de guanidina en dilución 1/5. 33 PCR de la proteasa de cisteína. A. Evaluación de la especificidad con ADN desnudo de protozoarios del orden Kinetoplastida y ADN de algunos hospederos B., Digestión del producto de amplificación de Leishmania (Viannia) braziliensis con la enzima de restricción Kpn I 34 PCR de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. A. Evaluación de la especificidad con ADN desnudo de diferentes protozoos del orden Kinetoplastida y ADN de algunos hospederos. Primers ISVA-ISVC. B. Evaluación de la especificidad con ADN desnudo de diferentes protozoos del orden Kinetoplastida y ADN de algunos hospederos. Primers ISVB-ISVC: 35 PCR del cinetoplasto. A. Evaluación de la especificidad con ADN desnudo de diferentes protozoos del orden Kinetoplastida y ADN de algunos hospederos B. Réplica de la especificidad de la PCR con 250 ng de ADN desnudo de los diferentes protozoos del orden Kinetoplastida y ADN de algunos hospederos 36 PCR de la proteasa de cisteína. A. Evaluación del desempeño de la PCR con 10 muestras de ADN de cultivo ). B. Digestión de las muestras positivas con la enzima de restricción Kpn I 39 PCR de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. A. Evaluación del desempeño de los primers ISVA-ISVC de las 10 muestras de ADN de cultivo). B. Evaluación del desempeño de los primers ISVB-ISVC de las 10 muestras de ADN de cultivo 40 PCR del cinetoplasto. Evaluación del desempeño de la PCR con las 10 muestras de ADN de cultivo 41 8

9 Figura 29. Figura 30. PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. A. Evaluación del desempeño de los primers ISVA-ISVC con ADN extraído de sangre de un paciente sospechoso de leishmaniasis. ADN del paciente extraído con el estuche comercial B. Evaluación del desempeño de los primers ISVB-ISVC con ADN extraído de sangre de un paciente sospechoso de leishmaniasis 42 PCR del cinetoplasto. Evaluación del desempeño de la PCR con ADN extraído de sangre de paciente sospechoso de leishmaniasis 42 9

10 LISTA DE TABLAS Pág Tabla 1 Resultados del desempeño de las tres PCR con diez muestras del PECET 38 Tabla 2 Reacción de PCR para el gen la proteasa de cisteína tipo I 48 Tabla 3 Reacción de PCR para el gen de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa 48 Tabla 4 Reacción de PCR para el cinetoplasto 48 Tabla 5 Programas de PCR para los cebadores NTER/CTER; ISVA/ISVC; ISVB/ISVC; LV/B

11 Tabla de contenido RESUMEN INTRODUCCIÓN JUSTIFICACIÓN MARCO TEÓRICO Leishmaniasis Epidemiología Diagnóstico OBJETIVOS Objetivo General Objetivos específicos METODOLOGÍA Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) PCR RFLP (del inglés Restriction fragment length polymorphism ) para el gen de la proteasa de la cisteíno tipo I PCR de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa: PCR del ADN del Cinetoplasto: Sensibilidad de las PCR Con ADN desnudo del parásito Con formas de cultivo Especificidad de las PCR Evaluación del desempeño RESULTADOS Y DISCUSIÓN Condiciones de las PCR Evaluación de la Sensibilidad de las pruebas de PCR Sensibilidad de las tres pruebas de PCR con ADN desnudo del parásito: Sensibilidad de las tres pruebas de PCR con formas promastigotas del parásito En cultivo Mezcladas con sangre de canino sin preservar y preservada con clorhidrato de guanidina:

12 2.2.3 Mezcladas con sangre humana sin preservar y preservada con clorhidrato de guanidina Evaluación de la especificidad de las tres pruebas de PCR: Evaluación del desempeño de las tres pruebas de PCR Desempeño de las tres pruebas de PCR con ADN de los parásitos obtenidos de cultivo de muestras de tejido humano y de canino: Desempeño de dos pruebas de PCR con ADN obtenido a partir de sangre de un paciente sospechoso de leishmaniasis mucocutánea CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA Anexo

13 RESUMEN La leishmaniasis es un grupo de enfermedades endémicas del trópico causadas por protozoos intracelulares del género Leishmania, la presentación de dichas patologías es especie-específica, lo que hace necesario desarrollar técnicas que permitan la identificación de la especie del parásito implicada de manera rápida y confiable, teniendo en cuenta que las metodologías de diagnóstico usadas como Gold standard presentan problemas de sensibilidad, especificidad y rapidez en la detección del mismo. Dadas las ventajas de las técnicas moleculares y el actual auge de la PCR como técnica diagnóstico, se evaluaron las características de sensibilidad y especificidad con ADN desnudo, formas parasitarias solas y mezcladas con ADN de canino y humano preservadas o no con clorhidrato de guanidina para tres pruebas de PCR, dos con blanco nuclear (PCR de la proteasa de cisteíno tipo I y PCR de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (GPDH)) y una con blanco en el ADN de los minicírculos del cinetoplasto de Leishmania (Viannia). Adicionalmente, se realizó la evaluación de la especificidad de las tres PCR con ADN de otros Kinetoplástidos y de posibles hospederos del parásito. Finalmente, se evaluó el desempeño de dos de estas pruebas con muestras de cultivo de parásitos obtenidos a partir de tejido de hospedero canino o humano y con una muestra de sangre de un paciente sospechoso de Leishmaniasis mucocutánea. Los resultados mostraron que las PCR con blanco nuclear (proteasa de cisteíno tipo I y GPDH) presentaron menor sensibilidad que la PCR del cinetoplasto en todos los ensayos realizados. Sin embargo, la PCR con blanco en el ADN del cinetoplasto presentó inconvenientes de reproducibilidad y susceptibilidad a la inhibición, lo que se relacionó principalmente con las metodologías de extracción utilizadas y la presencia de inhibidores de tipo proteico en los ADN extraídos. Por otra parte, los ensayos de especificidad mostraron que las PCR con blanco genómico son muy específicas, mientras que la PCR del cinetoplasto presentó otras bandas de amplificación, no sólo en el control positivo sino para Kinetoplástidos de los géneros Trypanosoma y Leishmania, subgénero Leishmania. Finalmente, la evaluación del desempeño de las tres pruebas de PCR permitió la identificación de 6 cepas como Leishmania (Viannia) braziliensis y de dos más como Leishmania (Viannia) sp a partir de ADN obtenido de cultivo, mientras que el ADN extraído a partir de la muestra de sangre del paciente sospechoso de leishmaniasis mucocutánea no amplificó con la PCR GPDH y presentó bandas de tamaños diferentes al esperado en la PCR del cinetoplasto. Los resultados en su conjunto nos permiten concluir que pese a la alta sensibilidad mostrada por la PCR del cinetoplasto, su uso no es recomendable como prueba diagnóstico piloto, por lo menos con las condiciones evaluadas en el presente trabajo. Además, se resalta la baja sensibilidad de las PCR con blanco genómico. 13

14 INTRODUCCIÓN El género Leishmania, patógeno del hombre (Akkafa et al, 2008), caninos domésticos, silvestres (Sobrino et al, 2008; Castro et al, 2007) y otros mamíferos (Filho et al, 2008), causa diversas patologías que van desde afecciones cutáneas y mucocutáneas, hasta viscerales, dependiendo de la especie que infecte (Bañuls et al, 2007). Este género, comprende dos subgéneros: Viannia y Leishmania, dentro de los cuales se encuentran diferentes especies que generan una o las tres formas de la enfermedad (Bañuls et al, 2007). La leishmaniasis cutánea americana (LCA), que corresponde al 99,18% de los casos de leishmaniasis reportados en Colombia (INS, 2007), es causada por todas las especies pertenecientes al subgénero Viannia (Bañuls et al, 2007). Dentro del subgénero Viannia, en Colombia se ha reportado la presencia de dos complejos: el complejo Leishmania braziliensis y el complejo Leishmania guyanensis; en el primero se encuentran las especies Leishmania (Viannia) panamensis y Leishmania (Viannia) brazilensis, las principales responsables de la leishmaniasis cutánea y mucocutánea, respectivamente. Para el subgénero Leishmania, todas las especies del complejo Leishmania mexicana y algunas de los complejos Leishmania tropica y Leishmania major, también se han reportado que pueden producir LCA (Bañuls et al, 2007), sin embargo, existen pocos reportes de su presencia en el país (Ovalle et al, 2006). Por otra parte, el diagnóstico de la Leishmaniasis realizado generalmente por demostración del parásito en muestras de lesiones o por serología (Maia y Campino, 2008), se dificulta por la baja sensibilidad y especificidad de las técnicas convencionales utilizadas, la ausencia de seroconversión ante una infección reciente (Indiani et al, 2003) y la baja diseminación hematógena que ocurre en algunas infecciones (Reithinger et al, 2003), a lo que se le suma el hecho de que no permiten la identificación de la especie de Leishmania implicada, la cual tiene importancia no sólo epidemiológica sino clínica puesto que permite un acercamiento al tratamiento y seguimiento adecuado (Akkafa et al, 2008). Teniendo en cuenta lo anterior y que el diagnostico especie-específico es de gran relevancia, se han desarrollado pruebas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que ofrecen rapidez y alta sensibilidad en el diagnóstico de esta patología y de manera importante, permiten la detección de la especie de Leishmania implicada (Reithinger et al, 2003). Adicionalmente, la PCR puede ser usada no sólo en el diagnóstico de la enfermedad, sino para el estudio de la biología y epidemiología del parásito en los laboratorios de investigación, por lo cual es importante contar con técnicas estandarizadas, que cuenten con características óptimas de desempeño. Con base en lo anterior, se evaluó la sensibilidad y especificidad de tres pruebas de PCR para la identificación específica de Leishmania (Viannia) braziliensis: la PCR-RFLP del gen de la proteasa de cisteíno tipo I (PECET, Comunicación personal), la PCR basada en 14

15 la amplificación del gen de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (Castilho et al, 2003), y la PCR basada en la amplificación del ADN del cinetoplasto (Figueroa et al, 2009; Vergel et al, 2005), así como su desempeño en la identificación del parásito en muestras biológicas. JUSTIFICACIÓN La leishmaniasis, patología producida por diferentes especies del género Leishmania sp, presenta diversas formas y síntomas relacionados de manera directa con la especie del parásito que infecta el hospedero. Debido a su importancia epidemiológica en el país, se ha hecho necesario implementar técnicas de identificación rápida que permitan determinar la especie de Leishmania implicada en el proceso patológico. La PCR permite amplificar fragmentos de ADN del parásito presentes en diferentes muestras biológicas; ésta técnica cuenta con características particulares de sensibilidad y especificidad que deben ser conocidas y puestas a punto en el laboratorio que las va a utilizar. El presente trabajo se realizó con el objetivo de evaluar el desempeño en el laboratorio de parasitología molecular de la Pontificia Universidad Javeriana de tres pruebas de PCR, dos con blanco en el ADN genómico del parásito (gen de la proteasa de cisteína tipo I y gen de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa) y una para el ADN del cinetoplasto, con respecto a su sensibilidad y especificidad en diferentes muestras biológicas y en base a las condiciones de reacción citadas en la literatura MARCO TEÓRICO Leishmaniasis La leishmaniasis es un grupo de enfermedades endémicas del trópico causadas por protozoos intracelulares del género Leishmania (Jhingran et al, 2008). Existe un alto número de especies, con características morfológicas similares, los mismos estadios durante su ciclo de vida (amastigotes y promastigotes) y diferencias en cuanto a su distribución geográfica y características clínicas de las patologías que producen (Botero y Restrepo, 1998). Estos protozoos son transmitidos principalmente por insectos vectores de la familia Phlebotominae que según su distribución geográfica corresponden a los géneros Phlebotomus (viejo mundo) y Lutzomyia (en el nuevo mundo), que poseen un hábito alimenticio hematófago necesario para el desarrollo de sus huevos (Bañuls et al, 2007). El género Leishmania actualmente se encuentra dividido en los subgéneros Leishmania y Viannia (ver figura 1), división propuesta según la zona de desarrollo del parásito en el intestino del vector (OMS, 1990). Las diferentes especies son capaces de producir enfermedad en humanos, animales domésticos y peridomiciliares, principalmente caninos (Gómez et al, 2007). Aunque algunos animales pueden cursar asintomáticos la literatura reporta la importancia de la 15

16 vigilancia de dichos reservorios como parte de una acción preventiva de la enfermedad debido a la cercanía que tienen estos con los humanos tanto en zonas domésticas como selváticas (Maia y Campino, 2008; Botero y Restrepo, 1998). Las tres formas clínicas principales de presentación de la enfermedad son: Leishmaniasis cutánea, caracterizada por la aparición de lesiones ulcerosas con bordes definidos que coinciden con el sitio de la picadura del vector y principalmente localizadas en extremidades y rostro, relacionada con especies del género Viannia en el nuevo mundo y en el viejo mundo con L tropica y L major, entre otras (Jhingran et al, 2008; Gilles 1999; Botero y Restrepo 1998), leishmaniasis mucocutánea, caracterizada por ser una forma que se desarrolla posterior a una infección de tipo cutánea con una diseminación hematógena o linfática de la piel a la mucosa nasofaríngea culminando en una destrucción de la zona; la especie relacionada con esta presentación es L. (V) braziliensis en el nuevo mundo (Jhingran et al, 2008; Bañuls et al, 2007; Gilles 1999) y la Leishmaniasis visceral, la presentación más grave; sus principales síntomas son esplenomegalia y pancitopenia siendo una enfermedad sistémica que generalmente es fatal si no se trata adecuadamente; las principales especies causantes de esta forma de la enfermedad son las pertenecientes a los complejos L. donovani en el viejo mundo y L. (V) braziliensis para el nuevo mundo (Jhingran et al, 2008; Gilles 1999; Botero y Restrepo 1998). (Figura 1. Clasificación taxonómica del género Leishmania. Tomado de Bañuls et al, 2007). 16

17 Epidemiología A nivel mundial la leishmaniasis se encuentra distribuida en Norte y Sudamérica, Europa, África y Asia, limitada por las zonas en las cuales los vectores flebótomos pueden sobrevivir. Según datos de la OMS se estima que ocurren cada año dos millones de casos nuevos en todo el mundo y que el número de personas infectadas sobrepasan los doce millones (OMS, 2007). Pese a su importancia, esta parasitosis no es diagnosticada ni monitoreada con frecuencia y por lo tanto las cifras de personas infectadas son subestimadas (OMS 2007; INS 2007). En Colombia, en la década de los 90 se notificaron en promedio nuevos casos de leishmaniasis, para la década del 2000 se notificaron más de casos (INS, 2007), teniendo en cuenta que la enfermedad es endémica de casi todo el territorio colombiano y la gran extensión de zonas rurales del país, es innegable el alto índice de población susceptible, por lo tanto se ha hecho necesario implantar medidas preventivas de mayor alcance y efectividad, entre ellas herramientas que permitan un diagnostico rápido y certero de la enfermedad (INS, 2007). Diagnóstico La observación directa de amastigotes intracelulares a partir de incisión y raspado de lesión, nódulos linfáticos, médula ósea o bazo es la técnica más utilizada para el diagnostico clínico, sin embargo, esta metodología puede llevar a falsos negativos y adicionalmente no permite determinar la especie de Leishmania implicada (Maia y Campino, 2008; Jhingran et al, 2008; Gilles, 1999). Otras pruebas como el Test de Montenegro (inoculación de promastigotes muertos en piel para la observación de una reacción de hipersensibilidad localizada que indicaría la presencia de anticuerpos contra el parásito) (Maia y Campino, 2008; Gilles, 1999), ELISA, inmunofluorescencia directa e indirecta (IFI), aglutinación directa y aglutinación en látex, son también comúnmente usadas para el diagnostico de la enfermedad especialmente en casos de Leishmaniasis visceral, en la cual ocurre una diseminación sistémica (Maia et al, 2009, Jhingran et al, 2008; Reithinger et al, 2000, Gilles, 1999). Por otra parte, se han desarrollado pruebas moleculares como la PCR, reconocida por su alta utilidad en casos activos de la enfermedad (Maia y Campino, 2008), la cual ha mostrado una alta especificidad y sensibilidad, que aunque menor a las metodologías serológicas va en aumento y está directamente relacionada con el iniciador utilizado, el ADN blanco, el protocolo de extracción del ADN y la muestra analizada, entre otros factores. Por su parte, las técnicas moleculares a diferencia de las técnicas inmunológicas cuentan con la ventaja de permitir la discriminación de la especie implicada en la infección (Reithinger et al, 2003). Muchas de las PCR desarrolladas en la actualidad tienen como blanco el ADN de los minicírculos del cinetoplasto, puesto que cada parásito posee aproximadamente copias de cada uno de estos (Jhingran et al, 2008; Lambson et al 2000), lo que le confiere una mayor sensibilidad. Otras dianas de amplificación reconocidas son los genes que 17

18 codifican para complejos enzimáticos como por ejemplo: la PCR de la glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa y la PCR del gen de la cisteíno proteasa, (Montalvo et al, 2008; Castilho et al, 2003), secuencias del gen que codifica para el SL Spliced leader (Jorquera et al, 2005; Harris et al, 1998) y ADN de la sub unidad pequeña ribosomal (SSU) (Campino et al, 2000; Mathis y Deplazes, 1995). OBJETIVOS Objetivo General Evaluar tres pruebas de PCR para la identificación de Leishmania (Viannia) en diferentes muestras biológicas en el Laboratorio de Parasitología Molecular de la Pontificia Universidad Javeriana. Objetivos específicos Determinar la sensibilidad de tres pruebas de PCR para la identificación de Leishmania (Viannia). Determinar la especificidad de tres pruebas de PCR para la identificación de Leishmania (Viannia). Evaluar el desempeño de tres pruebas de PCR a partir de diferentes muestras biológicas. METODOLOGÍA 1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 1.1 PCR RFLP (del inglés Restriction fragment length polymorphism ) para el gen de la proteasa de la cisteíno tipo I: Esta PCR amplifica un fragmento de pb, especifico para Leishmania (Viannia). La posterior digestión del fragmento amplificado con la enzima de restricción KpnI, la cual tiene diana de restricción en el fragmento amplificado de Leishmania (Viannia) braziliensis permite diferenciarla de las otras especies de este subgénero (PECET, Comunicación personal). 1.2 PCR de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa: Amplifica un fragmento de 336 pb específico para todas las especies del género Leishmania (sub-género Viannia), con el juego de oligonucleótidos ISVA/ISVC y un fragmento de 234 pb específico para Leishmania (Viannia) braziliensis con los oligonucleótidos ISVA/ISVB (Castilho et al, 2003). 1.3 PCR del ADN del Cinetoplasto: Amplifica un fragmento de 700 pb específico de Leishmania (Viannia) (Figueroa et al, 2009; Vergel et al, 2005). 18

19 2. Sensibilidad de las PCR La sensibilidad de las PCR mencionadas se evaluó de la siguiente forma: 2.1 Con ADN desnudo del parásito A partir del ADN desnudo de L. braziliensis extraído por el método de fenol-cloroformo (Sambrook et al, 2001), a diferentes concentraciones, desde 250 ng hasta 0.5 fg preparado por diluciones en base Con formas de cultivo A partir de formas parasitarias en PBS en recuento de hasta 0.1 promastigotes de cultivo, extraídos por el método de fenol-cloroformo (Sambrook et al, 2001) modificado: 1 paso por fenol, 3 por fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y 2 cloroformo-alcohol isoamílico Con ; ; 1.000; 100; 10; 1 y 0.1 formas parasitarias mezcladas con 100 l de sangre de canino, sin conservar y conservadas con un volumen de clorhidrato de guanidina, extraídas por el método de fenol-cloroformo (Sambrook et al, 2001) modificado. Para la mezcla de formas con sangre de canino y humano sin clorhidrato de guanidina, la extracción se realizó según lo descrito por Sambrook et al, 2001, sin ninguna modificación: 1 limpieza con fenol, 2 con fenol-clorofomo-alcohol isoamílico y 1 con cloroformo-alcohol isoamílico Con ; ; 1.000; 100; 10; 1 y 0.1 formas parasitarias mezcladas con 250 l de sangre humana, sin conservar y conservadas con un volumen de clorhidrato de guanidina, extraídas por el método de fenol-cloroformo (Sambrook et al, 2001) modificado. Para la mezcla de formas con sangre de canino y humano sin clorhidrato de guanidina, la extracción se realizó según lo descrito por Sambrook et al, 2001, sin ninguna modificación: 1 limpieza con fenol, 2 con fenol-clorofomo-alcohol isoamílico y 1 con cloroformo-alcohol isoamílico. 3. Especificidad de las PCR Para evaluar la especificidad de las 3 pruebas de PCR se utilizó ADN de protozoarios del orden Kinetoplastida, por su relación filogenética cercana con Leishmania (Viannia), tales como Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rangeli, Leishmania (Leishmania) chagasi y Crithidia sp. Adicionalmente, de aquellos posibles hospederos del parásito cuyo ADN se reconoce como parte de una muestra (humano y canino). 4. Evaluación del desempeño Para la evaluación del desempeño de la tres pruebas de PCR, se utilizaron 10 ADN extraídos a partir de cultivo de muestras obtenidas de canino (#36, #38, #117, #121, #149) y humano (#39, #44, #47, #48, #59), amablemente donadas por el programa de estudio y control de enfermedades (PECET) y una muestra de sangre de un paciente sospechoso de Leishmaniasis mucocutánea atendido en el Instituto Nacional de Salud,(500 l de la muestra de sangre fueron usados para la extracción por el método de 19

20 fenol cloroformo y 400 l para extracción mediante un estuche comercial para la extracción de ADN genómico a partir de sangre (Qiagen)). Como controles se usaron: 250 ng de ADN de Leishmania (Viannia) braziliensis (control positivo); 5µL de agua ultrapura colocada en el mismo lugar que el resto de los ADN usados (control negativo); 5µL de agua colocados en el lugar de preparación de la mezcla de reacción (control de reacción); 5 µl de ADN humano (control negativo) y como control de inhibición, 125 ng de ADN de Leishmania (Viannia) braziliensis fue mezclado con 2.5 µl de ADN del paciente.. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Condiciones de las PCR Teniendo en cuenta que las características operativas de las PCR a analizar habían sido previamente reportadas en la literatura, se procedió a realizar cada una de las PCR bajo las condiciones ya estandarizadas. Tanto la PCR de la proteasa de cisteíno tipo I (fragmento de pb) como la PCR de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (fragmentos de 234 y 336 pb) amplificaron productos del tamaño esperado, con las condiciones reportadas (PECET, comunicación personal; Castilho et al, 2003) (figura 2 y 3). Por otra parte, la PCR del cinetoplasto amplificó la banda esperada de 700 pb y una banda adicional de mayor peso molecular (figura 4A). Teniendo en cuenta lo anterior, y de acuerdo con la Tm calculada para los oligonucleótidos, se cambio la temperatura de hibridación de la reacción a 60 C, lo cual permitió amplificar una única banda del tamaño esperado (Figura 4B). Sin embargo, experimentos posteriores en los que se evaluó la sensibilidad de la PCR requirieron un nuevo cambio de la temperatura de hibridación (66 C), para mejorar su sensibilidad, razón por la cual se decidió tomar esta ultima temperatura para el resto de los ensayos, que fue la misma reportada por Figueroa et al, En el Anexo 1 se muestran las condiciones de programa y reacción usadas en todas las PCR. A M cpb 1000 pb 1300 pb 20

21 Figura 2. A. PCR de la proteasa de cisteíno. M: Marcador de peso molecular; Pozo 1: Leishmania sp, Pozo 2: Leishmania (Viannia) braziliensis, Pozo 3: Leishmania (Leishmania) chagasi, Pozo 4: Control negativo. B. Digestión del producto de amplificación de Leishmania (Viannia) braziliensis con la enzima de restricción KpnI. M: Marcador de peso molecular, Pozo 1: Leishmania (Viannia) braziliensis sin digerir, Pozo 2: Leishmania (Viannia) braziliensis digerida. M pb 300 pb 336 pb 234 pb Figura 3. PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. M: Marcador de peso molecular. Iniciadores ISVA-ISVC (pozos 1 a 6): Pozo 1: Leishmania (Viannia) panamensis, Pozo 2: Leishmania (Viannia) braziliensis, Pozo 3: Leishmania (Viannia) braziliensis, Pozo 4: Leishmania sp, Pozo 5: Leishmania (Leishmania) chagasi, Pozo 6: Control negativo. Iniciadores ISVB- ISVC (pozos 7 a 12): Pozo 7: Leishmania (Viannia) panamensis, Pozo 8: Leishmania (Viannia) braziliensis, Pozo 9: Leishmania (Viannia) braziliensis, Pozo 10: Leishmania sp, Pozo 11 Leishmania (Leishmania) chagasi, Pozo 12: Control negativo. M M A B 850 pb 650 pb 700 pb 759 pb 611 pb 700 pb Figura 4. PCR del cinetoplasto. A. Temperatura de hibridación a 66 C: M: Marcador de peso molecular, Pozo 1: Leishmania (Viannia) braziliensis, Pozo 2: Leishmania (Viannia) braziliensis, Pozo 3: Control negativo B. Temperatura de hibridación a 60 C: Marcador de peso molecular, Pozo 1: 250 ng de ADN de Leishmania (Viannia) braziliensis, Pozo 2: 25 ng, Pozo 3: 5 ng, Pozo 4: Control negativo. 2. Evaluación de la Sensibilidad de las pruebas de PCR Teniendo en cuenta que la evaluación de la sensibilidad de una técnica molecular como la PCR es de gran importancia para determinar su potencial como herramienta diagnóstica o investigativa (Barrio et al 2007); se determinó la sensibilidad de las tres pruebas de PCR, como primer paso, para evaluar las características operativas de las mismas y su desempeño con diferentes muestras. Es importante resaltar que fueron usadas las condiciones de reacción y programa reportadas por los autores para cada una de las PCR, pues se pretendía evaluar el desempeño de las mismas en el laboratorio de 21

22 Parasitología Molecular de la PUJ y no estandarizar nuevamente las condiciones de cada una de las pruebas. 2.1 Sensibilidad de las tres pruebas de PCR con ADN desnudo del parásito: La evaluación con ADN desnudo del parásito permitió determinar la concentración mínima de ADN detectable por los iniciadores para cada una de las PCR. Las figuras 5, 6 y 7 muestran que las PCR con blanco genómico tienen una sensibilidad de 50 pg y 25 pg, mientras que la PCR del cinetoplasto muestró una sensibilidad de 0.5 fg, (figuras 8A y 8B). M M pb 1000 pb 1300 pb Figura 5. PCR de la proteasa de cisteíno. A. Evaluación de la sensibilidad con diferentes concentraciones de ADN desnudo de L (V.) braziliensis. M: Marcador de peso molecular de peso molecular, Pozo 1: 250 ng, pozo 2: 100 ng, pozo 3: 50 ng, pozo 4: 25 ng, pozo 5: 10 ng, pozo6: 5 ng, pozo: 7: 1 ng, pozo 8: Control Negativo B. Evaluación de la sensibilidad con diferentes concentraciones en dilución base 10 de ADN desnudo de L (V.) braziliensis. M: Marcador de peso molecular. Pozo 1; 2,5 ng,: Pozo2: 0,5 ng, pozo 3: 50 pg, pozo 4:, 5 pg, pozo 5:, 0,5 pg, pozo 6: 50 fg, pozo 7: 5 fg, pozo 8: 0,5 fg, pozo 9:control negativo. M A M B 400 pb 200 pb 336 pb 400 pb 200 pb 336 pb Figura 6. PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. A. Evaluación de la sensibilidad con los iniciadores ISVA-ISVC a diferentes concentraciones de ADN desnudo de L (V.) braziliensis. M: Marcador de peso molecular, Pozo 1: 250 ng pozo 2:, 100 ng, pozo 3: 50 ng, pozo 4: 25 ng, pozo 5: 10 ng, pozo 6: 5 ng, pozo 7: 1 ng, pozo 8: Control Negativo. B. Evaluación de la sensibilidad con los iniciadores ISVA-ISVC a diferentes concentraciones de ADN desnudo de L (V.) braziliensis. M: Marcador de peso molecular, Pozo 1: 10 ng, pozo 2: 2,5 ngm pozo 3: 0,5 ng, pozo 4: 50 pg, pozo 5: 25 pg, pozo 6: 5 pg, pozo 7: 1 pg, pozo 8 0,5 pg, pozo 9: 50 fg, pozo 10: 25 fg, pozo 11: 5 fg, pozo 12: 0,5 fg, pozo 13: control negativo. 22

23 M A 400 pb 200 pb 234 pb M B 400 pb 200 pb 234 pb Figura 7. PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. Evaluación de la sensibilidad con los iniciadores ISVB-ISVC a diferentes concentraciones de ADN desnudo de L (V.) braziliensis. M: Marcador de peso molecular de peso molecular, Pozo 1: 250ng, pozo 2: 100 ng, pozo 3: 50 ng, pozo 4: 25 ng, pozo 5: 10 ng, pozo 6: 5 ng, pozo 7: 1 ng, pozo 8: Control Negativo. B. Evaluación de la sensibilidad con los iniciadores ISVB-ISVC a diferentes concentraciones en dilución base 10 de ADN desnudo de L (V.) braziliensis. M: Marcador de peso molecular, Pozo 1: 10 ng, pozo 2, 2,5 ng, pozo 3: 0,5 ng, pozo 4:, 50 pg, pozo 5: 25 pg, pozo 6: 5 pg, pozo 7: 1 pg, pozo 8:, 0,5 pg, pozo 9 : 50 fg, pozo 10: 25 fg, pozo 11: 5 fg, pozo 12: 0,5 fg, pozo 13: control negativo. M M A B 759 pb 611 pb A 700 pb 759 pb 611 pb 700 pb Figura 8. PCR del cinetoplasto. A. Evaluación de la sensibilidad con diferentes concentraciones en dilución base 10 de ADN desnudo de L (V.) braziliensis. M: Marcador de peso molecular, pozo 1: 150 ng, pozo 2: 25 ng, pozo 3: 2,5 ng pozo 4: 0,5 ng, pozo 5: 50 pg, pozo 6:5 pg, pozo 7: 0,5 pg, pozo 8: 50 fg, pozo 9: 5 fg, pozo 10: 0,5 fg, pozo 11: Control negativo y pozo 12: Control de reacción. B. Réplica de evaluación de la sensibilidad con diferentes concentraciones en dilución base 10 de ADN desnudo de L (V.) braziliensis. M: Marcador de peso molecular, pozo 1: 50 ng, pozo 2: 25 ng, pozo 3: 2,5 ng, pozo 4: 0,5 ng, pozo 5: 50 pg, pozo 6: 5 pg, pozo 7: 0,5 pg, pozo 8: 50 fg, pozo 9: 5 fg,, pozo 10: 0,5 fg pozo 11: Control negativo. Teniendo en cuenta que en la PCR del cinetoplasto se observó ausencia de amplificación para algunas de las concentraciones de ADN evaluadas (figuras 8A y 8B), se realizaron varias replicas de la prueba de sensibilidad, encontrando en todos los ensayos falta de reproducibilidad con las diferentes concentraciones de ADN desnudo que es capaz de 23

24 amplificar la PCR (resultados no mostrados). Esta ausencia de amplificación podría estar relacionada con la estructura de los minicìrculos del cinetoplasto, blanco de la PCR, puesto que estos se caracterizan por ser moléculas de ADN concatenado y circular (Bañuls et al, 2007) que podrían dificultar el acceso e hibridación de los iniciadoresla diferencia existente entre los blancos genómicos (de bajo número de copias), respecto al cinetoplasto (del que se reportan hasta copias por parásito) (Jhingran et al, 2008; Lambson et al 2000), podría explicar los resultados encontrados, respecto a las diferencias de sensibilidad, entre las tres pruebas de PCR. Sin embargo, los resultados obtenidos para la PCR de la glucosa 6 fosfato deshidrogenesa no concuerdan con los reportados para ADN desnudo con los iniciadores ISVA-ISVC, puesto que Castilho et al, 2003 reportan amplificación con hasta 2 pg de ADN, es decir 10 veces menos lo amplificado por nosotros. Dicha variación podría estar relacionada precisamente con las condiciones propias del montaje realizado, es decir la influencia de reactivos, equipos, calidad de ADN, entre otros. Por otra parte, para la PCR del cinetoplasto los resultados coinciden con los reportados por Vergel et al, 2005 quienes reportan una sensibilidad de 0.3 fg para los iniciadores LV y B Sensibilidad de las tres pruebas de PCR con formas promastigotas del parásito En cultivo Un primer ensayo realizado para las tres pruebas de PCR, con las formas del parásito en cultivo extraídas por el método fenol cloroformo, según lo reportado por Sambrook et al, 2001, mostró resultados negativos. Con lo anterior, el ADN obtenido se cuantifico mediante espectrofotometría y la relación de ADN en la muestra respecto a la cantidad de proteínas presentes se calculó con la relación de la absorbancia obtenida a 260/280 nm, dicha medición mostró alta concentración de proteínas en la muestra, que podrían estar inhibiendo las reacciones de PCR y/o sobreestimando la cantidad de ADN en la muestra, por lo tanto, se modificó el método de extracción inicial a tres limpiezas con fenolcloroformo y dos limpiezas con cloroformo. Los resultados de pureza mejoraron considerablemente, por lo cual este método se siguió utilizando para las extracciones del ADN a partir de formas en cultivo del parásito. Las figuras 9, 10 y 11 muestran los resultados obtenidos para las tres PCR luego de modificar el método de extracción del ADN. Los resultados de sensibilidad con formas del parásito fueron consecuentes con la sensibilidad observada con ADN desnudo, mostrando igualmente que las PCR de proteasa de cisteíno tipo I y GPDH (amplificaron hasta formas del parásito) (figuras 9 y 10) fueron menos sensibles que la PCR del cinetoplasto que amplificó hasta 0,1 forma del parásito (figura11).. 24

25 M pb 1150 pb 1300 pb Figura9. PCR de la proteasa de cisteíno. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis en buffer PBS. M: Marcador de peso molecular, Pozo 1: formas, Pozo 2: formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: 100 formas, Pozo 5: 10 formas, Pozo 6: 1 forma, Pozo 7: 0.1 forma, Pozo 8: Control positivo (50 ng ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 9: Control negativo. M M A B 400 pb 200 pb 336 pb 400 pb 200 pb 234 pb Figura10. PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. A. Evaluación de la sensibilidad con los iniciadores ISVA-ISVC con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis en buffer PBS. M: Marcador de peso molecular. Pozo 1: formas, Pozo 2: formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: formas, Pozo 5: formas, Pozo 6: 100 formas, Pozo 7: 10 formas, Pozo 8: 1 forma, pozo 9: 0.1 forma, Pozo 10: Control positivo (250 ng ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 11: Control negativo. B. Evaluación de la sensibilidad con los iniciadores ISVB-ISVC con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis en buffer PBS. M: Marcador de peso molecular. Pozo 1: formas, Pozo 2: formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: formas, Pozo 5: formas, Pozo 6: 100 formas, Pozo 7: 10 formas, Pozo 8: 1 forma, Pozo 9: 0.1 forma, Pozo 10: Control positivo (250 ng ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 11: Control negativo. M pb 611 pb 700 pb Figura11. PCR del cinetoplasto. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis en buffer PBS. M: Marcador de peso molecular. Pozo 1: formas, Pozo 2: formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: formas, Pozo 5: formas, Pozo 6: 100 formas, Pozo 7: 10 formas, Pozo 8: 1 forma, Pozo 9: 0.1 forma, Pozo 10: Control positivo (250 ng ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 11: Control negativo. 25

26 Los resultados para la PCR del cinetoplasto se asemejan a los reportados por Figueroa et al, 2009 en los que la pareja de iniciadores mostró una sensibilidad de hasta 0.2 formas parasitarias. Es importante recalcar que para la PCR del cinetoplasto, la cual es más sensible, se observó que la intensidad de las bandas no refleja la disminución en el número de formas del parásito (a partir de formas) (figura 11), lo que podría explicarse por pérdida de ADN, durante los múltiples pasos de limpieza de la extracción fenólica, que particularmente se refleja cuando la cantidad de formas es muy baja, lo cual concuerda con lo reportado por Morata et al en 1998, cuyos resultados indican que un aumento en las limpiezas de ADN disminuyen la concentración de ADN obtenido, pero en efecto aumentan la pureza del mismo; otra posible causa sería la ya mencionada estructura de los minicírculos y su posible efecto sobre la PCR considerando que el resultado mostrado es el mejor de varias réplicas Mezcladas con sangre de canino sin preservar y preservada con clorhidrato de guanidina: Teniendo en cuenta que la leishmaniasis es una enfermedad de alto impacto epidemiológico, por su presencia en más de 88 países, en 4 continentes (INS 2007) y que genera afecciones que pueden causar incluso la muerte (Bañuls et al, 2007), es importante desarrollar técnicas sensibles y rápidas que se puedan utilizar con muestras biológicas que contengan tejido del hospedero, sin perder efectividad y sensibilidad en la detección del parásito. Asumiendo que en las muestras habrá presencia de fluidos biológicos como sangre, linfa, médula ósea y tejido mucoso del hospedero, entre otros (Figueroa et al 2009; Reithinger et al, 2000; Reale et al, 1999), lo cual aumenta la probabilidad de que la detección del parásito no pueda ser llevada a cabo con la misma sensibilidad por la presencia de proteínas, derivados de grupo hemo, ADN heterólogo y demás posibles componentes inhibitorios de la PCR (Al-Soud y Radström, 2001; Morata et al, 1998), se realizó una prueba de sensibilidad con diferente número de formas del parásito mezcladas con 100 l de sangre de canino y 250 l de sangre humana. Los resultados con la mezcla de sangre de canino para las PCR de la proteasa de cisteíno tipo I y glucosa 6 fosfato deshidrogenasa con los iniciadores ISVB/ISVC específicos para L. (V) braziliensis, (figuras 12 y 13B, respectivamente), mostraron una sensibilidad de hasta formas detectadas, mientras que para la PCR GPDH con los iniciadores ISVA/ISVC, específicos de género, la PCR mostró una sensibilidad de hasta formas (figura 13A). Adicionalmente en la PCR de GPDH se observó la presencia de dímeros de iniciadores en alta concentración. Es importante resaltar, que en la PCR de la GPDH (figura 13B) se observó una banda de amplificación de aproximadamente 450 pb, en las mezclas y en el control con ADN de canino, lo cual podría deberse a que los iniciadores anillen en su genoma. 26

27 Por otra parte, la sensibilidad observada para la PCR del cinetoplasto de la mezcla con sangre de canino, fue de hasta 1 forma, sin embargo para 100 y 10 formas no se observó amplificación (figura 14). M pb 1150 pb 1300 pb Figura 12. PCR de la proteasa de cisteíno. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de canino. M: Marcador de peso molecular. Pozo 1: formas, Pozo formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: 100 formas, Pozo 5: 10 formas, Pozo 6: 1 forma, Pozo 7: 0.1 forma, Pozo 8: Control positivo (250 ng ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 9: ADN de canino, Pozo 10: Control negativo. A M B M pb 273 pb 336 pb 579 pb 273 pb 234 pb Figura 13. PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de canino. A. Iniciadores ISVA-ISVC: M: Marcador de peso molecular. Pozo 1: formas, Pozo 2: formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: 100 formas, Pozo 5: 10 formas, Pozo 6:1 forma, Pozo 7: 0.1 forma, Pozo 8: Control positivo (250 ng de ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 9: ADN de canino, Pozo 10: Control negativo. B. Iniciadores ISVB-ISVC: M: Marcador de peso molecular. Pozo 1: formas, Pozo 2: formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: 100 formas, Pozo 5: 10 formas, Pozo 6:1 forma, Pozo 7: 0.1 forma, Pozo 8: Control positivo (250 ng de ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 9: ADN de canino, Pozo 10: Control negativo M pb 611 pb 700 pb. Figura 14. PCR del cinetoplasto. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de canino. M: Marcador de peso molecular, Pozo 1: formas, Pozo 2: formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: 100 formas, Pozo 5: 10 formas, Pozo 6: 1 forma, Pozo 7: 0.1 forma, Pozo 8: ADN de canino, Pozo 9: Control positivo (250 ng de ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 10: Control negativo. 27

28 De manera sorprendente, las PCR de blanco genómico mostraron una mayor sensibilidad cuando se encontraban en presencia de un ADN heterólogo (ADN de canino), lo cual puede ser explicado porque la extracción de ADN de la mezcla requiere digestión previa con proteinasa K, generando una muestra más limpia, respecto a la contaminación con proteínas. Adicionalmente en la extracción fenólica se realizó un número menor de limpiezas: fenol-cloroformo-alcohol isoamilico (2 veces), clorofomo-alcohol isoamílico (1 vez), a diferencia de la extracción de las formas de cultivo, lo cual generó una menor pérdida de ADN en el proceso de extracción y por tanto una mayor sensibilidad. Para la PCR del cinetoplasto, resultados similares a los obtenidos por nosotros fueron previamente reportados por Reithinger et al 2000, quienes encontraron una sensibilidad de 1 parásito en 400 µl de sangre de canino, para una PCR especifica del cinetoplasto, en muestras sin preservar y preservadas con clorhidrato de guanidina. A diferencia de lo realizado por nosotros, Reithinger y colaboradores obtuvieron el ADN a partir de la porción de glóbulos blancos o buffy coat de la muestra y no de sangre periférica total. Cogswell et al, 1996 reportaron que el principal inhibidor de la PCR es el ADN heterólogo del hospedero en concentraciones mayores a 500 ng, pese a que no se cuantificó el ADN obtenido a partir de los 100 l de la sangre del canino usada en la mezcla, los resultados obtenidos confirman el efecto inhibitorio del ADN heterólogo del canino en las PCR, en particular para la PCR del cinetoplasto, en la que se observó una clara disminución en la sensibilidad, con una amplificación de hasta 1 forma (pozo 6, figura 14), respecto a 0,1 formas amplificadas cuando no hay presencia de ADN heterólogo. Así mismo, y considerando que la colección de las muestras en campo son difíciles de almacenar y conservar, se ha reportado que el clorhidrato de guanidina ayuda a su preservación y fácil transporte (Dorn et al, 1997), por tanto, se realizó la prueba de sensibilidad para la detección de ADN de diferente número de formas parasitarias mezcladas con sangre de canino y un volumen de clorhidrato de guanidina. Los resultados de este ensayo, para las tres pruebas de PCR evaluadas no mostraron banda de amplificación en ninguna de las diluciones evaluadas (figuras 15, 16 y 17). M pb 1150 pb 1300 pb 28

29 Figura 15. PCR de la proteasa de cisteíno. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de canino y preservada con clorhidrato de guanidina. M: Marcador de peso molecular, Pozo 1: formas, Pozo 2: formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: 100 formas, Pozo 5: 10 formas, Pozo 6: 1 forma, Pozo 7: 0.1 forma, Pozo 8: ADN de canino, Pozo 9: Control positivo (250 ng de ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 10: Control negativo. A M pb 273 pb 336 pb M B 579 pb 273 pb 234 pb Figura 16. PCR de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa. A. Evaluación de la sensibilidad con los iniciadores ISVA- ISVC con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de canino y preservada con clorhidrato de guanidina. M: Marcador de peso molecular, Pozo 1: formas, Pozo 2: formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: 100 formas, Pozo 5: 10 formas, Pozo 6: 1 forma, Pozo 7: 0.1 forma, Pozo 8: ADN de canino, Pozo 9: Control positivo (250 ng de ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 10: Control negativo. B. Evaluación de la sensibilidad con los iniciadores ISVB-ISVC con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de canino y preservada con clorhidrato de guanidina. M: Marcador de peso molecular, Pozo 1: formas, Pozo 2: formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: 100 formas, Pozo 5: 10 formas, Pozo 6: 1 forma, Pozo 7: 0.1 forma, Pozo 8: ADN de canino, Pozo 9: Control positivo (250 ng de ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 10: Control negativo. M pb 611 pb 700 pb Figura 17. PCR del cinetoplasto. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre de canino y preservada con clorhidrato de guanidina. M: Marcador de peso molecular, Pozo 1: formas, Pozo 2: formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: 100 formas, Pozo 5: 10 formas, Pozo 6: 1 forma, Pozo 7: 0.1 forma, Pozo 8: ADN de canino, Pozo 9: Control positivo (250 ng de ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 10: Control negativo. A pesar de que algunos autores recomiendan el uso de clorhidrato de guanidina para ayudar en la preservación del ADN en la muestra (Dorn et al, 1997), nuestros resultados pueden ser producto de un efecto inhibitorio de la guanidina en la PCR, por su carácter denaturante de las proteínas (Dorn et al, 1997), particularmente sobre la Taq polimerasa; sin embargo esto no puede asegurarse puesto que por limitación de tiempo y reactivos no se realizaron pruebas de inhibición. 29

30 Así mismo y teniendo en cuenta que la extracción del ADN preservado con clorhidrato de guanidina involucra un paso de ebullición, que lleva a la coagulación de la mezcla en su totalidad, se presume pudo haber dificultado la remoción de proteínas de la muestra o favorecer la pérdida de ADN Mezcladas con sangre humana sin preservar y preservada con clorhidrato de guanidina: De la misma forma, se realizaron mezclas de un número diferente de formas del parásito con 250 l de sangre humana. Para la PCR de la proteasa de cisteíno tipo I no se observó amplificación con ninguna de las diluciones analizadas (figura 18), mientras que para la PCR GPDH se observó una amplificación con hasta formas, (figura 19A) y de hasta 1 forma para la PCR del cinetoplasto (figura 20), sin embargo para la PCR con blanco en los mini-círculos nuevamente se observó ausencia de amplificación de algunas de las concentraciones evaluadas, lo cual puede ser atribuido su estructura. M pb 1300 pb 1150 pb Figura 18. PCR de la proteasa de cisteíno. Evaluación de la sensibilidad con ADN extraído de formas de L (V.) braziliensis mezcladas con sangre humana en dilución 1/10. M: Marcador de peso molecular, Pozo 1: formas, Pozo 2: formas, Pozo 3: formas, Pozo 4: 100 formas, Pozo 5: 10 formas, Pozo 6: 1 forma, Pozo 7: 0.1 forma, Pozo 8: Control positivo (250 ng de ADN desnudo L (V.) braziliensis), Pozo 9: ADN humano, Pozo 10: Control negativo. M A 579 pb 273 pb 336 pb M B 579 pb 273 pb 234 pb 30

DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh por PCR

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