HAPLOTIPOS DE HLA ASOCIADA AL GRADO DE SEVERIDAD CLÍNICA DE LA INFECCIÓN DE MALARIA POR P. FALCIPARUM EN LA CUENCA AMAZÓNICA DEL PERÚ

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1 MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA HAPLOTIPOS DE HLA ASOCIADA AL GRADO DE SEVERIDAD CLÍNICA DE LA INFECCIÓN DE MALARIA POR P. FALCIPARUM EN LA CUENCA AMAZÓNICA DEL PERÚ SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº87 BLG. GISELY HIJAR GUERRA [2003]

2 INFORME FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN I. IDENTIFICACIÓN Código del Proyecto de investigación: Centro de referencia: Centro Nacional de Salud Publica Título: Haplotipos de HLA asociada al grado de severidad clínica de la infección de malaria por P. falciparum en la cuenca amazónica del Perú Autores : Blg. Gisely Hijar Guerra INTRODUCCION La malaria es la enfermedad metaxénica más prevalente a nivel mundial, siendo endémica en 92 países y presenta focos de esporádicos de transmisión en 8 países más (1). Aproximadamente 41 % de la población mundial se encuentra en riesgo de adquirirla y cada año se reportan entre 300 a 500 millones de casos de malaria, siendo más del 90% de estos reportados en el África. Aproximadamente 2 millones de muertes por año son atribuidas a esta enfermedad, la mitad de ellas, en niños menores de 5 años de edad (2). El impacto de la malaria en la salud y en el desarrollo económico de las poblaciones humanas es mayor en los trópicos y sub-trópicos (3). La malaria ocasiona una considerable morbilidad en las Américas, principalmente en la región de la Cuenca Amazónica, donde el P. falciparum es el principal responsable. En el Perú, sólo hasta la semana 37 del año 2003, se han notificado casos confirmados de malaria por P. falciparum. Durante el mismo periodo del año 2002, se notificaron casos (4). La infección de Malaria por P. falciparum es más agresiva y complicada que la malaria por P. vivax, debido a que un porcentaje de los pacientes desarrollan malaria cerebral y/o presentan cuadros complicados. El empleo de marcadores genéticos humanos para el estudio de las complejas interacciones hospedero-patógeno, son de gran importancia para implementar medidas sanitarias de control adecuadas para las enfermedades infeciosas. 2

3 Asi, en estudios recientes se ha evidenciado que el polimorfismo alélico de los antígenos leucocitarios humanos (HLA) están relacionados con la susceptibilidad y la protección para desarrollar malaria severa (5-7). Estos reportes realizados en otras partes del mundo (como por ejemplo Africa) han demostrado una fuerte asociación entre la presencia de un alelo HLA clase I (HLA-Bw53) y un haplotipo de HLA clase II (DRB1*1302-DQB1*0501) y la protección a la malaria severa (5). En la actualidad en el Perú, no existen datos sobre el polimorfismo alélico de HLA relacionado a los diferentes cuadros clínicos de la malaria por P. falciparum, en tal sentido consideramos que es importante conocer factores dependientes del huésped que faciliten adquirir o que protejan de esta enfermedad. El impacto del presente estudio es conocer la posible asociación entre los diferentes tipos de haplotipos de HLA del huésped y su relación con el grado de severidad de los cuadros clínicos que presentan los pacientes con malaria. Si es que nuestra hipótesis es verdadera los datos obtenidos en este estudio servirán para tomar actitudes terapéuticas específicas al inicio de la enfermedad debido a que se podrá conocer el pronóstico del paciente de acuerdo a su HLA. De corroborarse la hipótesis del estudio, este servirá pára pronosticar el curso clínico de la enfermedad, a través de exámenes de HLA disponibles en los centros de salud o incluso pruebas rápidas, de tal manera que se podrá otorgar un tratamiento precoz adecuado previniendo los riesgos particulares del paciente. Los antígenos de leucocitos humanos (HLA) son un grupo de glicoproteinas transmembrana altamente polimórficos codificados por genes localizados en el brazo corto del cromosoma (6). En 1991 Hill y colaboradores fueron los primeros que propusieron la importancia de los antígenos HLA que estaban asociados a protección contra la malaria severa. Un gran estudio caso control de malaria en niños del Oeste de África, observó que el haplotipo HLADRB1*1302 DQB1*0501 ocurría en menor frecuencia en niños que sufrían malaria severa que en niños que sufrían malaria no complicada. Existe una fuerte asociación entre la presencia de alelos HLA (DQB1*0501, DQB1*0502 y HLA-Bw53) y la protección a la malaria severa y anemia por malaria en niños que presentan inicialmente malaria severa, mas que aquellos que presentaron anemia no complicada. Así alelos HLA clase II y clase I han sido asociados en la protección a la malaria severa, pero no a la malaria no complicada (8-9). Lamentablemente, existen pocos estudios longitudinales de la relación entre alelos HLA, citoquinas y casos de malaria por P. falciparum. 3

4 Además, se ha demostrado que algunos alelos de HLA son importantes para el diseño de una vacuna para la malaria, debido a su participación en la presentación de antígenos (10-11). OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN e HIPÓTESIS: Objetivo General: Determinar la asociación entre Haplotipos de HLA y el grado de severidad clínica de la infección con malaria por P. falciparum en la Costa Norte y en la Cuenca Amazónica del Perú. Objetivos Específicos: Realizar la tipificación de los alelos de HLA en los pacientes con diagnóstico o con historia documentada de malaria complicada y malaria no complicada. Determinar la asociación entre la presencia de los diferentes tipos de haplotipos y los cuadros de malaria complicada.. Genotipificar los aislamientos de P. falciparum tanto de los casos de malaria complicada como no complicada. Hipótesis: Existe asociación entre los haplotipos HLA y los casos de Malaria Grave Complicada que presentan los pobladores de la Costa Norte y la Cuenca Amazónica. MATERIAL Y MÉTODO Se obtuvo muestras impreganadas en papel filtro de los siguientes grupos de estudio: Pacientes con Malaria No Complicada (n=30) Pacientes con Malaria Grave Complicada (n=50) Personas no infectadas (n=50) Se amplificará por PCR los siguientes marcadores genéticos: HLA-DRB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1 TNFalpha TNFbeta. 4

5 Susceptibilidad Molecular Si las frecuencias Alélicas en pacientes de malaria complicada presenta diferencia estadisticamente significativa de un determinado alelo de HLA en contraste con los pacientes de malaria no complicada significará que esa frecuencia alélica en particular se correlaciona con el mal pronóstico clínico. Protección Molecular Si la frecuencia Alélica en pacientes de malaria no complicada presenta diferencias estadísticamente significativa en la frecuencia de un determinado alelo de HLA en contraste con los pacientes de malaria complicada significará que esa frecuencia alélica en particular se correlaciona con el buen pronóstico clínico. RESULTADOS Se estandarizo los protocolos para la amplificación del marcador HLA-DRB1 y TNF alfa. Las concentraciones de los reactivos fueron 1X de Buffer de PCR, 2.5 mm de Cloruro de Magnesio, 200 M nucleótidos, 1 M de cada oligonucleótido. El volumen final de reacción es de 25 L. Además se utilizo 100 ng de ADN purificado. Se han evaluado 30 muestras de pacientes de Malaria Grave Complicada y 30 muestras de pacientes con Malaria no complicada y 25 muestras de personas no infectadas con los marcadores HLA-DRB1 y TNF alfa. Queda pendiente el secuenciamiento de las muestras amplificadas. Los demás marcadores no pudieron ser evaluados por falta de reactivos e insumos críticos como los primers, enzimas, kit de secuenciamiento y kit de purificación de ADN. Se esta preparando un publicación de nuestros resultados, la cual será presentada al Comité Editor. 5

6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. World Health Organization The World Health Report Mental Health: New Understanding, New Hope. WHO Library Cataloguing in Publication Data. France. 2. UNDP/World Bank/WHO Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Tropical Disease Research : progress : thirteenth programme report of the UNDP/World Bank /WHO Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. 3. Investing in health research and development. Report of the Ad hoc Committee on Health Research Relating to Future Intervention Options. World Health Organization, 1996, TDR/Gen/ Oficina General de Epidemiología. Boletin Epidemiológico Semanal 2003, Vol XII, N Hill AVS, Allsopp CEM, Kwiatkowski D et al. Common West African HLA Antigens are associated with protection from severe malaria. Nature 1991; 352: Hill AVS, Jepson A, Plebanski M, Gilbert S. Genetic analysis of host-parasite coevolution in human malaria. Phil Trans R Soc Lond B 1997, 352: Hill AVS. The immunogenetics of resistance to Malaria. Proc Assoc Am Physicians 1999; 111: Bennett S, Allen SJ, Olerup O, et al. Human leucocyte antigen (HLA) and malaria morbidity in a Gambian community. Trans R Soc Trop Med Hyg 1993, 87: Busson M, Vu Tribu A, Labelle P, Pham-Van K, Ho-Quang H, Bouteiller AM, Bleux H, Charron D, Hors J. HLA-DRB1 and DQB1 allele distribution in the Muong population exposed to malaria in Vietnam. Tissue Antigens 2002, 59: May J, Meyer CG, Kun JFJ et al. HLA class II factors associated with Plasmodium falciparum merozoite surface antigen allele families. J Infections Dis 1999: 179: Good MF, Kaslow DC, Miller LH. Pathways and strategies for developing a Malaria blood stage vaccine. Annu Rev Immunol 1998: 16:

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