INFECCION POR HHV6 EN TRANSPLANTADOS RENALES: UNA CONTROVERSIA EN EL DIAGNOSTICO. Julieta Giménez Carolina Carrizo

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1 INFECCION POR HHV6 EN TRANSPLANTADOS RENALES: UNA CONTROVERSIA EN EL DIAGNOSTICO Julieta Giménez Carolina Carrizo

2 Infection with Herpesvirus 6 after Kidney-Pancreas Transplant Hombre, 29 añosa Enfermedad renal terminal por complicación n de DBT tipo I Positivo CMV HSV VZV EBV HHV-6 Introducción Benito N. et al, American Journal of transplantation 2004; 4: Serología pre-tx Negativo Treponema palidum Toxoplasma gondii HCV HBV HIV Benito et. al,.am J.. Transp 2004; 4:

3 Caso Clínico El procedimiento quirúrgico rgico se realizó sin inconvenientes Profilaxis: Trimetoprima sulfametoxasol Ganciclovir Alta 13 días d post-trasplante trasplante Crea 1.3 mg/dl y Glu: : 73 mg/dl Benito et. al,.am J.. Transp 2004; 4:

4 Caso Clínico GB (cel/mm 3 ) GB Hb (mg Hb mg/dl) Plq (/mm 3 ) AST (UI/ml) ALT (UI/ml) FAL (UI/ml) GGT (UI/ml) GGT Cultivos Otros Días post-tx M sangre y orina pp65 (-)( Biopsia Hp LCR HHV-6 por PCR Progresión a normalizar las Ez Sangre Serologías U E R T E Benito et. al,.am J.. Transp 2004; 4:

5 HHV-6 Generalidades Familia Herpesviridae, subgrupo Betaherpesvirinae DNA lineal doble cadena ( Kb) Nucleocápside icosahédrica ( nm) Envoltura glicoproteica ica Variantes A y B (90% de homología) De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005,

6 HHV-6 Generalidades CD46: en todas las células nucleadas Tropismo celular: Cerebro Glándulas salivales Hígado Endotelio LATENCIA Monocitos Células progenitoras de MO De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan ,

7 HHV-6 Generalidades Infección n primaria Niñez (6 meses 1 año) a 20% Sexta enfermedad Reinfección o reactivación n en huesped inmunocomprometido Trasplantados Organo Sólidos (TOS) Incidencia 32 % Trasplantados de Médula M Osea (TMO) Incidencia 48 % Reinfección o reactivación n en huesped inmunocompetente De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan ,

8 Pruebas Diagnósticas Serología Aislamiento PCR Antigenemia Inmunohistoquímica mica (IHC) IFI ELISA Cultivo convencional Shell vial (cultivo rápido) r Cualitativa (linfocitos o plasma) Semicuantitativa Cuantitativa Cuantitativa en tiempo real Detección n de Ag específicos en células c mononucleares de sangre periférica rica p101 (HHV-6B) gp82 (HHV-6A) Benito N. et al; Enferm Infecc Microbiol Clin 2003;21(8):

9 Serología Permite la detección n de infección n latente o seroprevalencia Población n adulta > 90% seropositivos Infección n primaria: 4 veces IgG IFI ó 1.6 veces IgG EIA Dockrell et al,, Transplantation 1999 Lautenschlager et al, Clin Infect Dis 1998 Saxinger et al,, J Virol Methods 1988 La detección n de IgM es más m s controversial ya que puede producirse tanto en infecciones primarias como en reactivaciones Dockrell et al,, Transplantation 1999 Desventajas: NO DISTINGUE ENTRE VARIANTES NO ES DE UTILIDAD EN PACIENTES INMUNOSUPRIMIDOS

10 Aislamiento viral Cultivo convencional: Cocultivo de linfocitos del paciente con linfocitos de sangre de cordón n umbilical activados y tratados con IL-2 Técnica laboriosa (5 21 días) d Singh et al,, Ann Inter Med 1996 Shell Vial: Cultivo primario en fibroblastos humanos que permite la detección n de antígeno viral a las hs. Singh et al,, Ann Inter Med 1996 Singh et al,, Transplantation 1997

11 PCR Técnica rápidar Elevada Sensibilidad PCR cualitativa Valor limitado en la correlación n clínica y la infección n activa Secchiero et al,, J Infect Dis 1995 Singh et al,, Ann Inter Med 1996 Dockrell et al,, Rev Med Virol 2001 PCR cuantitativa, en tiempo real y multiplex PCR Permite detectar infección n activa y distinguir entre variantes Secchiero et al,, J Clin Microbiol 1995 Kidd et al,, J Virol Methods 1998 Emery et al, Clin Infect Dis 2001 Gautheret Dejean et al,, J Virol Methods 2002

12 Resumen Célula no infectada Aislamiento viral Reactivación Latencia - Latencia Expansión Infección n Activa + Célula infectada productiva Respuesta a la terapia + Latencia - PCR cualitativa plasma PCR cualitativa leucocitos +/ /- PCR cuantitativa leucocitos +/ /-

13 Método PCR PCR PCR PCR PCR PCR PCR,IHC qpcr qpcr Cultivo Cultivo Cultivo Cultivo Frecuencia de HHV-6 6 post Tx de MO Muestra GB y BAL GB y plasma GB GB y plasma GB GB, orina y saliva GB y piel GB y LCR GB GB GB GB GB n Inf. activa (%) ND 60 ND 78 ND 38 ND Estudio Takatsuka et al (2003) Imbert-Marcille et al (2000) Maeda et al (1999) Chan et al (1997) Wang et al (1996) Wilborn et al (1994) Appleton et al (1995) Ljungman et al (2000) Cone et al (1999) Yoshikawa et al (2002) Yoshikawa et al (2001) Kadakia et al (1996) Yoshikawa et al (1991) ND: no determinado De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005,

14 Frecuencia de HHV-6 6 post Tx renales y renopancreáticos Método PCR Muestra GB n 107 Inf. activa (%) ND Estudio Pacsa et al (2003) qpcr GB Kidd et al (2000) PCR, Serología Orina y suero Ratnamohan et al (1998) Cultivo, Serología GB Herbein et al (1996) Cultivo, Serología GB Yoshikawa et al (1992) ND: no determinado De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005,

15 TEST DIAGNÓSTICO DE REFERENCIA para detectar infección n por HHV-6 Volin et al, British Journal of Hematology,, 2004

16 UN MÉTODO M DE CULTIVO PARA DIAGNÓSTICO DE HHV-6

17 Objetivos Realizar Shell vial para detectar HHV-6 6 en pacientes trasplantados Procesar las muestras de plasma y leucocitos de los mismos pacientes mediante Nested PCR

18 Materiales y MétodosM Total de muestras: 31 Leucocitos (obtenidos por dextran) 31 PlasmaP Pacientes trasplantados (15) Renales (13) Renopancreáticos (2) Serología a IgG HHV-6 6 : 14 (+),, 1 (-)( Antigenemia pp65 : 15(-)

19 Diagrama de trabajo Muestras de Pacientes trasplantados Leucocitos Plasma Shell vial Nested PCR Nested PCR

20 Materiales y MétodosM Shell Vial 1) Células de fibroblastos humanos crecidas en forma de monocapa 200 ul de leucocitos previamente acondicionados Centrifugación 1 h 2200 rpm 37º C 48 hs Presencia de Antígeno 2) IFI AcMo ARGENE Ac Antiratón n marcado

21 Materiales y MétodosM Nested PCR 1) Extracción de ADN Columnas comerciales (Qiagen) 2) Amplificación Termociclador: : Abbot LCX 1er producto de amplificación n 520 pb 2do producto de amplificación n 258 pb 3) Electroforésis 258 pb Secchiero et al. J Infect Dis.1995;171: ;171:273-80

22 Nested- PCR Secuencia Target Primer Ext. Primer Ext. 1º Producto de amplificación (520 pb) Primer Int. Primer Int. Sensibilidad : DICT 50 / ml 2º Producto de amplificación (258 pb)

23 Nested- PCR Muestra: Plasma 258 pb Gel de agarosa 2%

24 Detección n de HHV-6 6 en Tx PACIENTES POSITIVOS / Total de muestras PCR Leucocitos SHELL VIAL PCR Plasma 1 4 / 4 1 / 4 0 / / 3 0 / 3 0 / / 2 0 / 2 0 / / 1 0 / 1 0 / / 1 0 / 1 0 / / 2 0 / 2 0 / / 2 0 / 2 0 / / 2 0 / 2 0 / / 2 0 / 2 0 / / 2 0 / 2 0 / / 2 0 / 2 0 / / 2 0 / 2 0 / / 2 0 / 2 0 / / 2 0 / 2 0 / / 2 0 / 2 0 / 2 Total

25 Paciente 1 Sexo masculino, 54 añosa Causa de Tx: Insuficiencia Renal Crónica secundaria a poliquistosis (desde 35 años) a Transplante renal con donante vivo relacionado Serología pre-tx POSITIVO NEGATIVO ND: no disponible Receptor CMV, HSV I y II, EBV HCV, HBV, HIV, HHV-6 Donante ND CMV

26 Paciente 1 El paciente evoluciona favorablemente Se lo controla por consultorio externo a partir de la 2da semana pos-trasplante Pos-Trasplante Semanas PCR Leucocitos Positivo Positivo Positivo Positivo SHELL VIAL Negativo Negativo Positivo Negativo PCR Plasma Negativo Negativo Negativo Negativo Sin datos clínicos relevantes

27 CONCLUSIONES 1- La frecuencia de detección n de HHV-6 6 en leucocitos por PCR fue de 11/25 (44%), esto sugeriría a infección activa en 5 de los pacientes estudiados 2- La PCR en plasma fue negativa en todos los pacientes y no se encontraron síntomas clínicos asociados a enfermedad por HHV-6 3- En 1/25 (4%) el Shell vial fue positivo con PCR positiva a en la misma muestra. Correspondería a a un paciente que adquirió infección n primaria pos-trasplante. Esto no se correlacionó con enfermedad

28 CONCLUSIONES 4- El l Shell vial es una alternativa complementaria a a las técnicas cas moleculares para detectar la infección n activa por HHV-6 5- Son necesarios estudios en forma longitudinal y prospectiva con mayor número n de pacientes evaluandolos a diferentes tiempos Pos-Trasplante con el fin de definir un algoritmo diagnóstico para la infección n activa por HHV6.

29 Agradecimientos Bioq. Alfredo Martínez Dra en Biología a Cristina Videla Servicio de Virología a (CEMIC)

30

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