DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PPA MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL REV OBJETO. 2. ALCANCE.

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1 Página 1 de 7 CONTENIDO CENTRO DE INVESTIGACION EN SANIDAD ANIMAL (CISA-INIA) Labratri de Referencia de la UE de PPA (EURL-ASF) Centr de Investigación en Sanidad Animal CISA-INIA, Valdelms 28130, Madrid, Spain. Cntact Dr. Carmina Gallard Virginia Pelay eurl.asf@inia.es 1. OBJETO. 2. ALCANCE. 3. REFERENCIAS DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE. 4. GENERALIDADES. 5. REALIZACIÓN MATERIALES Y REACTIVOS. / PROCEDIMENTO NORMALIZADO DE TRABAJO (PNT): DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL 5.2. MÉTODOS ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS PUNTOS CRÍTICOS 5.5. MEDIDAS DE SEGURIDAD.

2 Página 2 de 7 1. OBJETO. El bjet del presente prcedimient es describir el métd a seguir para la detección específica de ADN del virus de la peste prcina africana (VPPA) en material clínic mediante la técnica de la reacción en cadena de la plimerasa (PCR) en tiemp real. Técnica de referencia de la OIE (Manual de las Pruebas de Diagnóstic y de las Vacunas para ls Animales Terrestres: Peste Prcina Africana, OIE, capítul 2.8.1) para la detección del genma viral de la PPA. 2. ALCANCE. Este prcedimient es de aplicación al ácid nucleic extraíd siguiend el prcedimient descrit en el PNT/CISA/PPA/EXTRACCIÓN ADN/1 - Extracción del ADN del virus de la peste prcina africana para su detección mediante reacción en cadena de la plimerasa - PCR- - en ls siguientes tips de muestra de rigen prcin y en hmgeneizads de garrapatas del géner Ornithdrs. 3. REFERENCIAS DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN. 1. AFRICAN SWINE FEVER. Manual f Diagnstic Tests and Vaccines fr Terrestrial Animals (mammals, birds and bees). CHAPTER OIE, D.P. King, S.M. Reid, G.H. Hutchings, S.S. Griersn, P.J. Wilkinsn, L.K. Dixn, A.D.S. Basts, T.W. Drew «Develpment f a TaqMan PCR assay with internal amplificatin cntrl fr the detectin f African Swine Fever Virus. J. Virl. Methds, 107: PPA REVISIONES: 1. Arias, M., Sánchez-Vizcaín, J.M. (2012). African swine fever. In: Zimmerman, J., Karriker, L.A., Ramirez, A., Schwartz, K.J, Stevensn, G.W. (Eds), Diseases f swine, 10th Editin. Jhn Wiley and Sns, United States f America, pp Arias, M.; Sánchez, C.; Gnzález, M.A.; Carrasc, L. y Sánchez-Vizcaín, J.M. (2002). Peste prcina Africana In Curs digital de enfermedades infeccisas prcinas. On line, July, [ 3. Fd and Agriculture Organizatin f the United Natins (FAO). RECOGNIZING AFRICAN SWINE FEVER. A FIELD MANUAL Editin. [ 4. Oura CA, Edwards L, Batten CA. Virlgical diagnsis f African swine fever- Cmparative study f available tests. Virus Res Nv 3. di:pii: S (12)00411-X /j.viruses [Epub ahead f print] 3.2. DOCUMENTOS (PNTs) A UTILIZAR CONJUNTAMENTE. PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA PESTE PORCINA AFRICANA (PNT/CISA/PPA/MUESTRAS/1). EXTRACCIÓN DEL ADN DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA PARA SU DETECCIÓN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) (PNT/CISA/PPA/DNA EXTRACCIÓN/1) 4. GENERALIDADES ABREVIATURAS. ADN: ácid desxirribnucleic. E+: Cntrl psitiv de extracción. E-: Cntrl negativ de extracción. R+: Cntrl psitiv de reacción. R-: Cntrl negativ de reacción. PCR: Reacción en cadena de la plimerasa. PPA: Peste prcina africana. VPPA: Virus de la peste prcina africana.

3 Página 3 de PRINCIPIO. La técnica de la reacción en cadena de la plimerasa (PCR) permite la detección específica del ADN del VPPA mediante la amplificación enzimática de un pequeñ fragment del genma viral delimitad pr una pareja de primers cebadres específics. Requiere de la extracción previa del ADN del VPPA desde el material de rigen a analizar, que será el mlde de la reacción enzimática. En la técnica de PCR en tiemp real, la aparición de prduct amplificad es cntinuamente mnitrizada en equips especiales gracias a la incrpración en la mezcla de reacción de flurófrs que emitirán flurescencia de manera prprcinal a la acumulación del amplicón. Determinand la intensidad de la flurescencia en cada cicl de amplificación, se btendrá una curva sigmidal que representa la aparición de prduct amplificad a l larg de la PCR. Mediante la técnica de PCR se pueden analizar distints tips de muestras, cm sbrenadantes de cultiv celular, sangre recgida en EDTA, suer y hmgeneizads de garrapatas tejids. Es particularmente útil para la detección del ADN del VPPA en muestras de tejid prcin en mal estad de cnservación que n sn adecuadas para técnicas de aislamient viral detección de antígen, cuand el virus ha pdid ser inactivad antes de la llegada de las muestras al labratri. El métd descrit de PCR en tiemp real para VPPA emplea una pareja de primers diseñada en una región altamente cnservada del genma viral, VP72, que asegura la detección de un ampli rang de aislads de VPPA. Ls primers amplifican un fragment de ADN de 250 pb, entre las psicines de nucleótids 2041 y 2290 de la secuencia del gen cmplet VP72 de la cepa españla de referencia BA71V (nº de acces a GenBank M34142). La snda utilizada para la detección del prduct amplificad es una snda TaqMan situada entre las psicines de ambs primers. La snda está marcada en su extrem 5 cn una mlécula emisra de flurescencia (6- carbxifluresceína, FAM) y en el 3 cn una mlécula apantalladra de flurescencia (6-carbxitetrametilrdamina, TAMRA). La PCR es una técnica rápida, que puede cmpletarse en pcas hras, y de elevada sensibilidad, permitiend detectar la presencia de virus inclus antes de la aparición de ls primers signs clínics en ls animales infectads. Es altamente sensible, siend su límite de detección inferir a una partícula viral infectiva. Es la técnica de elección en cass hiperaguds, aguds y subaguds de la PPA. Ls cerds recuperads de infeccines agudas crónicas, generalmente exhiben una viremia durante varias semanas, haciend de la PCR también una herramienta muy útil para la detección del VPPA en cerds infectads cn cepas de virulencia baja mderada. 5. REALIZACIÓN MATERIALES Y REACTIVOS. MATERIALES Cngeladr de <-10ºC. Cngeladr -70ºC. Gradillas (racks) refrigerantes para tubs de mini centrífuga de 1,5 y tubs de reaccines de PCR 0,2 ml de 96 pcills. Guantes de látex de nitril. Micrpipetas autmáticas mncanal de 1-10 µl. Micrpipetas autmáticas mncanal de 2-20 µl. Micrpipetas autmáticas mncanal de µl. Micrpipetas autmáticas mncanal de µl. Minicentrífuga de tubs de PCR. Nevera de 4±3ºC. Sistema de detección PCR a tiemp real cn un blque termcicladr para 96 reaccines (96 well frmat thermcycler reactin blck), incluyend sftware MxPr-Mx3005P v.4.10 de características similares. Puntas de micrpipeta de rangs y µl, estériles. Puntas de micrpipeta cn filtrs resistentes a aersles de rangs 1-10, 2-20, y µl, estériles. Tubs tip eppendrf estériles, apts para micr centrífuga, de vlúmenes 0,2 ml, 0,5 ml, 1,5 ml y 2 ml. Tubs tip eppendrf ámbar estériles de 0,5 ml Vórtex.

4 Página 4 de 7 REACTIVOS. QuantiFast Prbe PCR kit, dispnible cmercialmente en Qiagen (Ref , 100 reaccines; ref , 500 reaccines). Cnservar a <-10ºC. TaqMan snda cncentración 10 pml/µl: 5 -FAM- CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-3. Cnservar <-10ºC en alícutas, en scuridad. Fecha de caducidad: 1 añ Primers cncentración 20 pml/µl Cnservar <-10ºC en alícutas. Fecha de caducidad: 1 añ - primer King-s 5 -CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3 (sentid); - primer King-a 5 -GATACCACAAGATCRGCCGT-3 (antisentid). H 2 O estéril libre de nucleasas, grad PCR. Cntrles de referencia: ls siguientes cntrles deben incluirse en cada prces de amplificación MÉTODOS. E+: Cntrl psitiv de extracción btenid durante el prces de extracción del ADN del VPPA. Cnservar a <-10ºC. Fecha de caducidad: 6 meses. E-: Cntrl negativ de extracción btenid durante el prces de extracción del ADN del VPPA. R+: Cntrl psitiv de reacción. ADN btenid de muestra psitiva de PPA. Se recmienda preparar un cntrl psitiv en el límite de detección de la técnica Cnservar a <-10ºC. Cnservar a <-10ºC. Fecha de caducidad: 6 meses. R-: Cntrl negativ de reacción: agua destilada incluida en el pas de la amplificación para descartar cntaminacines. Aspects generales: El ensay amplifica un fragment de ADN de 250pb dentr de la región VP72 del genma de VPPA. La PCR se realiza en un vlumen final de 20 µl. La snda TaqMan debe mantenerse siempre prtegida de la luz. Tras la preparación de la mezcla de reacción, se añadirán 2 µl de ADN extraíd a cada tub de reacción. Preparación de la mezcla de reacción: En un tub de micr-centrífuga de 1,5 ml estéril, se preparará la mezcla de PCR, según se describe a cntinuación, para el númer ttal de muestras a analizar (incluyend ls cntrles psitivs y negativs de extracción y reacción) más, al mens, una muestra adicinal (para cmpensar psibles errres de pipete). REACTIVOS DE LA MEZCLA DE REACCIÓN 1x VOLUMEN (reacción 20µl) CONCENTRACIÓN FINAL 1 H 2 O 6,7µl 2 Master mix 2X 10 µl 1X 3 Primer King-s 20 µm 0,4µl 0,4 µm 4 Primer King-a 20 µm 0,4µl 0,4 µm 5 TaqMan snda 10 µm 0,5µl 0,25 µm Master mix vlume 18 µl - Añadir 18 µl de la mezcla de la reacción de PCR a cada tub de PCR de 0,2 ml. - Añadir 2µl del ADN extraíd a cada tub de PCR de 0,2 ml. - Incluir ls cntrles de reacción R+ y R-. Después de añadir la muestra, cerrar bien ls tubs y dar un glpe de centrífuga para bajar la mezcla de PCR. Clcar ls tubs en un termcicladr autmatizad de tiemp real y crrer el prgrama de incubación detallad a cntinuación. CICLO DE PCR. DESCRIPCIÓN Temperatura Tiemp Nº cicls Activación de la plimerasa 95ºC 3 min 1x Desnaturalización ADN 95ºC 10 sec 45 x Anillamient/elngación 58ºC 30 sec Prgramar la lectura de flurescencia en el canal FAM al final de cada cicl.

5 Página 5 de ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS. El punt en el cual la flurescencia pasa de niveles n significativs (indistinguibles del fnd) a niveles claramente detectables, se denmina cicl umbral (Ct: cycle threshld), y éste será el valr umbral de intensidad de flurescencia a partir del cual una muestra será cnsiderada psitiva. El cicl umbral es inversamente prprcinal a la cantidad de ADN mlde presente en la mezcla de reacción al inici de la misma, es decir, en la muestra analizada. El valr de Ct es determinad autmáticamente pr el sftware del termcicladr emplead. En una muestra psitiva se btendrá una curva sigmidal representand el nº de cicls frente al valr de flurescencia emitid, dnde el valr de Ct será menr de 40. Una muestra negativa mantendrá su perfil de flurescencia pr debaj del valr umbral y el equip n reprtará ningún valr de Ct (ver figura). Pr tant, una muestra negativa mstrará un valr de Ct 40. El prcedimient se cnsiderará válid si ls cntrles psitivs de extracción y reacción muestran uns valres de Ct de 32±4, y ls cntrles negativs de extracción y reacción n dan valr de Ct ( 40) PUNTOS CRÍTICOS Siend una de las ventajas de la técnica de PCR su elevada sensibilidad, el punt crític durante td el prces de análisis es el riesg de cntaminación de las muestras y, pr tant, ls psibles falss psitivs que en este cas se btendrían. La cntaminación puede deberse al prpi VPPA presente en las muestras que puedan ser psitivas en ls cntrles psitivs empleads en el prces de extracción, al ADN del VPPA resultante de la amplificación y manipulad durante el análisis de ls amplicnes de una PCR anterir mediante la electrfresis en gel de agarsa. Pr ell, es imprescindible seguir y cumplir unas estrictas nrmas de trabaj para minimizar el riesg de cntaminación intrínsec a la técnica de PCR: Tds ls pass que implican el análisis de muestras pr PCR se realizarán en espacis diferenciads, cn equipamient y material específics para cada un: preparación de muestras, extracción de ADN, mntaje de mezcla de PCR, análisis pr electrfresis de ls prducts de PCR. Trabajar siempre cn guantes de látex nitril limpis en el labratri de PCR. Cada vez que el técnic que esté realizand el análisis acceda a una zna de PCR diferente, deberá cambiarse ls guantes desechand ls que tenía puests. El material será de us exclusiv para el pas del prcedimient para el que esté destinad pr su situación/identificación. Utilizar una punta de pipeta diferente cada vez que se pipetee en un tub cnteniend alguna muestra ADN MEDIDAS DE SEGURIDAD. Leer y seguir cuidadsamente el prtcl. Cnservar ls reactivs a la temperatura indicada antes de su utilización. N mezclar reactivs ni instruccines de diferentes kits. Evitar cualquier cntaminación de ls reactivs. N utilizar ls reactivs una vez superada la fecha de caducidad. N cmer, beber ni fumar en el labratri. N pipetear ls reactivs cn la bca. Utilizar siempre guantes de látex nitril.

6 Página 6 de 7 Las sndas utilizadas para la detección del prduct amplificad sn altamente sensibles a la luz, pr l que deben manipularse únicamente en el mment de us y mantenerse siempre prtegidas de la luz (utilizar tubs clr ámbar para cnservar el stck de sndas y preparar la mezcla de reacción).

7 CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL DETECCIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DE LA PPA MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA Página 7 de 7 REGISTRO DE ENTRADA CISA: FECHA DE ANÁLISIS: TIPO DE MUESTRAS: TÉCNICO(S) EXTRACCIÓN: LOTE KIT EXTRACCIÓN: LOTE + E: TÉCNICO(S) PCR: LOTE R+: PROGRAMA REALIZADO: Plantilla de resultads CISA/PPA/PCR/2 ORDEN PIPETEO REACTIVOS PCR MIX 1x VOLUMEN (reacción 20 µl) 1 H 2 O 6,7 µl Nx CONCENTRACIÓN FINAL 2 Master mix 2x 10 µl 1x 3 Primer PPA-King-s 20 µm 0,4 µl 0,4 µm 4 Primer PPA-King-a 20 µm 0,4 µl 0,4 µm 5 Snda TaqMan 10 µm 0,5 µl 0,25 µm Vlumen PCR mix 18 µl 6 Adición de 2 µl de ADN mlde (muestras y cntrles de reacción) IDENTIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS EN TUBOS/PLACA OBSERVACIONES: