11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : C12N 5/ Inventor/es: Lyday, Bruce, W. 74 Agente: Curell Suñol, Marcelino

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : C12N /06 A61K 39/39 A61K 39/00 A61P 3/00 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Hipertermia e inmunoterapia para leucemias, linfomas y tumores sólidos. Prioridad: US Titular/es: Triad Immunologies L.L.C /4 Leahy Avenue Bellflower, California 90706, US 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Lyday, Bruce, W. 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Curell Suñol, Marcelino ES 2 39 T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 ES 2 39 T3 DESCRIPCIÓN Hipertermia e inmunoterapia para leucemias, linfomas y tumores sólidos. Campo de la invención La presente invención se refiere a la hipertermia y a la inmunoterapia para el tratamiento del cáncer Antecedentes de la invención Las primeras referencias al tratamiento del cáncer con hipertermia pueden encontrarse en rollos de papiro egipcios fechados en el A.C., que describen un paciente de cáncer de mama tratado con inmersión en agua caliente. La hipertermia de todo el cuerpo en la forma de hiperpirexia (fiebre) ha producido una regresión drástica de los tumores e incluso curaciones tras la infección con bacterias pirogénicas. A finales del siglo XIX y principios del siglo XX, el Dr. William Coley revisó los casos de regresión espontánea de los tumores y descubrió que un factor común era la fiebre prolongada de más de 39,ºC (3,ºF). El Dr. Coley intentó reproducir las fiebres con lisados bacterianos de Streptococcus pyogenes, que contenía material lipopolisacárido (LPS) pirogénico. Coley trató una amplia variedad de carcinomas y sarcomas con su mezcla de toxinas bacterianas (MBT), consiguiendo tasas de supervivencia a los años del % en casos de melanoma maligno inoperable. Estas tasas son considerablemente más elevadas que las obtenidas mediante programas de cirugía, radiación y quimioterapia. Se producían problemas cuando los pacientes empezaban a producir grandes cantidades de anticuerpos neutralizantes, que requerían grandes cantidades de MBT. Además, Coley se encontraba con dificultades para estandarizar la pirogenicidad de las toxinas. Coley siguió convencido que una parte crucial del éxito de su tratamiento se basaba en la respuesta inmunológica incrementada contra las toxinas, que de alguna manera presentaba reactividad cruzada contra los tumores. Los conocimientos actuales de la inmunología confirman la hipótesis de Coley, aunque en la actualidad resulta claro que la inmunidad antivírica se encuentra mucho más íntimamente relacionada con la inmunidad antitumoral que los mecanismos de respuesta antibacteriana. Todo ello se debe al hecho de que las infecciones bacterianas estimulan principalmente los brazos humoral o de anticuerpo + complemento del sistema inmunológico. Para parásitos extracelulares, tales como las bacterias y protozoos, ello proporciona un medio eficiente de eliminación dentro del flujo sanguíneo. Sin embargo, los virus son parásitos intracelulares, y las células huésped infectadas por virus expresan antígenos víricos en su superficie celular conjuntamente con las proteínas celulares normales. Por lo tanto, los linfocitos asesinos, con su capacidad para reconocer y eliminar las células infectadas por virus, resultan necesarios para erradicar el virus. Debido a que las células cancerosas también expresan autoantígenos o antígenos de huésped normal sobre su superficie celular junto con autoantígenos alterados o antígenos tumorales mutados, resultan necesarias las mismas células efectoras. Los linfocitos asesinos naturales ( natural killer, NK), los linfocitos asesinos activados por linfoquinas (LAK) y los linfocitos T citotóxicos antígeno-específicos presentan la responsabilidad principal de vigilancia y eliminación antitumoral y antivírica. Hasta el momento, no existen referencias en la literatura científica a la utilización de un virus pirogénico para inducir la hipertermia de todo el cuerpo. Se han intentado otras técnicas de inducción de hipertermia: inmersión en líquidos calientes, perfusión de extremidades e incluso radiación de microondas. La desventaja principal de estos procedimientos es que la mayoría de los cánceres se encuentran situados en partes profundas dentro de las capas de tejido, y el calentamiento desde el exterior no puede producir una temperatura suficiente para eliminar las células tumorales. Otro problema con estos enfoques de la técnica anterior es que en un cáncer metastásico, las células tumorales se encuentran diseminadas por todo el cuerpo, y un tratamiento diseñado para ser curativo debe calentar todo el cuerpo también. Un enfoque de pirexia en todo el cuerpo que utilice un virus seguro pero pirogénico resuelve estas dos dificultades. Se han intentado numerosas versiones de la inmunoterapia en el tratamiento del cáncer, de naturaleza tanto específica como no específica. El modulador inmunológico no específico principal en la terapia del cáncer ha sido el bacilo Calmette-Guerin, o BCG. El BCG produce una reacción de hipersensibilidad retrasada (DTH) que activa los macrófagos locales, que se convierten en algunos casos en tumorocidas. Sin embargo, resulta un mal agente pirogénico, por lo que no se materializan los beneficios de la hipertermia. Además, tal como se ha detallado anteriormente, estimula principalmente el brazo humoral del sistema inmunológico, por lo que la producción de interferón y la activación de los NK generalmente es reducida. Se han intentado terapias con interferón exógeno, pero adolecen de problemas de purificación y de toxicidad. Los investigadores han podido conseguir niveles de alfa-interferón veces superiores a los normales, pero la respuesta se ve dificultada por los factores bloqueantes séricos (SBF), que neutralizan el interferón foráneo antes de que pueda inducir una respuesta celular fuerte. Los inmunólogos en general están de acuerdo en que las terapias que estimulan la producción endógena de interferón resultan preferibles a aquellos que se basan en la inyección de interferones e interleuquinas recombinantes. La inmunoterapia descrita estimula los niveles endógenos de interferón A hasta niveles aproximadamente 2 veces superiores a los normales. Se han intentado numerosos enfoques a la vacunación contra el cáncer, con preparaciones irradiadas tanto de subunidades peptídicas y células completas, que producen una respuesta medible. En el caso del melanoma maligno, 2

3 ES 2 39 T3 1 2 se han probado clínicamente las vacunas polipeptídicas que contienen un antígeno común del melanoma: gp0, MART-1/Melan-A y TRP-1 (proteína relacionada con la tirosinasa). Una desventaja importante de estos enfoques es que, al ser polipéptidos, pueden tolerizar y no inducir una respuesta de células asesinas. Además, no todas las células de melanoma expresan estos antígenos in vivo para permitir su marcaje para la identificación y lisis por parte de células efectoras. Otro enfoque antígeno-específico es la utilización de células cancerosas completas que se han matado de una manera (habitualmente con irradiación) que deja intacta su estructura antigénica. A continuación, estas células se inyectan de vuelta en el cuerpo con el fin de inducir una respuesta inmunológica. El problema de este enfoque es que la carga tumoral debe reducirse por medios físicos antes de inducir los linfocitos T citotóxicos específicos. Las tres terapias anticáncer principales: la cirugía, la radiación y la quimioterapia reducen la carga tumoral pero simultáneamente destruyen el sistema inmunológico. La terapia descrita se ha diseñado para superar estas barreras. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, aparte de los objetivos y ventajas de una terapia hipertérmica de todo el cuerpo basada en la pirexia en respuesta a un agente vírico, algunos objetivos y ventajas de la presente invención son los siguientes: (a) proporcionar un medio para reducir la carga tumoral mediante un medio físico (fiebre) superior a 3,ºF, que no perjudique la función inmunológica, (b) inducir la conversión de billones de linfocitos asesinos naturales en células asesinas activadas por linfoquinas (LAK) capaces de actividad tumorocida no específica, (c) inducir un clon de linfocitos T citotóxicos (CTL) capaces de reconocer y destruir células tumorales que porten antígenos tumorales específicos durante toda la vida del paciente, (d) conseguir las actividades anteriormente indicadas sin riesgo de daños graves para el paciente. 3 4 Otros objetivos y ventajas resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente de la invención y su funcionamiento. De acuerdo con la presente invención, se proporciona la utilización de células dendríticas alogénicas pulsadas con péptidos tumorales en combinación con virus dengue para la preparación de un medicamento destinado a la inducción de una respuesta inmunológica no específica en un paciente de cáncer. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta leucemia, linfoma o un tumor sólido. En otra forma de realización, dicho virus es virus dengue tipo 1, virus dengue tipo 2, virus dengue tipo 3 o virus dengue tipo 4. En otra forma de realización, dicho virus dengue se purifica pasando dicho virus a través de primates subhumanos con el fin de confirmar la eliminación de la neurovirulencia, preferentemente dicho virus se pasa a través de células renales de mono verde africano. En otra forma de realización, la dosis unitaria de dicho medicamento es inferior a pfu/ml. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta melanoma y dicho péptido tumoral se selecciona de entre el grupo que consiste en los antígenos Melan-A/MART-1, gp 0, pmel7 y los antígenos del grupo MAGE. 0 6 En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta adenocarcinoma de mama y dicho péptido tumoral es el antígeno carcinoembriónico (CEA) o HER-2/neu. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta cáncer cervical y dicho péptido tumoral se selecciona de entre el grupo que consiste en cualquier proteína procedente del virus del papiloma humano de tipo 17 o de tipo 19. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta cáncer de colon y dicho péptido tumoral es el antígeno carcinoembriónico (CEA) o HER-2/neu. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta cáncer gástrico y dicho péptido tumoral es HER-2/neu. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta cáncer de cabeza o cuello y dicho péptido tumoral es la proteína MAGE-1 o MAGE-3. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta cáncer de pulmón y dicho péptido tumoral se selecciona de entre el grupo que consiste en las proteínas Aw68, HER-2/neu, MAGE, GAGE y BAGE. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta cáncer de próstata y dicho péptido tumoral se selecciona de entre el grupo que consiste en HLA-A2, PSA-1 y PSA-3. 3

4 ES 2 39 T3 En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta cáncer ovárico y dicho péptido tumoral es el antígeno carcinoembriónico (CEA) o HER-2/neu. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta cáncer pancreático y dicho péptido tumoral es el antígeno carcinoembriónico (CEA) o HER-2/neu. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta carcinoma de las células renales y dicho péptido tumoral son proteínas MAGE y GAGE. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta cáncer uterino y dicho péptido tumoral es el antígeno carcinoembriónico (CEA) o HER-2/neu. En otra forma de realización, dicho péptido tumoral es p3 o telomerasa. 1 En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta carcinoma nasofaríngeo y dicho péptido tumoral es un péptido procedente del virus EBV. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta leucemia o linfoma, y dicho péptido tumoral se selecciona de entre el grupo que consiste en: N-ras, K-ras, proteínas HTLV-1, proteínas HTLV-2 y proteínas víricas del virus EBV. En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta leucemia mielógena crónica o células de leucemia mieloide aguda y dicho péptido tumoral es N-ras o K-ras. 2 3 En otra forma de realización, el paciente de cáncer presenta leucemia de las células T y dicho péptido tumoral es un péptido procedente de HTLV-1 o HTLV-II. En una forma de realización adicional, dicho paciente de cáncer presenta linfoma no Hodgkin y dicho péptido tumoral es un péptido procedente del virus EBV. Descripción de la invención El virus dengue es un virus ARN de la familia de los togavirus, subfamilia de los flavivirus. Presenta una geometría icosahédrica, de diámetro aproximado comprendido entre y 4 nanómetros, con dos proteínas de cubierta principales. La proteína E1 o hemaglutinina es muy rica en aminoácido glicina, y presenta un peso molecular de aproximadamente daltons. La proteína E2 o neuraminadasa es rica en los aminoácidos alanina, serina y valina y presenta un peso molecular de aproximadamente daltons. La proteína E3 es una estructura transmembranal que ancla las proteínas E1 y E2 a las proteínas del núcleo viral. Los anticuerpos neutralizantes se dirigen principalmente contra la proteína E1. Materiales y procedimientos Criterios de selección de los pacientes 4 Sujetos varones o hembra con carcinomas de estadio I, II, III o IV, leucemias o linfomas. Virus 0 6 El virus dengue (disponible en el hospital del ejército Walter Reed, Washington, DC) se pasó por células renales de mono verde africano hasta menos de unidades formadoras de placa/ml. A continuación, se inocularon en frascos Roller células DBS-FRhL-2 con un inóculo de virus mínimo para la infección (MOI) de 0,000. Tras la adsorción durante 1, horas a 3ºC, se retiró el inóculo y los frascos se lavaron tres veces con 0 ml de solución salina equilibrada de Hank. El medio de mantenimiento (0 ml por frasco) consistía en medio mínimo esencial de Eagle con 0,2% de albúmina de suero humana, 0,22% de NaHCO 3, estreptomicina (0 µg/ml) y neomicina (0 µg/ml). El medio de todos los frascos se cambió al cuarto día y los líquidos sobrenadantes se recolectaron al sexto día. Previamente a la centrifugación a 1.00 x g durante minutos, se añadió albúmina de suero humana, resultando en una concentración final del 2,7%. El ph de la albúmina se ajustó previamente a su adición a los líquidos víricos. Como etapa final de la clarificación, el líquido se filtró a través de un filtro de membrana de 0,4 micrómetros (Nalge, Rochester, NY). Seguidamente, se analizaron muestras para agentes microbianos oportunistas, siguiendo las normas de salud pública para la autorización de las vacunas víricas vivas atenuadas (Code of Federal Regulations, capítulo 21, subcapítulo F, Biológicos). Tras la extracción de muestras para su análisis y ensayos de placa, se guardó el volumen restante en baño de hielo en una nevera a 4ºC durante 7 días, pendiente del resultado de los ensayos de seguridad y de los ensayos de placas. Se preparó un pool vírico final a partir de los líquidos en los frascos que contenían menos de unidades formadoras de placas/ml a 39,3ºC y sin presencia detectable de virus formador de placas grandes. El título medio para los viales era de PFU/ml; seguidamente se liofilizaron para su utilización tras las pruebas de neurovirulencia. Se llevó a cabo una inoculación bihemisférica intracerebral e intramedular de 0, ml de líquido vírico en monos rhesus macho, con 4

5 ES 2 39 T controles que recibieron líquidos de cultivo libres de virus. Se observaron los monos diariamente durante días para evidencia de implicación del SNC u otras anormalidades físicas. Tras su sacrificio, se llevaron a cabo análisis histológicos de la médula lumbar y cervical, de la medula oblonga inferior y superior, del mesencéfalo, del córtex motor para la identificación de patología vírica. Inoculación de los pacientes Los pacientes se inyectaron subdérmicamente con 2 ml de muestra de líquidos víricos una vez en cada extremidad, y una vez en el sitio principal del tumor de melanoma. 3 a días después de la inoculación, los pacientes se infusionaron mediante microcatéter intralinfático pulsando las células dendríticas con péptidos tumorales correspondientes a los tipos HLA de clase I del paciente. Se llevaron a cabo inyecciones cada 2 semanas hasta que el paciente ya no mostraba células tumorales detectables en escaneos de CAT, PET o RMI, o según las técnicas inmunohistoquímicas. Control de los pacientes Se llevó a cabo un seguimiento biomédico completo de los pacientes: pulso, tensión arterial, respiración, producción de orina y especialmente de la temperatura corporal. Los pacientes se mantuvieron bien hidratados y con dieta blanda o líquida (de alto contenido en proteínas) durante el periodo febril. En el caso del melanoma, se aplicó directamente una fuente externa de calor (un cojín eléctrico) sobre los tumores visibles durante el periodo febril. No se administraron analgésicos antipiréticos, debido a que un objetivo principal de la presente invención es conseguir una pirexia sostenida superior a 39,ºC. Tras el retorno a la temperatura corporal normal, se proporcionó el alta a los pacientes y se realizó un seguimiento externo de los mismos. Inyección de los pacientes Se llevaron a cabo inyecciones de los pacientes con aguja hipodérmica en la dermis con 2 ml de muestra de líquidos víricos una vez en cada extremidad. Tras 2 a 3 días, los pacientes se infusionaron con microcatéter intralinfático con pulsos de células dendríticas, con inyecciones repetidas hasta que el paciente proporcionaba resultados negativos para la enfermedad. Procedimiento de síntesis de péptidos Aunque pueden utilizarse muchos procedimientos de síntesis de cadenas cortas de aminoácidos, se describe el procedimiento siguiente. Etapa 1 Síntesis Se destiló cloruro de metileno de grado reactivo a partir de carbonato potásico anhidro dimetilformamida de grado reactivo, y se pasó por un tamiz molecular de 0,4 nm 48 horas antes de su utilización. Materiales y fuentes adicionales (todos los materiales eran de grado reactivo a menos que se indique lo contrario): 4 0 Material Isopropanol Ácido trifluoroacético Diciclohexilcarbodiimida Hidroxibenzotriazol Aminoácidos protegidos Resina benzhidrilamina 0,33 mmoles/g Origen comercial Fisher Chemical Eastman Chemical Vega Biochemicals Sigma Chemical Vega Pierce Biochemical 6 Se protegieron las cadenas laterales de la treonina y del ácido glutámico con grupos O-bencilo, la tirosina con orto-bromobencil-oxicarbonilo, y la cisteína con S-para-metoxibencilo. El aminoácido inicial (por ejemplo el ácido aspártico) se convirtió en ácido butoxicarbonil-β-bencilaspártico, y se unió a la resina benzhidralamina. Se realizaron comprobaciones de las reacciones de unión en cada etapa utilizando ninhidrina y/o ácido pícrico al final del ciclo. Resultó necesaria una unión doble para los residuos de ácido aspártico, cisteína, prolina, tirosina y fenilalanina. Se incluyó una cantidad equimolar de butoxicarbonil-asparagina para evitar la formación de cianoalanina. Tras la unión final de los aminoácidos, se extrajo el grupo butoxicarbonil N-terminal y la resina se secó al vacío durante la noche, proporcionando la resina peptídica (de pureza comprendida entre el 9% y el 97%). El péptido se separó de la resina y se extrajeron los grupos protectores de las cadenas laterales mediante el tratamiento de 1,0 g de resina y 1,0 ml de anisol con ml de HF líquido durante 1,0 hora a 4ºC. Tras la extracción del HF a 4ºC con un flujo de nitrógeno, el exceso de anisol se eliminó mediante extracción con éter anhidro (0 ml), exponiendo la mezcla resultante a alto vacío en presencia de pellets de NaOH con el fin de eliminar cualquier resto volátil de HF. La

6 ES 2 39 T3 resina cruda de péptidos se extrajo con HOAc al % desaireado con nitrógeno (0 ml) con el fin de eliminar cualquier reactivo residual. La mezcla resultante se diluyó con agua hasta HOAc al % y se pasó por una columna Sephadex G- equilibrada con HOAc al %. El producto final se liofilizó, proporcionando el péptido final Preparación de células dendríticas Se extrajeron los linfocitos y células positivas para clase MHC de entre las células de la médula ósea utilizando un separador de células activado por fluorescencia (FACS) con anticuerpos monoclonales para CD3, CD4 y CD8. Las células restantes se cultivaron durante noche en medio de Iscove modificado por Dulbecco (IMDM) suplementado con suero de feto bovino al % (FCS), 2-ME, y 0 IU/ml de penicilina, piruvato sódico 1 mm y µm de aminoácidos no esenciales, a 37ºC en una atmósfera de % de CO 2 en placas de 24 pocillos con aproximadamente 1 millón de células en 1 ml de medio de cultivo/pocillo. Tras 24 horas, las células se sembraron nuevamente en placas y se cultivaron en presencia de factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) e IL-4 recombinante a 900 U/ml. Transcurridos 3 a 4 días, se intercambió el medio por medio fresco de citoquinas. Alternativamente, pueden prepararse células dendríticas dérmicas (DDC) utilizando el procedimiento siguiente: se incuban queratomas procedentes de voluntarios humanos sanos en una solución de la proteasa dispasa tipo 2 bacteriana a una concentración final de 1,2 U/ml en RPMI 16 durante 1 hora a 37ºC. Tras el periodo de incubación, la epidermis y la dermis pueden separarse fácilmente. A continuación, se cortan las láminas de epidermis y dermis en trozos pequeños (de 1 a mm) tras varios lavados con PBS y se introducen en RPMI 16 suplementado con suero de feto bovino al % (FBS) y se introducen en placas de cultivo de tejidos de cm. Transcurridos 2 a 3 días, se extraen los trozos de tejido y el recolecta el medio. Las células que han migrado saliendo de las secciones de tejido hacia el medio se recogen por centrifugación, se resuspenden en 1 a 2 ml de medio fresco y se tiñen con azul tripán. Puede conseguirse un enriquecimiento adicional mediante separación en un gradiente de metrizamida. Las células se colocan en capas en columnas de 3 ml de metrizamida hipertónica al 14,% y se sedimentan a x g durante minutos a temperatura ambiente. Las células en la interfase de baja densidad se recogen y se lavan en dos lavados sucesivamente menos hipertónicos (RPMI 16 con FBS al % y NaCl mm) para devolver las células a la isotonicidad. Pulsado con péptidos de las células dendríticas Los péptidos inmunodominantes anteriormente descritos de los productos génicos pueden construirse utilizando una diversidad de procedimiento; sin embargo, se describe uno de ellos en la presente memoria. Puede utilizarse un sintetizador de péptidos múltiples Abimed 422 a escala de micromoles para construir los péptidos requeridos. Alternativamente, pueden utilizarse técnicas de ingeniería genética utilizando vectores de clonación y de expresión para proporcionar cantidades de miligramos de los péptidos deseados. Tras el aislamiento en cantidades suficientes de los péptidos deseados, éstos deben cargarse en las células dendríticas. En el día 8, las células dendríticas pueden pulsarse durante 2 horas a 37ºC en 1 ml de medio IMDM suplementado con BSA al 0,% y microgramos de péptido. Tras varios lavados isotónicos, los péptidos se encuentran listos para ser utilizados en humanos. Las células dendríticas pulsadas pueden almacenarse hasta dos años a -0ºC en nitrógeno líquido hasta su utilización. Funcionamiento de la invención 4 a. Hipertermia y termosensibilidad de las células cancerosas Las células cancerosas son más susceptibles al calor que las células de tejido normal debido a muchos factores: 0 1. Tipo de tumor 2. Situación del tumor 3. Suministro de sangre 4. Tasa de crecimiento. ph intracelular 6 6. Nivel metabólico celular En general, los tumores que surgen en tejido conectivo (hueso, cartílago, músculo) denominados sarcomas son más susceptibles a la hipertermia que los tumores que surgen en tejido de revestimiento o epitelial, denominados carcinomas. Ello se debe principalmente a los suministros relativos de sangre de los dos tipos de tejido. El tejido epitelial presenta un suministro sanguíneo mucho más rico que el tejido conectivo, de manera que los carcinomas son más termorresistentes. Los cánceres de la sangre, tales como las leucemias y los linfomas, no son susceptibles al daño por calor. Los melanomas malignos comparten ambas características, debido a que surgen del tejido de revestimiento, pero presentan un suministro sanguíneo pobre. 6

7 ES 2 39 T La situación también es crítica, debido a que los tumores de las extremidades resultan más fáciles de someter a calentamiento selectivo que aquellos en el interior del cuerpo. La mayoría de los éxitos de la técnica anterior con la hipertermia se ha producido con la perfusión de sarcomas en las extremidades. Los tumores situados cerca de una red extensiva de arteriolas resultan menos sensibles que aquellos situados lejos de estos vasos sanguíneos principales. La tasa relativa de crecimiento del tumor también resulta crítica. Un tumor agresivo de crecimiento rápido requiere un suministro sanguíneo más rico que un tumor durmiente. Los tumores de crecimiento rápido también acumulan grandes cantidades de metabolitos ácidos, y este factor se convierte en crítico durante la hipertermia. A temperaturas elevadas, el aparato del huso, que estabiliza los cromosomas durante su replicación, se ve sometido a desnaturalización y colapso, conduciendo a la muerte celular. A niveles moderados de hipertermia (3,ºF a 6ºF) o (39,ºC a 41ºC), tales como los inducidos por la fiebre dengue, la termosensibilidad se debe principalmente a factores indirectos, tales como el suministro sanguíneo, el ph intracelular y las tasas de metabolismo celular. Los tumores generalmente presentan un suministro sanguíneo pobre debido a que surgen de una sola célula y pronto superan el suministro sanguíneo local. La secreción de una hormona denominada angiotensinógeno estimula la proliferación local de vasos sanguíneos, pero la demanda supera las tasa de perfusión. En los tumores de tamaño moderado a grande, el núcleo interior está muerto debido a la incapacidad para obtener oxígeno, glucosa y otros nutrientes. Únicamente las células tumorales externas pueden llevar a cabo un intercambio suficiente de gases y nutrientes para sobrevivir. Los tumores también presentan un ph intracelular más bajo que el tejido sano debido a la baja perfusión para desprenderse de los productos residuales tóxicos y ácidos del metabolismo. Las células disponen de dos rutas para producir moléculas de adenosín-trifosfato (ATP) para llevar a cabo reacciones funcionales: metabolismo aeróbico y glucólisis. El metabolismo aeróbico utiliza oxígeno y rinde 36 moléculas de ATP por molécula de glucosa, produciendo pocos productos residuales ácidos. Por otra parte, la glucólisis es mucho más rápida, pero sólo rinde 2 ATP por glucosa y produce ácido láctico, que reduce el ph intracelular. Los tumores presentan tasas de glucólisis más altas que las células sanas debido a su crecimiento excesivo. De esta manera, el microambiente tumoral se caracteriza por hipoxia (niveles bajos de oxígeno), acidosis y agotamiento de nutrientes. El escenario descrito abre la posibilidad de explotar estas debilidades utilizando la hipertermia. Cuando la temperatura corporal se incrementa, también se incrementan las tasas de metabolismo celular. Debido a que las reacciones enzimáticas se aceleran en función de la temperatura, la células deben incorporar más nutrientes y desprenderse de sus residuos tóxicos. Las células sanas, con tasas de perfusión normales, pueden soportar fácilmente temperaturas de hasta 41ºC. Por otra parte, las células tumorales, se enfrentan a un escenario perdedor. Si no incrementar sus tasa glucolíticas, se morirán de hambre. Si no incrementan su tasa de glucólisis, su ph intracelular caerá hasta alcanzar 6,7, casi una unidad logarítmica completa por debajo del ph del flujo sanguíneo. A ph 6,0, los enzimas responsables de reacciones críticas de la célula empiezan a fallar, especialmente el sistema de bomba Na-K-ATPasa. Este enzima es responsable del mantenimiento del gradiente relativo de iones sodio y potasio a través de la membrana celular. Cuando cae, los iones sodio inundan la célula y ésta muere. Los lisosomas y peroxisomas son cuerpos citoplasmáticos unidos a membrana que contienen proteasas. A ph 6,0 o menos, estos cuerpos se rompen, digiriendo la célula. La sensibilidad de los tumores depende tanto del tiempo como de la temperatura, de acuerdo a la reacción siguiente: s = S 0 e kt 0 6 en la que s es la tasa de supervivencia en cualquier tiempo dado t, y S 0 es la tasa de supervivencia en el tiempo inicial y k es una constante que representa la tasa de inactivación a una temperatura dada y t es la duración de la incubación. Tal como se puede apreciar a partir de la ecuación anterior, la supervivencia celular decrece logarítmicamente. En términos sencillos, cuanto mayor es la temperatura, más corto es el periodo de tiempo necesario para una tasa de eliminación de 1 log o del 90%, una tasa de eliminación de 2 log o del 99%, o una tasa de eliminación de 3 log, o del 99,9%. La fiebre dengue produce temperaturas suficientes para producir una reducción de 1 a 2 log de las células tumorales viables, pero un número comparativamente pequeño sobrevivirá si se encuentra situado cerca de vasos con perfusión elevada. La respuesta inmunológica deberá identificar y eliminar estas células. b. Funcionamiento de la inmunoterapia no específica activa de la invención El virus de la fiebre dengue infecta y se reproduce en dos tipos de glóbulos blancos: en los monocitos inmaduros (que maduran para formar macrófagos), y en los linfocitos B, que maduran para formar células plasmáticas productoras de anticuerpos. Durante los tres primeros días de infección, el Dengue elimina el % de los glóbulos blancos circulantes, haciendo caer los recuentos de WBC de.0/ml a 2.2/ml. Al lisarse, estas células liberan cantidades masivas de interferón, interleuquinas y proteínas estructurales de los linfocitos en el flujo sanguíneo. Estas linfoquinas estimulan las células NK a convertirse en células LAK, que son capaces de eliminar las células que expresan antíge- 7

8 ES 2 39 T nos víricos y tumorales de manera no específica. En experimentos in vitro anteriores, las células LAK activadas por el Dengue eliminaron células de la línea tumoral humana K62 en un grado elevado. Las células LAK son capaces de eliminar células tumorales que son resistentes a las células NK, y ello resulta un factor crítico en el funcionamiento de la invención. El Dengue también induce que los macrófagos maduros adquieran propiedades tumorocidas mediante una linfoquina denominada MAF, o factor de activación de los macrófagos. En esta etapa, los macrófagos se convierten en leucocitos infiltrantes de tumores, capaces de eliminar las células cancerosas. Aunque esta respuesta, tras una eliminación de 1 a 2 log mediante hipertermia, podría erradicar perfectamente las células tumorales del paciente, proporcionando la curación, finalmente disminuirá. Con el fin de asegurarse por completo de que no sobrevive ninguna célula cancerosa al calor y a la respuesta LAK/TIL, se requiere un tercer componente, uno que proporcione la capacidad de vigilancia y eliminación tumoral durante toda la vida. c. Respuesta antitumoral específica de la invención Las células LAK, aunque poseen formidables propiedades tumorocidas, no presentan memoria inmunológica. Tras el retorno de los niveles de interferón a valores normales, estas células asesinas no específicas no presentan la capacidad para recordar la estructura antigénica que desencadenó su acción de destrucción de una célula. Esta función del sistema inmunológico se ha delgado al brazo de anticuerpos de la inmunidad humoral y a los linfocitos T citotóxicos. Los linfocitos T citotóxicos derivan del timo y migran hasta el tejido linfático. Aunque los linfocitos T4 ayudantes pueden ser citotóxicos para las células tumorales, reconocen péptidos más largos presentados por el MHC de clase II en un número limitado de tipos celulares. Los CTL T8 reconocen péptidos más cortos (de 8 a 11 aminoácidos) presentados por el MHC de clase I, presente en todos los tipos celulares excepto en los sitios privilegiados : SNC, retina y gónadas. Los CTL T8 utilizan su receptor de células T (TCR) para evaluar los péptidos presentados por las proteínas del MHC codificadas por los alelos A y B del HLA. Las proteínas producidas en el retículo endoplasmático son cortadas periódicamente por proteasas y los péptidos que encajan en el motivo de unión del HLA se cargan entre las cadenas del MHC. El complejo trimérico estabilizado de esta manera finalmente se inserta en la membrana celular, donde el péptido puede ser leído por el TCR. Las células que producen proteínas víricas, o péptidos relacionados con tumores, pueden eliminarse de esta manera si se producen CTL en cantidad suficiente. Estos CTL presentan memoria y pueden identificar y eliminar las células que expresan sus antígenos diana a lo largo de toda la vida del paciente. Muchos investigadores del cáncer han intentado producir CTL específicos de tumores con poco éxito. Las dificultades principales surgen de la falta de resección previa, de los siete métodos de evasión inmunológica de los tumores y de la tolerancia de las células T a los autopéptidos. Resección de los tumores 4 La eliminación del 99% (2 logs) de las células tumorales existentes es un requisito para unos resultados óptimos de la inmunoterapia. La quimioterapia con fármacos citotóxicos, la radiación gamma y la cirugía mayor pueden reducir el tamaño del tumor, pero deprimen el sistema inmunológico. Los pacientes en ocasiones resultan curados de su cáncer mediante estos procedimientos, para morir a causa de una infección debido a que se ha deprimido el sistema inmunológico del paciente. La hipertermia es el único procedimiento fiable de reducción del tumor que no suprime las respuesta inmunológicas celulares. Los siete métodos de evasión inmunológica de los tumores 0 Si una terapia consigue una reducción de 2 logs, las células CTL y LAK con frecuencia no tienen éxito en la eliminación de las células tumorales debido a los siete métodos de evasión inmunológica de los tumores. 1. La regulación negativa de la expresión del MHC de clase I. 2. Las mutaciones puntuales en los epítopos tumorales reconocidos por las CTL. 3. La expresión de la proteína HLA-G trofoblástica fetal evita el reconocimiento por parte de las NK. 4. Los microvasos tumorales inhiben la migración de LAK y CTL.. Las células tumorales inducen la secreción de IL- por parte de los monocitos, haciendo que las CTL sean anérgicas. 6. Las células tumorales expresan ligando Fas (FasL), que puede matar las CTL Fas Las células tumorales erigen barreras fibrosas estromales que impiden el movimiento de las CTL. La invención descrita se ha diseñado para vencer los siete mecanismos a través de la liberación de citoquinas inducida por el virus dengue. 8

9 ES 2 39 T Las células tumorales con frecuencia reducen o eliminan la expresión del MHC de clase I mediante la restricción de la beta-2-microglona, que forma el suelo del trímero MHC. Sin B-2m, el MHC es inestable y no puede unirse a péptidos. Las células tumorales también reducen las proteínas transportadoras TAP-1 y TAP-2, que transportan el complejo MHC hasta la membrana. La disfunción de estas proteínas conduce a la ausencia de expresión de clase I, haciendo que la célula tumoral sea invisible al receptor de células T de las CTL. La infección por virus dengue induce grandes cantidades de interferones alfa, beta y gamma. El IFN-gamma puede restaurar la expresión de clase I en las células tumorales al unirse a las regiones promotoras de los genes B-2m y TAP. El IFN-alfa también incrementa la expresión de clase I y actúa sinérgicamente con IFN-gamma elevando los niveles de clase I hasta los valores normales. Las células tumorales con frecuencia experimentan elevadas tasas de mutación como resultado de una regulación génica defectuosa, y las mutaciones en los péptidos diana reconocidos por las CTL específicas de tumores pueden ayudar a la célula tumoral a evitar la lisis. Si la mutación se produce en un aminoácido necesario para anclar el péptido a la cadena del MHC, el péptido ya no pueden unirse a una molécula del HLA. Si la mutación se produce en un residuo necesario para el reconocimiento del TCR, el péptido todavía podrá unirse al MHC pero ya no podrá ser reconocido por las CTL. La infección por Dengue resulta en niveles elevados de dos importantes citoquinas: IFN-beta e IL-2. Cuando las CTL se ven expuestas a estas citoquinas conjuntamente, pierden su especificidad de diana y adquieren una capacidad lítica similar a las células LAK. Estas CTL no específicas pueden lisar tipos tumorales de muchas líneas celulares sin restricción del HLA, de manera que las mutaciones en los péptidos relacionados con tumores no permiten la escapatoria. Las células tumorales que presentan una expresión reducida del MHC son vulnerables a la lisis por NK. Las células asesinas naturales utilizan un receptor que transmite una señal negativa cuando se unen al MHC de clase I. Si la célula reduce su expresión de HLA, puede resultar eliminada por las células NK. Las células trofoblásticas fetales expresan una proteína llamada HLA-G, protectora frente a la lisis por NK maternales. Las células tumorales que activan el gen HLA-G, aunque reducen sus niveles de MHC de clase I, pueden evitar ambos brazos del sistema inmunológico celular. La infección por Dengue induce niveles muy elevados de IL-2, que induce la proliferación de CTL. IL-2 también transforma las células NK en células LAK, que pueden eliminar líneas tumorales resistentes a NK, tales como la línea Cur del carcinoma de las células renales. Los vasos sanguíneos del tumor, especialmente las vénulas endoteliales altas (HEV), con frecuencia carecen de las selectinas P y E, que ligan las integrinas CD11 que se encuentran en las células asesinas activadas. Junto con elevadas tasas de cizallamiento hidrodinámico, ello evita que las células LAK y CTL salgan del flujo sanguíneo y se encuentren con las dianas celulares del tumor. La infección por Dengue induce niveles elevados de dos citoquinas proinflamatorias: IL-1 y el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-α). IL-1 y TNF-α regulan las selectinas en los vasos del tumor y ensanchan las uniones comunicantes entre las células endoteliales de los vasos. Ello permite que las células asesinas creadas por la terapia salgan de las HEV y destruyan las células tumorales. Las células tumorales con frecuencia segregan factor beta de crecimiento transformante (TGF-β), que provoca que los monocitos cercanos segreguen IL-. IL- provoca que las CTL sean anérgicas, de manera que ya no pueden unirse a las células tumorales. El virus dengue se reproduce selectivamente en los monocitos matándolos, y los niveles elevados de IL-2 inducidos revertirán el estado anérgico de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). Las CTL clonadas en respuesta a un patógeno con frecuencia expresan Fas, o CD9. Al unirse al ligando Fas (FasL), la célula CTL muere por fragmentación de su ADN (apoptosis). Las células en los sitios privilegiados con frecuencia expresan FasL para matar cualquier CTL que intrusione en áreas sensibles. Las células tumorales que expresan FasL pueden matar CTL receptivas, permitiendo el crecimiento incontrolado del tumor. La infección por Dengue induce cantidades elevadas de IL-6, que estimula la expresión de FLIP (proteína inhibitoria del ligando Fas). FLIP actúa como un interruptor de seguridad al cubrir el desencadenante de la autodestrucción de Fas en las CTL. Con la condición de que los niveles de IL-2 sean elevados, FLIP protegerá las CTL frente a FasL. Los niveles de IL-2 en la infección por Dengue se mantienen altos durante más de días. Las células tumorales segregan factores que promueven el crecimiento de los haces fibrovasculares denominados estroma. Esta red densa de haces de colágeno puede impedir la movilidad de las CTL. Los niveles elevados de IFNgamma inducidos por la infección por Dengue activan la expresión por parte de los macrófagos de CD44, que digiere las barreras estromales con enzimas hialuronidasa. Los macrófagos activados resultarán atraídos a las áreas tumorales por señales quimotácticas liberadas por CTL T4 y T8 específicos de tumores. 9

10 ES 2 39 T3 Superación de la tolerancia de las células T a los péptidos relacionados con tumores La terapia descrita en la presente memoria es única debido a su diseño para vencer cada método de evasión inmunológica de los tumores. Una terapia que consiga los dos primeros objetivos: reducción del tumor y vencer los mecanismos de evasión inmunológica del tumor, se enfrenta a otra barrera que debe superar: la tolerancia de las células T. En los últimos meses in utero, y durante los primeros 18 meses de vida, el sistema inmunológico de las células T experimenta un ciclo de selección y deleción clonal. Las células T4 y T8 con receptores que presentan una afinidad elevada para los autopéptidos presentados por el epitelio tímico resultan eliminadas (deleción). Únicamente las células T con baja afinidad por los autopéptidos resultan seleccionadas y abandonan el timo para residir en el tejido linfático periférico. Ésta constituye una importante salvaguarda contra la autoinmunidad, pero las células tumorales se aprovechan de este sistema. En el caso de que el tumor provoque una respuesta inmunológica, las CTL producidas presentarán una afinidad baja por el péptido y por lo tanto mostrarán una citotoxicidad reducida contra las células tumorales. Lo anterior junto con los métodos de evasión inmunológica existentes explica las bajas tasas de éxito de las inmunoterapias tumorales. La deleción clonal es un proceso imperfecto, lo que explica la existencia de enfermedades autoinmunológicas. Crece la evidencia que sugiere que la tolerancia puede superarse dadas las condiciones adecuadas. El primer requisito es la presentación eficiente del antígeno a las células T. Los macrófagos pueden funcionar como células presentadoras de antígeno (APC), pero las APC más eficientes son las células dendríticas (DC), derivadas de la médula ósea. Las DC capturan antígenos, los procesan para formar péptidos diana y seguidamente presentan los péptidos a las células T. A continuación, las CTL moldean sus TCR para que reconozcan el péptido y se conviertan en específicas para el antígeno. Las DC pueden preparar las CTL a tasas de 1:00, por lo que millones de DC pulsadas con péptidos tumorales pueden producir mil millones de CTL. Tras una reducción de 2 logs por hipertermia a partir de una carga tumoral inicial de mil millones de células, lo anterior resultará en 0 CTL por cada célula tumoral residual. El segundo requisito para superar la tolerancia de las células T es un nivel elevado de citoquinas de tipo Th1: IFNgamma, IL-2, IL-7 e IL-12. La expansión de las CTL se ve limitada por dos factores: los niveles de APC y de citoquina Th1. La infección por Dengue induce los niveles elevados que se requieren. Antígenos asociados a tumores (TAA) Otra desventaja importante en la inmunoterapia tumoral exitosa es la escasez de TAA que sirvan de dianas para las CTL. Al contrario que los péptidos capturados por el HLA en las células infectadas por virus, los TAA generalmente se sintetizan en cantidades más bajas. Cada célula presenta aproximadamente copias de un tipo específico de HLA, por ejemplo de HLA-A2. Cada fragmento peptídico debe competir con.000 otros para la unión a HLA, y se requiere un mínimo de 0 complejos MHC que presenten el péptido para la lisis por CTL. El melanoma presenta el TAA mejor caracterizado: Melan-A/MART-1, gp0, pmel7 y los antígenos del grupo MAGE, que se expresan en otros tipos tumorales. Se indican los tipos tumorales siguientes, con TAA específicos que pueden cargarse en DC alogénicas para preparar CTL específicas de tumores: Adenocarcinoma de mama El TAA expresado con mayor frecuencia por los cánceres de mama es el antígeno carcinoembriónico (CEA) y HER-2/neu, un protooncogén. CEA es una oncoproteína fetal de gran tamaño expresada en grandes cantidades en diversos adenocarcinomas, pero sólo en pequeñas cantidades en el tejido epitelial normal del intestino delgado. Un ejemplo de un péptido diana es YLSGANLNL, restringido por HLA-A2. HER-2/neu resulta sobreexpresado en muchos tipos tumorales y es una proteína grande (1.2 aminoácidos) con muchas dianas adecuadas para las CTL. Un ejemplo de un péptido diana es E7, que contiene los residuos , KIFGSLAFL. HER-2/neu se expresa hasta 0 veces más en células tumorales de mama, ovario y de tejido pulmonar. Cáncer cervical Los cánceres cervicales se encuentran asociados con el virus del papiloma humano (HPV) de tipo 17 y de tipo 19. Estos virus ADN son genéticamente estables, al contrario que los virus ARN influenza A y HIV-1. Los péptidos HPV restringidos por HLA se han identificado como dianas para las CTL. Cáncer de colon 6 El cáncer de colon comparte dianas similares con el cáncer de mama: CEA y HER- 2/neu. Cáncer gástrico Las células de cáncer de estómago se ha descubierto que sobreexpresan HER-2/neu.

11 ES 2 39 T3 Cáncer de cabeza y cuello 1 Se ha descubierto que los cánceres epiteliales escamosos de cabeza y cuello sobreexpresan los genes MAGE-1 y MAGE-3 correspondientes a péptidos asociados a melanoma. Leucemias y linfomas Aunque no resultan afectados por la hipertermia, debido a que flotan en un medio rico en oxígeno, las células leucémicas y de linfoma son vulnerables a las células LAK. También expresan péptidos a partir de los oncogenes N- ras y K-ras, asociados con la leucemia mielógena crónica y la leucemia mieloide aguda. Las leucemias de las células T con frecuencia resultan provocadas por los virus de la leucemia linfotrópica T humana HTLV-I y II. Los péptidos víricos presentados por el HLA en las células leucémicas pueden servir como dianas para las CTL. El virus de Epstein-Barr es un virus ADN de gran tamaño asociado con el carcinoma nasofaríngeo y el linfoma no Hodgkin. Los péptidos de este virus son expresados por las células cancerosas y pueden servir como dianas para las CTL. Cáncer de pulmón 2 Los cánceres de pulmón se dividen en escamosos y adenocarcinomas. Los péptidos diana restringidos por Aw68 se han aislado a partir de cánceres de pulmón escamosos y los adenocarcinomas comparten péptidos de los genes de HER-2/neu, MAGE, GAGE y genes BAGE relacionados. Cáncer de próstata Se ha utilizado el antígeno específico de próstata como marcador diagnóstico para el cáncer de próstata, pero también contiene epítopos de CTL. Entre los ejemplos restringidos por HLA-A2 se encuentran PSA-1, FLTPKKLQCV y PSA-3, VISNDVCAQV. Cáncer ovárico Las células de cáncer ovárico se ha descubierto que expresan HER-2/neu y CEA. 3 Cáncer pancreático Las células de cáncer de páncreas se ha descubierto que expresan HER-2/neu y CEA. Carcinoma de las células renales Los carcinomas de las células renales comparten muchos péptidos relacionados con el melanoma, incluyendo MAGE y GAGE. Cáncer uterino 4 Las células de cáncer uterino se ha descubierto que expresan HER-2/neu y CEA. Péptidos relacionados con tumores expresados como parte del proceso de carcinogénesis de la proteína supresora tumoral p3 0 El producto del gen p3 es una pieza fundamental del proceso de la carcinogénesis. Su producto es una proteína tetramérica que se une al ADN. Ello actúa como una barrera a la unión de la ARN polimerasa II, evitando la transcripción de un oncogén. La mutaciones que surgen por la radiación U.V., los carcinógenos químicos, la infección con un virus causante de tumor, tal como SV, pueden inactivar a p3. El gen p3 inactivado ya no puede evitar la transcripción y el oncogén se activa, transformando la célula en una célula tumoral inmortal de rápida proliferación. Se encuentran genes p3 mutados en más del 0% de los cánceres, y los péptidos de estos genes se encuentran restringidos por HLA. Las CTL específicas para p3 mutado, o incluso para células tumorales que sobreexpresan p3 normal, pueden erradicar tumores en ratones. Para la utilización de este tipo de péptido en pacientes de cánceres, los tipos de MHC de clase I pueden compararse a las bibliotecas de ADNc de p3 y seguidamente utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para confirmar la presencia de p3 mutado en muestras de tejido tumoral. Telomerasa 6 El segundo TAA general es el enzima telomerasa. Se añaden unidades repetitivas de ADN telomérico en los extremos de los cromosomas. Esto evita la desagregación de los cromosomas, así como las uniones intercromosómicas. El ADN telomérico se pierde cada vez que se divide la célula, y debido a la naturaleza semiconservadora de la replicación del ADN, no puede ser reemplazado por la ADN polimerasa I. Ello aparentemente sirve como reloj celular, 11

12 ES 2 39 T3 limitando el número de veces que puede dividirse una célula. Cuando los telómeros alcanzan la terminación, la célula inicia su muerte, incapaz de dividirse más Las células de cáncer, por definición proliferan rápidamente desafiando las restricciones impuestas a esta actividad. Para añadir telómeros, sintetizan grandes cantidades del enzima telomerasa. Cerca del 90% de las líneas celulares tumorales muestran niveles elevados de expresión de telomerasa, y la subunidad catalítica (htert) es una proteína restringida por HLA capaz de servir como diana para las CTL. Debido a que la telomerasa habitualmente no se sintetiza en las células normales, representa un TAA de expresión amplia para la inmunoterapia. Aunque la mayoría de TAA se encuentran presentes en algunos tipos normales de tejido, especialmente los de proliferación rápida, se producen en cantidades minúsculas. Debido a que los TAA deben competir con.000 péptidos derivados de proteínas normales, la presentación en el HLA de éstos es baja. Conclusión, ramificaciones y alcance De acuerdo con lo anteriormente expuesto, el lector advertirá que la terapia combinada descrita anteriormente proporciona un medio seguro y efectivo para eliminar las células cancerosas de un cuerpo humano. Mediante la combinación de los tres procedimientos que se conocen en la medicina como beneficiosos para los pacientes de cáncer, la terapia resuelve el dilema planteado por la quimioterapia, radiación y cirugía actuales. El objetivo anterior y los diversos otros objetivos y ventajas de la presente invención se consiguen sin riesgo indebido para el paciente, debido a que el virus dengue de tipo salvaje de fuerza completa presenta una tasa de mortalidad que según diversos textos de medicina tropical es nula, no existente y de 1 en No se encuentra ninguna otra referencia a la inyección en voluntarios de ningún otro virus de fuerza completa en ninguna revista. Aunque la descripción anterior contiene muchos datos específicos, éstos no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención, sino meramente como ilustrativos de algunas de las formas de realización actualmente preferidas de la presente invención. De esta manera, el alcance de la invención debe determinarse a partir de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes legales, y no por lo ejemplos proporcionados. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan el mismo significado que el comprendido comúnmente por el experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque puede utilizarse cualquier material y procedimiento similar o equivalente a los descritos en la presente invención en la práctica o en la experimentación in vivo o in vitro de la presente invención, se han descrito los procedimientos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas anteriormente en la presente memoria se incorporan a la misma como referencia. A menos que se indique lo contrario, las técnicas utilizadas en la presente memoria son metodologías estándar bien conocidas por el experto en la materia. El término sustancialmente puro tal como se utiliza en la presente memoria significa tan puro como resulte posible obtener mediante técnicas estándar de purificación. Sumario de la invención 4 0 De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento de destrucción de células cancerosas en un cuerpo humano mediante la hipertermia de cuerpo completo y la activación inmunológica específica y no específica producida por la inyección de virus de la fiebre dengue y células dendríticas pulsadas con péptidos para producir un clon de una línea celular específica de linfocitos T citotóxicos capaz de reconocer y matar células cancerosas a lo largo de toda la vida del paciente. Se entiende que los ejemplos y formas de realización descritos en la presente memoria se presentan únicamente a título ilustrativo, y los expertos en la materia concebirán diversos cambios o modificaciones a la luz de los mismos y deben incluirse dentro del espíritu y alcance de la presente solicitud y del alcance de las reivindicaciones adjuntas. 6 12

13 ES 2 39 T3 REIVINDICACIONES Utilización de células dendríticas alogénicas pulsadas con péptidos tumorales en combinación con virus dengue para la preparación de un medicamento destinado a la inducción de una respuesta inmunológica no específica en un paciente de cáncer. 2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el paciente de cáncer presenta leucemia, linfoma o un tumor sólido. 3. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho virus es dengue tipo 1, dengue tipo 2, dengue tipo 3 o dengue tipo Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho virus dengue se purifica pasando dicho virus in vitro a través de primates subhumanos con el fin de confirmar la eliminación de la neurovirulencia.. Utilización según la reivindicación 4, en la que dicho virus se pasa a través de células renales de mono verde africano. 6. Utilización según la reivindicación 1, en la que la dosis unitaria de dicho medicamento es inferior a pfu/ml. 7. Utilización según la reivindicación 1, en la que el paciente de cáncer presenta melanoma y dicho péptido tumoral se selecciona de entre el grupo que consiste en Melan-A/MART-1, gp0, pmel7 y los antígenos del grupo MAGE. 8. Utilización según la reivindicación 1, en la que el paciente de cáncer presenta adenocarcinoma de mama y dicho péptido tumoral es el antígeno carcinoembriónico (CEA) o HER-2/neu. 9. Utilización según la reivindicación 1, en la que el paciente de cáncer presenta cáncer cervical y dicho péptido tumoral se selecciona de entre el grupo que consiste en cualquier proteína del virus del papiloma humano de tipo 17 o de tipo 19.. Utilización según la reivindicación 1, en la que la paciente de cáncer presenta cáncer de colon y dicho péptido tumoral es el antígeno carcinoembriónico (CEA) o HER-2/neu. 11. Utilización según la reivindicación 1, en la que el paciente de cáncer presenta cáncer gástrico y dicho péptido tumoral es HER-2/neu. 12. Utilización según la reivindicación 1, en la que le paciente de cáncer presenta cáncer de cabeza o cuello y dicho péptido tumoral es la proteína MAGE-1 o MAGE Utilización según la reivindicación 1, en la que el paciente de cáncer presenta cáncer de pulmón y dicho péptido tumoral se selecciona de entre el grupo que consiste en Aw68, HER-2/neu, proteínas MAGE, GAGE y BAGE. 14. Utilización según la reivindicación 1, en la que el paciente de cáncer presenta cáncer de próstata y dicho péptido tumoral se selecciona de entre el grupo que consiste en HLA-A2, PSA-1 y PSA Utilización según la reivindicación 1, en la que el paciente de cáncer presenta cáncer ovárico y dicho péptido tumoral es el antígeno carcinoembriónico (CEA) o HER-2/neu. 16. Utilización según la reivindicación 1, en la que el paciente de cáncer presenta cáncer pancreático y dicho péptido tumoral es el antígeno carcinoembriónico (CEA) o HER-2/neu. 17. Utilización según la reivindicación 1, en la que el paciente de cáncer presenta carcinoma de las células renales y dicho péptido tumoral es la proteína MAGE y la proteína GAGE. 18. Utilización según la reivindicación 1, en la que el paciente de cáncer presenta cáncer uterino y dicho péptido tumoral es el antígeno carcinoembriónico (CEA) o HER-2/neu. 19. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho péptido tumoral es p3 o telomerasa.. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho paciente de cáncer presenta carcinoma nasofaríngeo y dicho péptido tumoral es un péptido procedente del virus EBV. 21. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho paciente de cáncer presenta leucemia o linfoma y dicho péptido tumoral se selecciona de entre el grupo que consiste en N-ras, K-ras, proteínas HTLV-1, proteínas HTLV-2 y proteínas víricas de EBV. 13

14 ES 2 39 T3 22. Utilización según la reivindicación 21, en la que dicho paciente de cáncer presenta células de leucemia mielógena crónica o de leucemia mieloide aguda y dicho péptido tumoral es N-ras o K-ras. 23. Utilización según la reivindicación 21, en la que dicho paciente de cáncer presenta una leucemia de las células T y dicho péptido tumoral es un péptido procedente de HTLV-I o HTLV-II. 24. Utilización según la reivindicación 21, en la que dicho paciente de cáncer presenta linfoma no Hodgkins y dicho péptido tumoral es un péptido procedente de EBV