Estudio de Linfomas No Hodgkin y Neoplasias de Celulas Plasmaticas por Citometria de Flujo. Primera Parte. Conceptos Generales

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1 Estudio de Linfomas No Hodgkin y Neoplasias de Celulas Plasmaticas por Citometria de Flujo Primera Parte Conceptos Generales Bioq. Mariela B. Monreal

2 Introducción Aportes de la Citometria de Flujo en el estudio de Linfoma 1- Herramienta DIAGNOSTICA Diferenciar NORMAL REACTIVO NEOPLASICO 2- CLASIFICACION Reconocimiento de ENTIDADES NEOPLASICAS distintas Relación con el pronóstico Reconocimiento de grupos de riesgo diferente, nuevos protocolos de tratamiento 3- Evaluación de EFECTIVIDAD del TRATAMIENTO Detección de Enfermedad Mínima Residual

3 Estudio de CMF para en el diagnostico de Linfomas Enfoque actual Sintomas Presentación Clínica Resultados de Laboratorio Morfología / Citoquímica Citogenético Inmunofenotipo Biología Molecular - FISH Biología Molecular - FISH

4 Cómo / Cuándo solicitar CMF? Frecuentemente, NO es necesario /efectivo (costo / beneficio) realizar varios CMF y/o en diferentes muestras.. El Consenso Internacional de Citometría (2006, Bethesda) identifica situaciones clínicas en las que la citometría es UTIL en la identificación de neoplasia y caracterización de la misma. La clasificación de la WHO establece la importancia de la evaluación conjunta de morfología, genética y fenotipo para la correcta clasificación de diferentes entidades. Realizar los estudios en un mismo centro que pueda CORRELACIONAR datos de las diferentes metodologias realizadas ES INDISPENSABLE - sobre todo en ciertas situaciones diagnósticas.

5 Diferentes centros: Limitación diagnóstica Posteriormente, hematólogo provee MAS DATOS : gran masa mediastinal, derrame pleural. Biopsia de tumor derivada a otro centro. Mujer joven, derrame pericárdico

6 Citometria de Flujo : una herramienta extremadamente UTIL..que necesita de DATOS para realizarse correctamente Historia clinica (diagnosticos previos!, tratamientos recibidos).edad, sexo Indicacion medica actual datos clinicos, laboratorio que motivan el estudio. Datos de CMF previas! Las decisiones del TEST de CMF a REALIZARSE son tomadas en BASE A ESTOS DATOS Anemia severa, MDS?

7 Citometría de Flujo Análisis de células en suspención Rayo Laser Detectores de luces Computadora Células en suspención Marcadas con Anticuerpos Monoclonales conjugados a fluorocromos Células pasan en fila una a una Almacenamiento de datos ANALISIS Gráficos-Reporte

8 Identificación de Neoplasia Linfoide de celula B madura (B- CLPD, B-NHL). CMF convencional RESTRICCION DE CADENAS LIVIANAS de Ig - K o L FENOTIPO ABERRANTE COMPARACION CON FENOTIPO NORMAL CD45 Evaluación de 4 antigenos Multiples combinanciones con CD19 y CD45 como marcadores comunes D19

9 Evaluación de fenotipo. Detección de anomalías. Asociacion a entidades clinico patológicas de la WHO Para cada grupo, CMF ADICIONAL, morfologia y biologia molecular / citogenetico colaboran en la mejor definicion de las ENTIDADES CD5+ CD10- CD5- CD10+ PLL MZL DLBCL (Richter) LPL-B CD5- CD10- : GRUPO MUY HETEROGENEO MCL CD5neg ; FCL CD10neg HCL LPL MZL MCL CD5+ CD10+ Entidades mas infrecuentes DLBCL FCL MCL CLL BL

10 NUEVA TECNOLOGIA Evaluación de fenotipo en combinaciones multiples CD19 CD20 CD45 Evaluación de 8 antigenos SIMULTANEAMENTE MAS INFORMACION VENTAJAS : DEFINIR MEJOR LAS PATOLOGIAS (DCO) MAYOR ESPECIFICIDAD (MRD) MAYOR SENSIBILIDAD (MRD) MAS INFORMACION en pocas CELULAS

11 NUEVA TECNOLOGIA Evaluación de fenotipo en combinaciones multiples INFORMACION PANEL 8 COLORES SITUACION MAS COMPLEJA SE REQUIERE UN CAMBIO PARA ABORDAR ESTA NUEVA TECNOLOGIA

12 ESTANDARIZACION TOTAL DE LA METODOLOGIA RESULTADOS TOTALMENTE COMPARABLES (en el tiempo / entre centros)

13

14 LST : TUBO SCREENING para B, T o NK SLP LST IDENTIFICA LINFOCITOS ANORMALES Combinacion de 12 anticuerpos monoclonales (8 colores)

15 LST : TUBO SCREENING para B, T o NK SLP 12 muestras de SP NORMAL, DIFERENTES DONANTES SANOS A LO LARGO DE DOS MESES

16 Identificación de Neoplasia Linfoide de celula T madura FENOTIPO ABERRANTE COMPARACION CON FENOTIPO NORMAL SCREENING INICIAL TUBO LST

17 Fenotipo T sin anomalias Intensidad de CD3 en celulas CD4 y CD8

18 Identificación de Neoplasia Linfoide de celula T madura

19 NEOPLASIAS DE CELULAS T MADURAS (PERIFERICAS) WHO PREDOMINANTEMENTE LEUCEMICAS /DISEMINADAS Leucemia Prolinfocítica T Leucemia de Células Grandes Granulares T Leucemia NK Agresiva Leucemia/Linfoma T Del Adulto (HTLV-1+) PREDOMINANTEMENTE NODALES Linfoma T Angioinmunoblástico Linfoma T Periférico sin otra caracterización (NOS) Linfoma De Grandes Células Anaplásico, T o Nulo, Primario Sistémico PREDOMINANTEMENTE EXTRANODALES Micosis Fungoides / Síndrome de Sezary Linfoma De Grandes Células Anaplásico, T o Nulo, Primario Cutáneo Linfoma T Subcutáneo Paniculítico Linfoma Extranodal T/NK, Tipo Nasal Linfoma T Intestinal Tipo Enteropatía Linfoma T Hepatoesplénico

20 PANEL EUROFLOW para B-CLPD

21 UTILIDAD CLINICA PRINCIPAL NUEVO ENFOQUE DIAGNOSTICO en base a FENOTIPO 1- El total de la información de los 5 tubos del panel es UNIFICADO en un solo TUBO (unico FILE) 2- El fenotipo TOTAL de la población de interés (por ej, CELULAS B), se ubica en una zona de los nuevos gráficos llamados APS : Separador Automático de Poblaciones B-CLPD panel APS CLL vs MCL CLL MCL 1 sigm CD CD79b CD CD

22 UTILIDAD CLINICA PRINCIPAL NUEVO ENFOQUE DIAGNOSTICO en base a FENOTIPO

23 B- CLPD panel : Comparacion de un caso problema vs. varios grupos de referencia

24 ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL Conceptos generales Nuevos regimenes de tratamiento en Linfoma No Hodgkin B prolongan sustancialmente la SLE (sobrevida libre de enfermedad) y sobrevida global. Inmunoquimioterapia : Combinaciones de anti CD20 con diferentes regimenes de altas dosis de quimioterapia Transplante autólogo Sin embargo, ciertos pacientes sufren de recaídas tempranas. Es de gran interés predecir tempranamente la duración y calidad de la respuesta, que posibiliten tomar decisiones terapéuticas alternativas. Después del tratamiento, es posible identificar pacientes con depleción de células neoplásicas a muy bajos niveles (EMR), lo cual se asocia a pronostico favorable. La erradicación de la enfermedad se plantea actualmente como un objetivo necesario para superar riesgo de recaida o progresion.

25 CONCLUSIONES En los últimos 15 años, la citometría de flujo ha evolucionado enormemente como metodología diagnóstica. Lejos de ser considerada una técnica auxiliar de estudios morfológicos, provee información extremadamente útil y completa, en menos de 24 horas. La misma debe ser considerada CONJUNTAMENTE con los resultados anatomopatologicos, para la correcta clasificación de muchas de la entidades ya descriptas. Los ENORMES avances tecnológicos de los ultimos 5 años, han planteado la necesidad imperiosa de ESTANDARIZACION de esta COMPLEJA metodologia con la que hoy contamos, para lograr aprovechamiento total de los datos, y obtener resultados COMPARABLES entre laboratorios, y a lo largo del tiempo. ESTE trabajo ha sido lanzado por el grupo EUROFLOW. El análisis de fenotipo cambia radicalmente a partir de esta propuesta. Esta NUEVA citometría permite identificar y subclasificar las mayoría de las entidades definidas (WHO actual), y permitirán el reconocimiento de nuevos grupos de patológías.

26 Seguimos con fenotipo normal y algunos ejemplos!

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