11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : A61K 35/ Agente: Arias Sanz, Juan

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : A61K 3/76 A61P 3/00 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Uso de virus adenoasociados para disminuir la resistencia inducida por radioterapia o por quimioterapia en pacientes con cáncer. Prioridad: DE Titular/es: Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Im Neuenheimer Feld Heidelberg, DE 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Von Knebel-Doeberitz, Magnus; Klein-Bauernschmitt, Petra; Zur Hausen, Harald y Schlehofer, Jörg 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Arias Sanz, Juan ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 2 DESCRIPCIÓN Uso de virus adenoasociados para disminuir la resistencia inducida por radioterapia o por quimioterapia en pacientes con cáncer. La invención se refiere al uso de virus adenoasociados para la preparación de un medicamento para disminuir la resistencia inducida por radioterapia o por quimioterapia, en pacientes que padecen un cáncer recidivante que se ha de tratar mediante radioterapia o quimioterapia. Hasta ahora, la terapia de enfermedades malignas se realizaba mediante radioterapia y/o quimioterapia, además de la extirpación quirúrgica de tumores. Sin embargo, el uso de agentes citostáticos está limitado por los efectos secundarios que aparecen, en particular, por la aparición de resistencias. Debido a estos efectos secundarios, los agentes quimioterapéuticos sólo pueden usarse en una medida limitada. Así, no puede usarse más que una dosificación tolerable por el paciente del agente quimioterapéutico que, sin embargo, sólo logra un bajo efecto curativo en la mayoría de los casos. De European J. of Cancer, vol. 32 A, Nº, págs (1996), Klein-Bauernschnitt, se sabe que la combinación de AAV (virus adenoasociados) con un agente quimioterapéutico mejora el efecto inhibidor del crecimiento del agente quimioterapéutico sobre células tumorales. Por ello, la presente invención se basa en el objetivo de reducir o atenuar el problema de la resistencia inducida por radioterapia o por quimioterapia. De esta manera, debe mejorarse la tasa de supervivencia de pacientes que padecen un cáncer recidivante, después de una radioterapia o de una quimioterapia. Además, deben poderse bajar las dosis posteriores en una radioterapia o en una quimioterapia. Además, debe mejorarse la capacidad de reacción de células tumorales recidivantes frente a la radioterapia o a la quimioterapia. Este objetivo se logra mediante los objetos de las reivindicaciones Conforme a la invención, mediante el uso de virus adenoasociados puede reducirse el desarrollo de una resistencia inducida por radioterapia o por quimioterapia, en pacientes que padecen un cáncer recidivante que se ha de tratar mediante radioterapia o quimioterapia. Sorprendentemente, se encontró que después de un tratamiento con virus adenoasociados (AAV) no patógenos humanos, las células tumorales de recidivas reaccionan mejor frente a una medida quimioterapéutica o radioterapéutica posterior. El virus AAV es un parvovirus humano que necesita una coinfección por un virus auxiliar para que pueda tener lugar una infección productiva. El AAV infecta a los seres humanos en la infancia temprana y es considerado no patógeno porque no se ha podido asociar ninguna enfermedad humana con la infección por AAV (Adv. In Vir. Res. 1987, 32, 43-6). La infección por AAV, en combinación con medidas quimioterapéuticas o radioterapéuticas, según han descubierto los inventores, aumenta la eficacia de la terapia tradicional y reduce resistencias que aparecen, de manera que puede llevarse a cabo una terapia posterior con mayor probabilidad de éxito que hasta ahora. Conforme a la invención, pueden usarse cualesquiera virus AAV. Preferentemente, se usa el virus AAV-2. En ensayos con animales, con ratones atímicos inmunodeficientes, a los que se implantaron células pequeñas de carcinoma bronquial por vía subcutánea, pudo demostrarse que una infección por AAV que se realizó simultáneamente con un tratamiento quimioterapéutico, conducía a un retroceso más rápido de los tumores. En ambos grupos, después de corto tiempo, aparecieron recidivas. Sin embargo, en el grupo sometido a quimioterapia, infectado por AAV, éstas reaccionaron mejor frente a otra quimioterapia que en el grupo sometido solamente a quimioterapia. Por esto puede reconocerse que una infección por AAV reduce o incluso evita el desarrollo de resistencias. La administración conforme a la invención de los virus AAV puede realizarse antes, simultáneamente o después del tratamiento quimioterapéutico o radioterapéutico. Sin embargo, se realiza preferentemente después de un primer ciclo de tratamiento quimioterapéutico o radioterapéutico. En particular, en tipos de tumores que reaccionan mal de por sí frente a un tratamiento quimioterapéutico o radioterapéutico puede estar indicado realizar el tratamiento antes de o simultáneamente con la quimioterapia o la radioterapia, para aumentar la eficacia del tratamiento. De esta manera, pueden disminuir las dosis de tratamiento, por lo que pueden reducirse los efectos secundarios. La radioterapia o la quimioterapia pueden ser cualquier radioterapia o quimioterapia que esté adaptada al cáncer que se ha de tratar. Tales terapias se conocen desde hace años y, además de la extirpación quirúrgica del tumor, son los procedimientos para curar las enfermedades cancerosas, es decir, aumentar en algún tiempo la expectativa de vida de un paciente. Por ello, para el experto las medidas de una radioterapia o de una quimioterapia son muy bien conocidas. El uso conforme a la invención de los virus AAV puede aplicarse a cualesquiera tipos de cáncer, pudiéndose esperar 2

3 el mejor éxito en tumores de colon, páncreas y cerebro (en particular, glioblastoma). Preferentemente, puede tratarse el carcinoma pulmonar de células pequeñas (SCLC) con éste Los medicamentos preparados conforme a la invención pueden administrarse por vía endovenosa, por infusión, intratumoral, oral (también mediante inhalación) o en forma cutánea. El virus se formula en una preparación apropiada, adecuada a la vía de administración. Así, para la administración endovenosa (también como infusión), e intratumoral del virus, preferentemente se proporciona éste en una solución fisiológica de cloruro de sodio, en una solución de Ringer o en una solución de PBS (solución salina tamponada por fosfatos), para una administración cutánea, en forma de una pomada, una suspensión o un gel, para una administración oral, en forma de un aerosol. La dosis de virus usada, dependiendo del peso corporal del paciente, asciende a 9 - partículas de AAV/kg de peso corporal. Conforme a la invención, también puede usarse una composición farmacéutica, que además del agente quimioterapéutico (citostático), contiene virus adenoasociados, en particular, AAV-2. Como agente quimioterapéutico, pueden usarse todos los agentes quimioterapéuticos (citostáticos) que pueden usarse hasta ahora en la terapia de tumores, solos o en combinación, por ejemplo, cisplatino, etopósido, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, trofosfasmida, busulfano, citarabina, fluorouracilo, mercaptopurina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, sulfato de bleomicina o mitomicina. Así, se prefiere proporcionar una solución inyectable para una administración endovenosa (también infusión) e intratumoral, una pomada para la administración cutánea, un aerosol para la administración oral. Como base para la preparación de la solución para infusión son apropiadas, respectivamente en forma pura o como mezcla, solución fisiológica de cloruro de sodio, solución de Ringer o PBS. La cantidad de AAV depende del peso del paciente, y asciende a 9 - partículas/kg de peso corporal. En la composición farmacéutica está contenido en la cantidad para un peso corporal medio de 70 kg. La dosificación exacta de la composición farmacéutica la establece el médico y depende del sexo y del peso del paciente, de la gravedad de la enfermedad, de la vía de administración y de la duración planeada de la administración. La composición también puede contener coadyuvantes usuales. Como coadyuvantes pueden usarse los habituales, como portadores de medicamentos, aglutinantes, disgregantes, lubricantes, disolventes, solubilizantes, aceleradores de la liberación, retardadores de la liberación, emulsionantes, estabilizantes, colorantes o correctores del sabor. La invención se explica en mayor detalle mediante las figuras adjuntas. La figura 1 muestra una representación esquemática de los protocolos para la determinación de la sensibilización frente a los medicamentos, mediada por AAV-2. La proliferación de las líneas celulares de SCLC, después de la infección y/o después del tratamiento con medicamento, se determinó mediante el ensayo con MTT [bromuro de (3- (4,-dimetiltiazol-2-il)-2,-difeniltetrazolio] (J. Immunol. Methods 1983, 6, págs. -63). Se calculó la proliferación relativa (A/Ao) por la relación de la absorción de células infectadas por AAV-2 y/o tratadas con el medicamento (A), respecto a la absorción de células pseudoinfectadas, no tratadas (Ao). Las figuras 2a y 2b muestran la sensibilización de las células de SCLC mediada por el AAV, frente a cisplatino, la proliferación relativa (A/Ao) de las líneas celulares de SCLC, NCI-H9 (figura 2a) y NCI-H446 (figura 2b), después de la pseudoinfección (a: PBS solo; b: infectado con un gradiente de células infectadas por Ad2 inactivado por calor) o infección por diferentes multiplicidades de una infección por AAV-2 con (columnas grises) o sin (columnas blancas), tratamiento posterior con CI 0 de cisplatino, conforme a la tabla 1 (TCID, dosis infecciosa en el cultivo de tejido). La figura 3 muestra la sensibilización mediada por AAV de tumores derivados de células NCI-H9 en ratones atímicos ( ratones por grupo). La dosis de cisplatino era de 3 mg/kg de peso corporal (administración semanal). La dosis de etopósido ascendía a 7, mg/kg de peso corporal (administrado tres veces por semana). El AAV-2 fue administrado semanalmente en una MOI (multiplicidad de infección) de 8 TCID/animal. Las flechas indican la modificación de las modalidades del tratamiento: - interrupción del tratamiento con medicamento e infección por AAV-2; + comienzo del tratamiento y de la infección. La invención se explica más detalladamente en el ejemplo del carcinoma pulmonar de células pequeñas (SCLC). Este tipo de carcinoma, en general, se caracteriza por una quimioterapia inicialmente eficaz y la remisión del tumor. Sin embargo, casi todos los pacientes padecen una recidiva que se ha formado por una resistencia de las células tumorales frente a la quimioterapia aplicada inicialmente (usualmente, cisplatino/etopósido). Por ello, se ensayó en un sistema modelo con una línea celular humana de carcinoma pulmonar de células pequeñas, si una infección por AAV aumenta el efecto citotóxico de los agentes quimioterapéuticos en el cultivo celular y en los tumores en ratones con trastorno inmunológico. Se demuestra que la infección por AAV aumenta significativamente la eficacia del tratamiento quimioterapéutico en células tumorales de SCLC y en tumores de SCLC. Ejemplo 1 6 Sensibilización de líneas celulares de SCLC frente a cisplatino y etopósido, mediante la infección por AAV Se cultivaron líneas celulares de cáncer pulmonar de células pequeñas (NCI-H164, NCI-H9 y NCI-H446) (Cancer Res., 1980,, 2-7, Cancer Res., 198, 4, ) en medio RPMI-16 (Eurobio, Raunheim, Alemania), se cultivaron células HeLa en DMEN (Eurobio, Raunheim, Alemania). Como medios de crecimiento, se 3

4 suplementó con glutamina (Eurobio, al 1%), antibióticos (penicilina y estreptomicina) y suero de ternera fetal al %, inactivado por calor (PAA, Linz, Austria). Se incubaron los cultivos a 37ºC en una atmósfera húmeda con % de CO 2, y se ensayaron regularmente para detectar impurezas de micoplasma Se multiplicó el virus adenoasociado tipo 2 (AAV-2) en células HeLa, usando adenovirus de tipo 2 (Ad-2) como auxiliar. Se purificó el AAV en un gradiente de cloruro de cesio y se valoró como se describe en J. Gen. Virol., 1994, 74, Los inóculos de adenovirus de tipo 2 eran sobrenadantes clarificados de células HeLa infectadas por Ad2. Se suspendieron las células de SCLC en PBS y se incubaron con AAV-2 purificado, en las multiplicidades indicadas de la infección (MOI). Después de 4 min a 37ºC, se retiró virus no unido, absorbido, mediante lavado con PBS y se completó el medio de crecimiento. Como controles (pseudoinfección) se usaron PBS o bien la fracción inactivada por calor (a 6ºC, durante min) de un gradiente de CsCl de células infectadas con Ad-2 solas, estando indicada en los respectivos experimentos la densidad (1,14 g/cm 3 ) de la fracción que contiene AAV-2, que se usó para la purificación del AAV-2. La relación volumen/células en estos experimentos fue 0 veces mayor ( ml/ 6 células) que la que se usó para las infecciones con AAV. Se trataron las células infectadas con AAV-2 o las células pseudoinfectadas, con cisplatino (Astra Medica, Francfort/Main, Alemania) o con etopósido (Bristol, Munich, Alemania) o con ambos en una relación de [cisplatino : etopósido = 1 : 2,], añadiéndose los medicamentos disueltos en PBS al medio en la concentración indicada. La proliferación de las células de SCLC después de la infección por AAV-2 y/o del tratamiento con agentes quimioterapéuticos, se determinó mediante el ensayo con MTT modificado (J. Immunol. Methods, 1983, 6, -63). Después de la infección o de la pseudoinfección se extrajeron las células y se colocaron en placas con 24 pocillos, con una densidad de células/pocillo y se trataron con los agentes quimioterapéuticos en las concentraciones indicadas. Después de seis días (NCI-H69, NCI-H446) o, en su caso, ocho días (NCI-H146, NCI-H9), se añadió MTT [bromuro de (3-(4,-dimetiltiazol-2-il)-2,-difeniltetrazolio; Sigma, Delsenhofen, Alemania] al cultivo, hasta una concentración final de 0, mg/ml. Entonces se incubaron los cultivos durante 4 h a 37ºC para permitir una reducción del MTT, formando formazano azul, mediante deshidrogenasas mitocóndricas (Arch. Biochem. Biophys., 1993, 3, ), lo que indica una proliferación activa de las células. Se centrifugaron las células, se lavaron con PBS y se disolvió el formazano en isopropanol. Las proteínas precipitadas sedimentaron mediante centrifugación (a 00 rpm, durante 1 min) y se midieron muestras de 0 µl del sobrenadante, para determinar la densidad óptica a nm (DO), usando la DO690 como referencia y un densitómetro Titertek Multiskan plus MKII (Lab Systems, Finlandia). Se definió la proliferación relativa (A/Ao) como la relación de la absorción medida (A) del sobrenadante de células infectadas con AAV-2 y/o tratadas con medicamento, comparada con la absorción que se midió para el sobrenadante de las células control pseudoinfectadas y no tratadas (Ao). El valor CI 0 se definió como las concentraciones de medicamento que conducían a una inhibición del 0% de la proliferación. Se extrajeron las células infectadas con AVV-2 (con valores de MOI, como los indicados), o pseudoinfectadas y se colocaron en placas con 24 pocillos, y se trataron con cisplatino. Después de seis o, en su caso, ocho días, se determinó la proliferación relativa. Adicionalmente, se efectuaron estudios cinéticos para determinar las modalidades óptimas de tratamiento de las células de SCLC, después de una infección por AAV. En estas pruebas se mostró que la sensibilización mediada por AAV era máxima de una a tres horas después de la infección. En esta prueba se administraron agentes quimioterapéuticos tres horas después de la infección por AAV. Para excluir efectos atribuibles a factores todavía presentes después de la purificación con gradiente de CsCl y de la inactivación de Ad2 por calor, se efectuó un control de la pseudoinfección por PBS, además de la pseudoinfección por la fracción del respectivo gradiente de un lisado de células infectadas con Ad2. Se midió la proliferación relativa de células de SCLC-NCI-H9 y SCLC-NCI-H446 después de la infección por diversos múltiplos de las unidades infecciosas (MOI) de AAV-2 ( 1 - de dosis infecciosa en el cultivo de tejido (TCID) por célula), con y sin tratamiento posterior con cisplatino, con los valores de CI 0 expuestos en la tabla

5 TABLA Como se muestra en la tabla 1, las líneas celulares de SCLC NCI-H69 y NCI-H446 manifestaban una elevada resistencia intrínseca frente a ambos medicamentos, siendo menor la sensibilidad frente al tratamiento con cisplatino/etopósido, mientras que las células NCI-H146 eran muy sensibles frente al etopósido y las células NCI-H9 eran muy sensibles frente a ambos medicamentos. Como se desprende de la figura 2 (a + b), la infección por AAV-2 condujo a una reducción de la tasa de proliferación de las células tratadas con cisplatino, con una MOI de 3 a 4 TCID/célula. La infección por una MOI de TCID/célula no condujo a ninguna potenciación adicional. No se observó ninguna inhibición significativa de la proliferación después de la infección por valores menores de MOI de AAV-2 o después de la pseudoinfección, lo que indica un efecto específico como consecuencia de la infección por MOI alta de AAV-2. La proliferación relativa en células infectadas con AAV-2 ( 3 AAV/célula) y tratadas con cisplatino (CI 0 ) se redujo a 0,29 en células NCI-H446 y a 0,2 en células NCI-H9, en comparación con la proliferación relativa de células sólo tratadas con cisplatino (CI 0 ) (0,9 en células NCI-H446 y 0, en células NCI-H9). Ejemplo 2 4 Determinación cuantitativa de la sensibilización de líneas celulares de SCLC frente a medicamentos, mediada por AAV-2 Para determinar cuantitativamente la sensibilización de células frente a agentes quimioterapéuticos después de la infección por AAV-2, se confeccionaron curvas de dosis-respuesta. Se determinó la proliferación relativa de las líneas celulares después de una pseudoinfección (PBS) o de una infección por 3 ó 4 TCID/célula y posterior tratamiento con diferentes concentraciones de cisplatino o etopósido o de una combinación de ambos medicamentos (tabla 2). 0 (Tabla pasa a página siguiente) 6

6 TABLA * Se calculó la proliferación relativa por la relación de la absorción (A) de células infectadas por AAV-2 y/o tratadas con medicamento, respecto a la absorción (Ao), de los controles pseudoinfectados, no tratados. Los factores de sensibilización (SF) se definieron como la relación de los valores CI 0 de células infectadas, comparados con los valores CI 0 de células pseudoinfectadas. El factor de sensibilización indica el factor por el que puede reducirse la concentración de un agente quimioterapéutico después de la infección por AAV-2, para obtener el mismo grado de inhibición de proliferación. Como se resume en la tabla 2, la sensibilización de NCI-H69 o NCI-H146 por AAV-2 fue moderada (SF máximo: aproximadamente 1,4 a una MOI de 4 TCID/célula). La infección de NCI-H9 o NCI-H446 indujo una sensibilización significativa dependiente de la MOI (SF máximo: aproximadamente 3 (NCI- H446) y 2,3 (NCI-H9), a una MOI de 4 TCID/célula). La sensibilización mediada por AAV-2 no dependía del agente quimioterapéutico usado. Ejemplo 3 6 Sensibilización frente a medicamentos de tumores derivados de MCI-H9 en ratones atímicos, mediada por AAV-2 H9 es una línea celular que deriva de un tumor que antes del cultivo no fue tratado por quimioterapia y no es resistente frente a medicamentos. Se mantuvieron ratones atímicos hembra (CD1-nu/nu) de Iffa Credo (Bruselas/Bélgica) en aisladores y recibían agua y alimentos a voluntad. Se inyectaron células de SCLC (H9) crecidas en forma experimental por vía subcutánea en el costado, a ratones de seis semanas de edad ( 7 células en 0 µl de PBS por animal). Cinco meses después de la inoculación de las células, cuando los tumores habían alcanzado un volumen medio de 0 mm 3, los animales fueron infectados semanalmente con AAV-2 (inyección intratumoral de 8 dosis infecciosa en el cultivo de tejido (TCID) y/o fueron tratados con agentes quimioterapéuticos por inyección intraperitoneal de 3 mg/kg de peso corporal de cisplatino (por semana) y 7, mg/kg de peso corporal de etopósido (tres veces por semana). En la figura 3 están indicados los detalles del comienzo y del final del tratamiento. En cada grupo (control, con tratamiento quimioterapéutico, con infección por AAV-2, con tratamiento + infección) se incluyeron cinco animales. Los animales infectados y no 6

7 1 infectados se mantuvieron en aisladores separados. Los diámetros de los tumores se midieron semanalmente y se determinó el volumen tumoral mediante la fórmula: ½ x anchura x profundidad x altura. Se determinó el volumen tumoral relativo (V/Vo) para cada animal y para cada momento (relación del volumen tumoral [V] comparado con el tumor al comienzo del tratamiento [Vo]. Como se desprende de la figura 3, el tratamiento con agentes quimioterapéuticos condujo a un rápido descenso de los volúmenes tumorales y a una regresión completa después de un tratamiento durante tres semanas. La combinación de agentes quimioterapéuticos con una infección por AAV-2 condujo a una reducción más rápida de los volúmenes tumorales, en comparación con los animales que sólo recibieron una quimioterapia, lo que indica una sensibilización por el AAV-2 de las células tumorales tratadas con el medicamento. La infección por AAV-2 sola no tuvo un efecto significativo, y los volúmenes tumorales aumentaban en la misma medida que en los controles no tratados. El tratamiento se interrumpió después de la regresión completa de los tumores y se reanudó con la aparición de recidivas. El tratamiento de recidivas en animales que sólo habían recibido un tratamiento con medicamento fue menos eficaz en comparación con animales infectados por AAV y tratados con quimioterapia. Esto indica el desarrollo de una resistencia frente al tratamiento inicial, al menos del grupo de animales tratados por quimioterapia. Las recidivas en animales tratados con AAV-2 seguían siendo sensibles frente al tratamiento con cisplatino y etopósido, pero la regresión de los tumores fue más lenta, en comparación con la regresión de los tumores iniciales. En la 9ª semana, los tumores de 3 de animales infectados con AAV-2 remitieron por completo, en contraste con los tumores de animales que sólo fueron tratados con agentes quimioterapéuticos, en los que no se indujo una regresión completa de los tumores

8 REIVINDICACIONES 1 1. Uso de virus adenoasociados para la preparación de un medicamento para disminuir la resistencia inducida por radioterapia o por quimioterapia, en pacientes que padecen un cáncer recidivante que se ha de tratar mediante radioterapia o quimioterapia. 2. Uso según la reivindicación 1, en el que se usan los virus adenoasociados en una dosis de 9 - partículas de AAV/kg de peso corporal. 3. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el virus adenoasociado es el virus adenoasociado 2 (AAV- 2). 4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el cáncer que se ha de tratar mediante radioterapia o quimioterapia es un tumor de colon, de páncreas o tumor cerebral, o un carcinoma pulmonar de células pequeñas.. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la administración se efectúa por vía endovenosa, cutánea, oral o intratumoral. 6. Uso según una de las reivindicaciones 1 a, en el que la administración se realiza antes, después de o simultáneamente con una quimioterapia o radioterapia

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