TRABAJO PRÁCTICO Nº 5: ÁCIDOS NUCLEICOS DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS A UTILIZAR

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1 TRABAJO PRÁCTICO Nº 5: ÁCIDOS NUCLEICOS DOCENTES: Andrés Ciocchini, Gabriela Niemirowicz. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS A UTILIZAR Purificación de ácido desoxiribonucleico (ADN) por partición diferencial en solventes orgánicos El ADN es un polímero de nucleótidos, altamente hidrofílico y con carga neta negativa debido a la presencia de un grupo fosfato en cada monómero. Por esta razón su solubilidad en solventes polares es muy alta. En este TP usaremos esta propiedad para separar ADN bacteriano, de los demás compuestos celulares. Para ello, se agrega a un lisado total de bacterias (una suspensión acuosa), el solvente orgánico fenol, muy hidrofóbico. Se produce entonces una partición de las diferentes moléculas en base a su afinidad por los distintos solventes. Las moléculas hidrofóbicas (lípidos) son solubles en el fenol, mientras que las moléculas anfipáticas permanecen en la interfase entre los solventes. El caso más importante es el de las proteínas, compuestas por aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos, y que constituyen la principal masa de compuestos celulares, y por lo tanto la principal fuente de contaminación para una preparación de ADN. Normalmente los aminoácidos hidrofóbicos no están en contacto con el solvente acuoso, debido a la estructura tridimensional que adoptan las proteínas. El fenol es un desnaturalizante potente (despliega a las proteínas) y por lo tanto los aminoácidos hidrofóbicos quedan expuestos al solvente y se solubilizan en aquel por el cual tienen mayor afinidad, es decir el orgánico. Por su parte y en base al mismo principio, los aminoácidos hidrofílicos se solubilizan en el solvente polar (agua en nuestro caso), produciéndose así la partición de las proteínas en la interfase de los dos solventes. Aquellas moléculas muy hidrofílicas (en nuestro caso el ADN), quedarán en la fase acuosa. El grado de pureza que se alcanza con este método simple y rápido es muy alto. Posteriormente a la extracción con fenol, se realiza una partición con fenol:cloroformo (50:50). Este paso, así como la posterior extracción con cloroformo solo, se realizan para eliminar el fenol (que es soluble en cloroformo), ya que su presencia impediría posteriores usos del ADN como sustrato de reacciones enzimáticas. El fenol utilizado para extracción de ADN, está equilibrado a ph 7,6. El fenol naturalmente tiene características ácidas, que favorecen la extracción de ARN. Además el ADN es poco soluble en ph ácido. En el trabajo práctico se utilizará una mezcla de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), ya que el fenol es corrosivo y produce

2 quemaduras en la piel. La inclusión de alcohol isoamílico en la mezcla ayuda a la dispersión de agregados y hace disminuir la formación de espuma. Precipitación de ácidos nucleicos Este método se basa nuevamente en la solubilidad diferencial del ADN. Una muestra de ADN en solución acuosa precipita al agregársele cationes (para neutralizar las cargas negativas que posee) y alcohol. El alcohol disminuye la constante dieléctrica del solvente acuoso, provocando una disminución en la solubilidad del ADN, que en presencia de altas concentraciones de sales, precipita. Este método es ampliamente utilizado como una forma de concentran ADN. Se utilizan dos tipos de alcohol en este método. El etanol y el isopropanol. La diferencia entre ambos es la capacidad de disminuir la constante dieléctrica. Mientras que el isopropanol posee una mayor capacidad y por lo tanto es posible usar menor volumen (solo 0,7 volúmenes, contra 2,5 volúmenes de etanol), tiene la desventaja de precipitar más sales y por lo tanto rinde un ADN de menor pureza que el etanol. La elección se basa en el volumen manejable, prefiriéndose el etanol siempre que sea posible debido a la mejor calidad del ADN obtenido. Electroforesis en geles de agarosa. Detección de ácidos nucleicos La electroforesis es una técnica muy utilizada para separar moléculas de acuerdo a su diferente movilidad en un campo eléctrico. Básicamente la velocidad con la que se mueve un electrolito es proporcional a la relación carga/masa. Es de gran utilidad en la separación de proteínas y ácidos nucleicos, debido a que ambas macromoléculas poseen carga neta. En el caso que nos ocupa, el ADN tiene como ya hemos señalado, una fuerte carga negativa, por lo que si se lo somete a un campo eléctrico, migra hacia el ánodo. Sin embargo. La relación carga/masa se mantiene constante, pues cada unidad monomérica que se agrega aporta la misma carga y masa, sin modificar asi la relación. Con el objetivo de separar moléculas de ADN de distinto tamaño, es necesario introducir en el medio móvil, una malla que impida la difusión libre de las moléculas. De este modo, los fragmentos de ADN de mayor tamaño, serán efectivamente retenidos en relación a aquéllos más pequeños, consiguiendo así resolver una mezcla heterogénea de fragmentos de acuerdo sólo al tamaño de los mismos. Para visualizar el ADN utilizamos un compuesto aromático, el bromuro de etidio, que intercalándose entre las bases nitrogenadas de los pares de nucleótidos, produce una concentración alta localizada en forma proporcional a la masa de ADN presente en cada banda. De esta manera, cuando iluminamos el gel con luz UV, ésta excita las moléculas de colorante emitiendo luz visible. Dado que el colorante se ha concentrado en las bandas que contienen ADN, el fondo de luz en el resto del gel es despreciable, y el método es de gran sensibilidad. Cuantificación de ácidos nucleicos. Existen dos métodos para cuantificar ácidos nucleicos. 1) Estimación a partir de la intensidad de fluorescencia emitida por bromuro de etidio, como se describió

3 anteriormente. 2) Medición espectrofotométrica de la cantidad de irradiación ultravioleta absorbida por las bases purínicas y pirimidinicas. El primero se utiliza cuando la concentración de ácidos nucleicos es muy baja o cuando la muestra presenta cantidades significativas de impurezas mientras que el segundo requiere que la muestra esté pura (sin proteínas, fenol, agarosa, u otros acidos nucleicos que puedan interferir con el mismo). El método espectrofotométrico aprovecha la capacidad de absorción a la luz UV que presentan las bases purínicas y pirimidinicas presentes tanto en el ADN como en el ARN. Las purinas y pirimidinas son estructuras que presentan dobles enlaces conjugados, esta característica permite que los ácidos nucleicos presenten una fuerte absorción a longitudes de onda cercanas a los 260 nm. En el trabajo práctico aprovecharemos esta característica para estimar la concentración de ADN bacteriano purificado. Objetivos: TRABAJO PRÁCTICO Extracción de ADN bacteriano a partir de un cultivo de Escherichia coli utilizando el método de partición diferencial en solventes orgánicos. Análisis de la integridad y características de los ADN cromosómico y viral extraídos, sometidos a manipulaciones enzimáticas y físicas. 1º Parte: Extracción de ADN cromosómico Cada grupo recibirá bacterias ya cosechadas por centrifugación. Estas provienen de 10ml de cultivo de Escherichia coli crecidas en un medio rico, de modo que cada grupo extraerá ADN cromosómico de aproximadamente millones de bacterias. El protocolo a seguir es el siguiente: 1. Resuspender suave pero exhaustivamente las bacterias en 3 ml de buffer Tris-HCl 50 mm ph 8, colocar el tubo en hielo y realizar las siguientes operaciones manteniendo la temperatura a 4 o C. La resuspensión se debe realizar forzando a la muestra a pasar a través de la pipeta de vidrio de 5 ml (usar propipeta!) 2. Añadir 1.2 ml de EDTA (etilendiaminotetraacetato) 0.25 M ph 8 y mezclar suavemente.

4 3. Agregar 0.6 ml de lisozima 10 mg/ml. Revolver suavemente con la pipeta y dejar 15 min. a temperatura ambiente. 4. Agregar 0.5 ml de SDS (dodecilsulfato de sodio) 10%, mezclar rápidamente y continuar la incubación a temperatura ambiente 5-10 min. más (o hasta ver viscosidad en el caso de que no haya aparecido durante el paso anterior). 5. Cerciorándose que el tubo que tengamos sea resistente a solventes orgánicos (fenol, cloroformo), agregar 1 volumen de cloroformo:isoamilico. Mezclar bien, suavemente (cabeza-cola, seis a diez veces), hasta que la fase orgánica se haya mezclado completamente con la fase acuosa. 6. Centrifugar el tubo 3 min a g, para acelerar la separación de fases. 7. Tomar la fase acuosa (cuando no es muy salada, como en este caso, la fase acuosa es menos densa que el cloroformo:isoamilico: de dónde hay que tomar?), con mucho cuidado de no tomar la interfase (aun cuando esto implique perder algo de la fase acuosa) y menos aún la fase orgánica. 8. Realizar dos extracciones con cloroformo:isoamílico (repetir pasos 5, 6 y 7) 9. Medir el volumen acuoso que cada grupo haya recuperado. Agregar diez veces menos volumen (0.1 volúmenes) de acetato de sodio 3 M ph5.2, mezclar muy bien y transferir a un vaso o tubo transparente. Colocar en hielo hasta que la temperatura se haya equilibrado. 10. Agregar 2.5 volúmenes de etanol frío y mezclar suavemente pero rápido. Observar la precipitación de una sustancia fibrosa y blanquecina: es el ADN que se puede pescar con la punta de una pipeta Pasteur doblada. 11. Sumergir cuidadosamente la punta de la pipeta Pasteur en la que está el ADN precipitado, en un tubo que tenga etanol 70% frío, y rápidamente pasarlo a un tubo que tenga un pequeño volumen de TE (Tris-HCl 20 mm ph7.6 - EDTA 1mM); el volumen necesario como para sumergir fácilmente el ADN y poder desprenderlo del vidrio. 12. Una vez en el TE, calentarlo a 55 o C 10 min. y resuspender muy cuidadosamente pipeteando repetidas veces. 13. Algunos grupos sonicarán el ADN resuspendido, con un tip pequeño dando 2 y 4 pulsos a mediana potencia (6) en un sonicador convencional. - Por qué agrega EDTA? - Qué es la lisozima, sobre qué actúa? 2º Parte:

5 Cuantificación del ADN genómico purificado. La cuantificación del ADN bacteriano purificado se llevará acabo mediante el método espectrofotomético. Para ello se efectuarán lecturas a 260 nm y 280 nm contra blanco de TE. Considere que una OD de 1 corresponde a aproximadamente a: - 50 μg/ml de ADN doble cadena μg/ml de ADN simple cadena o RNA. Determine la concentración de ácidos nucleicos presentes en su muestra. Calcule el cociente OD 260 /OD 280. Cómo se modifica este resultado de acuerdo a lo visto en la clase de problemas? - Por qué efectúa lecturas a 280 nm? Para que se utiliza el cociente OD 260 /OD 280? - Si ud no conociera la relación 1 OD=50 μg/ml, cómo haría para determinar la concentración de ADN en la muestra? - Por qué el ADN doble cadena absorbe menos que el simple cadena? Qué es el efecto hipocrómico? Digestión de ADNde λ. El bacteriófago (fago) λ es un virus de ADN doble cadena capaz de infectar y replicarse en bacterias. En el trabajo práctico realizaremos distintos tratamientos sobre el ADN obtenido a partir de este virus. A- Digestión sitio específica. Concentración Concentración μl final ADN λ. 1 μg/μl 50 ng/μl NEB Buffer 2 10X 1X H 2 O - - Volumen final Agregar 0.5 μl de la enzima de restricción HindIII. 2. Mezclar muy bien por agitación, y traer todo el volumen al fondo del tubo mediante una breve centrifugación. 3. Colocar el tubo en un baño equilibrado a la temperatura óptima de digestión con la enzima. Digerir por el lapso de 1 hora. - Cuál es el tamaño del genoma del fagoλ? Utilice las bases de datos del National Center for Biotechnology Information ( Número de acceso a GenBank: J02459 o M17233.

6 -Utilice el programa NEB cutter 2 ( para predecir cuantos sitios de corte para la enzima Hind III presenta el fago λ. Para ello copie y pegue la secuencia de ADN de λ en este programa o seleccione la opción Lambda del menu de secuencias estándar (esto cargará automáticamente el genoma del fago). Cuántos fragmentos de y de que tamaño debería ver en un gel de agarosa 1%? Y si utilizara las enzimas BamHI y NotI? Qué secuencias reconocen las tres endonucleasas? B- Digestión sitio inespecífica (DNAsa y RNAsa). 1. Preparar 4 eppendorfs conteniendo 5 μg de ADN de λ (500 ng/μl). 2. Diluir 1/100 el stock de DNAsa (5 mg/ml) en 50 mm Tris-HCl ph 7.6, 5 mm MgCl 2. Preparar 100 μl (Dilución 1). 3. A partir de la dilución anterior, preparar una solución 1/10 (Dilución 2) y 1/100 (Dilución 3) utilizando 50 mm TrisHCl ph 7.6, 5 mm MgCl 2. Preparar 100 μl de cada una de ellas. 4. Tomar 10 μl de cada una de las diluciones (1, 2, 3) y agregárselos a 3 de los eppendorfs preparados en el paso Incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Inactivar la DNAsa 20 minutos a 80º C. Sembrar en gel de agarosa 1%. 6. Al cuarto eppendorf agregarle 10 μl de 50 mm TrisHCl ph 7.6, 5 mm MgCl 2 y 1 μl RNAsa (10 mg/ml). 3º Parte: Electroforesis de ADN en geles de agarosa 1. Preparar una solución de agarosa 1% en buffer de electroforesis TBE 1X. Para lograr que se disuelva es necesario hervir la mezcla. 2. Enfriarla hasta o C y antes de que gelifique, agregar bromuro de etidio 0.5 μg/ml (usualmente la solución stock está 20000X), agitar suavemente para mezclar sin que aparezcan muchas burbujas y verter en las cubas ya preparadas (con topes y peine). MUCHO CUIDADO CON EL BROMURO DE ETIDIO: ES CANCERIGENO. MANEJARLO CON GUANTES, DEL MISMO MODO QUE TODO LO QUE ESTE EN CONTACTO CON ESA SAL (EL GEL, EL BUFFER DE CORRIDA, LA CUBA). CAMBIARSE LOS GUANTES ANTES DE TOCAR CUALQUIER OTRA COSA LIMPIA!!!!!!!!!

7 3. Cuando ha gelificado completamente, agregar TBE 1X hasta cubrir todo el gel, extraer con cuidado el peine y los topes de plástico, y terminar de agregar buffer (en caso necesario) como para cubrir los electrodos de la cuba y el gel. 4. Preparar las muestras a sembrar (ADN cromosómico, ídem pero sonicado, ADN plasmídico aportado por los docentes digerido y sin digerir, y marcadores de peso molecular), por agregado de buffer de siembra. Calcular cuánto agregar sabiendo que el buffer de siembra está 6X. Mezclar muy bien. 5. Sembrar no más de 20 μl por calle. Asegurarse la correcta orientación de los electrodos en relación al extremo del gel donde se realizó la siembra. Correr a 8 V/cm. 6. Cuando el frente llega a correr 3/4 partes del gel, cortar la corrida, y observarlo con un transiluminador de luz UV. MUCHO CUIDADO CON LA LUZ UV: PRODUCE DAÑOS IRREVERSIBLES A LA VISTA Y A LA PIEL. NO MIRAR SIN PROTECCION ADECUADA (ANTEOJOS O MASCARAS PARA UV), NO EXPONER LA PIEL INNECESARIAMENTE (USAR GUANTES DE LATEX, Y NO ESTAR DEMASIADO TIEMPO CON LA LUZ UV PRENDIDA)!!!!!!!!!!! Informe: Los alumnos escribirán un informe con los resultados obtenidos, discutiéndolos en base a lo visto en clases teóricas.