EVALUACION DE SEMEN EN PASTOR ALEMAN

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1 EVALUACION DE SEMEN EN PASTOR ALEMAN Martínez Jiménez Alejandro 1, Romero Niñez Camilo 1, García Contreras Adelfa, Carrillo del Valle Mariana 1, Santiago Bueno Jesús 1 Resumen. En general, la respuesta de los perros a la colección del semen con estimulación manual fue satisfactoria, es decir, fue posible colectar el semen en todos los donantes. Las anomalías primarias encontradas al momento del estudio microscópico de la morfología fueron: gota citoplasmática proximal, doble cabeza y colas dobladas. Las anormalidades secundarias fueron: flagelos sueltos, flagelos enroscados y cabezas sueltas. El porcentaje de movilidad progresiva en fresco fue del 85 al 90 %. El número de células de la concentración de espermatozoides fluctúo entre 480 células/ ml a 760 células / ml. En el presente estudio, los resultados indicaron que la movilidad de los espermatozoides congelados disminuyó en 22.5% en comparación con los espermatozoides frescos. Palabras clave: Espermatozoides, Criopreservación Introducción. Los espermatozoides son células delicadas que para sobrevivir la criopreservación requieren ser deshidratados y rehidratados mediante el uso de diluyentes que contienen crioprotectores específicos (productos que estabilizan las membranas celulares), y mediante unos procesos de enfriamiento y congelación que minimicen el daño que el hielo produce en la célula. Por lo tanto, los protocolos de criopreservación deben de ser modificados y optimizados cuidadosamente para cada especie (Althouse et al; 1991, Arregui et al; 2005). Hay muchas razones por las que puede ser que sea necesario congelar y evaluar el semen. Esto puede ser como parte de una examinación de pre-crianza rutinaria en un perro joven; puede también ser importante en los perros que no se utilizan con frecuencia para reproducirse. La fertilidad de un reproductor es un aspecto importante, especialmente en casos de perros guía, en perros libres de displasia entre otros (Stornelli y Sota, 2006). Un segundo ámbito de interés es que el perro podría ser un modelo de estudio en el laboratorio para mejorar la fecundidad o preservar gametos de especies en peligro de extinción, como el lobo ártico (Canis lupus), el lobo de Etiopía (Canis simesis), el lobo mexicano (Canis lupus baileyi), o el zorro rosado de San Joaquín (Vulpes macrotis mutica) (Manosalva et al; 2005).. A pesar de la importancia obvia de la fertilidad de un reproductor, el valor de la examinación regular del semen ha atraído poca atención en la crianza de perros, entretanto se examina comúnmente en bovinos y cerdos. Si bien en estas especies la congelación y la evaluación del semen esta extensamente estudiada y es una practica de uso rutinario en muchos países, en el canino no ocurre lo mismo, encontrándose en pleno desarrollo y siendo su utilización poco usual (Stornelli y Sota 2006). En los países desarrollados la inseminación artificial (IA) con semen congelado en caninos es aplicada cada vez más frecuentemente debido a las posibilidades que ofrece (Foote; 2002). Sin embargo en nuestro país no se ha implementado, a pesar de la creciente demanda por parte de criadores. Por lo tanto el objetivo del presente trabajo fue evaluar la 1 Policlínica Veterinaria y de Asesoría Zootécnica de la UAM-X (POLIVET-AZ).

2 viabilidad de semen de perro después de un procedimiento de congelación y descongelación Material y Métodos. Lugar. El análisis del semen y procesamiento de congelación y descongelación se llevo a cabo en el Laboratorio de Manejo de la Reproducción de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco. Animales. Los animales utilizados pertenecían a diferentes propietarios, que cedieron periódicamente su mascota para la obtención del semen. Se utilizaron 10 ejemplares de la raza Pastor Alemán, con edades entre 2-4 años y un peso 30 a 35 kg. Obtención de las muestras. El semen se recogió mediante estimulación manual sobre el bulbo penenano, depositando el eyaculado en un tubo de plástico graduado en ml y atemperado (Axner y Linde-Forsberg, 2000). Se obtuvieron dos eyaculados por semana de cada perro, durante un total de tres semanas. Evaluación macroscópica. El semen fue evaluado inmediatamente después de haberse obtenido. Los parámetros evaluados fueron: volumen en una probeta graduada en ml, el color mediante observación física del semen (subjetiva), y la temperatura fue medida con un termómetro digital. Movilidad masal. La movilidad y calidad del movimiento se valoro mediante una gota de la muestra sobre un portaobjetos, previamente calentado en una platina térmica a 37 0 C, al final se coloco un cubreobjetos y se observo al microscopio a 10x y 40 X. Los resultados de motilidad se expresaron como porcentaje de células espermáticas móviles (0-100). La calidad del movimiento de los espermatozoides se valoro según la técnica mencionada por Martín-Rillo (1996), citado por Córdova, 2005 basada en la siguiente escala: No se observa ningún movimiento espermático 0. existe movimiento pero no es progresivo 1. Movimiento progresivo en un número muy bajo de espermatozoides y el resto con tres movimientos anormales. 2. Tres movimientos progresivos. 3. Movimientos progresivos y rápidos. 4. Movimientos muy rápidos Movilidad progresiva. Se aplico una gota de semen sobre un cubreobjetos y un cubreobjetos, presionando la gota de semen. Se observo el extremo de la gota, en el microscopio con el objetivo de 10x y 40 se mide de 0-100%. Concentración. Se determino la cantidad de espermatozoides por unidad de volumen con la Cámara de Neubauer. (Lemus y Rodríguez, 2006). Vitalidad y Anormalidades. Para la determinación de espermatozoides vivos y muertos, se coloco una gota de semen y otra de la tinción eosina-negrosina, se homogenizaron las 2 gotas y posteriormente se realizo un frotis. Se observo al microscopio con el objetivo 10x, 40x y finalmente con el de100x, para el conteo de 100 espermatozoides, incluyendo vivos y muertos. También se determino el porcentaje de anormalidades. Evaluación ph. Se coloco una gota de semen sobre la tira reactiva de ph y posteriormente se comparo con la tabla de referencia (Freshman; 2001 Freshman; 2002, Axner; 2003).

3 Congelación y descongelación de semen. El semen fue diluido lentamente con un diluyente en base a TRIS (Hidroximetil Aminometano) - yema de huevo (20%) - glicerol (8%) hasta alcanzar una concentración promedio de 150 x 10 6 espermatozoides por ml. El semen fue envasado en pajuelas de 0.25 ml y 0.5 ml, las cuales fueron rotuladas para su posterior identificación. Las pajuelas fueron enfriadas a 5ºC por 2 horas, período de equilibrio, y luego puestas en vapor de nitrógeno líquido a una altura de 10 cm sobre la superficie del nitrógeno líquido durante 15 y 30 minutos antes de ser sumergidas directamente en el nitrógeno líquido. Una vez pasado este tiempo las pajuelas se sumergieron en nitrógeno líquido para su almacenamiento. Para descongelar las muestras, las pajuelas fueron sumergidas en agua a 35ºC por 35 segundos. Se descongelaron y evaluaron dos pajuelas por cada eyaculado (Sánchez et al; 2002). Resultados. En general, la respuesta de los perros a la colección del semen con estimulación manual fue satisfactoria, es decir, fue posible colectar el semen en todos los donantes. Los resultados del espermiograma en fresco se muestran en el cuadro 1. Las anomalías encontradas al momento del estudio microscópico de la morfología fueron: gota citoplasmática proximal, doble cabeza y colas dobladas, los cuales fueron detectados, en su mayoría, en los animales identificados con los números 3 y 5. Los perros número 2, 6 y 8 mostraron de1 9 al 11 % de anormalidades secundarias: flagelos sueltos, flagelos enroscados y cabezas sueltas. El porcentaje de movilidad progresiva en fresco fue del 85 al 90 %. El número de células de la concentración de espermatozoides fluctúo entre 480 células/ ml a 760 células / ml. La movilidad masal se califico en el rango de 4, que indica movimientos muy rápidos; el ph oscilo en un rango de 6.5 a 7, y finalmente los colores encontrados en la evaluación fueron blanco lechos, claro y cremoso. Cuadro 1. Evaluación microscópica del semen en fresco PERRO VOLUMEN COLOR CONCENTRACIÓN M.M. M.P. % VIVOS % ANOR PH (ML) Bcr 760x10 6 c/ml > Bcl 570 x10 6 c/ml < Bcr 720 x10 6 c/ml > Bl 660 x10 6 c/ml > Bl 630 x10 6 c/ml > Bcr 480 x10 6 c/ml < Bl 590 x10 6 c/ml > Bcl 610 x10 6 c/ml < Bcl 520 x10 6 c/ml > Bcr 640 x10 6 c/ml >6 6.8 MM: Motilidad masal, MP: Motilidad progresiva, Bcr: Blanco cremoso, Bl: Blanco lechoso, Bcl: Blanco claro, % ANOR: Anormalidades

4 Los resultados de movilidad progresiva después del descongelado que se obtuvieron con pajillas de 0.25 ml y con un atemperado de 15 minutos se muestran en el cuadro 2 y figura 2; y los obtenidos en pajillas de 0.5 ml se muestran en los cuadro 3 y en la figura 3. Cuadro 2. Movilidad progresiva obtenida (%) después del descongelado en pajillas de 0.25 ml con un atemperado de 15 minutos en vapor de nitrógeno. Cuadro 3. Movilidad progresiva en % obtenida después del descongelado en pajilla de 0.5 ml con un atemperado de 15 minutos en vapor de nitrógeno. NÚMERO DÍA DÍA DÍA DÍA % % VIVOS A ANORMALIDADES 21 DIAS Perro >8 65 Perro <15 63 Perro >8 66 Perro >6 68 Perro >8 48 Perro <13 61 Perro >6 66 Perro <12 49 Perro >5 63 Perro >6 50 NÚMERO DÍA 1 DÍA 7 DÍA 14 DÍA 21 % ANORMALID % VIVOS A 21 DIAS ADES Perro >8 64 Perro <7 64 Perro >8 65 Perro >6 66 Perro >8 49 Perro <10 62 Perro >6 64 Perro <10 51 Perro >5 63 Perro >6 52 Figura 1. Motilidad progresiva vs Días de congelación Figura 2. Motilidad progresiva vs Días descongelación.

5 Los resultados de movilidad progresiva después del descongelado que se obtuvieron con pajillas de 0.25 ml y con un atemperado de 30 minutos se muestran en el cuadro 4 y figura 4; y los obtenidos en pajillas de 0.5 ml se muestran en los cuadro 5 y en la figura 5. Cuadro 4. Movilidad progresiva (%) obtenida después del descongelado en pajillas de 0.25 ml con un atemperado de 30 minutos en vapor de nitrógeno Cuadro 5. Movilidad progresiva (%) obtenida después del descongelado en pajillas de 0.5 ml con un atemperado de 30 minutos en vapor de nitrógeno. NÚMERO DÍA DÍA DÍA DÍA % % VIVOS A ANORMALIDADES 21 DIAS Perro >4 66 Perro <7 64 Perro >4 64 Perro >6 66 Perro >4 53 Perro <6 59 Perro >6 61 Perro <7 53 Perro >5 61 Perro >3 53 % % DÍA DÍA DÍA DÍA ANORMALIDADESVIVOS A NÚMERO DIAS Perro >5 67 Perro <7 64 Perro >3 63 Perro >5 62 Perro >5 51 Perro <4 57 Perro >4 60 Perro <7 54 Perro >8 60 Perro >6 54 Figura 3. Motilidad progresiva vs Días de congelación Figura 4. Motilidad progresiva vs Días de congelación

6 Discusión La movilidad permite predecir la capacidad fecundante in vitro de los espermatozoides (Donnelly et al., 1998). En el presente estudio, los resultados indicaron que la movilidad de los espermatozoides congelados disminuyó en 22.5% en comparación con los espermatozoides frescos, estos resultados no concuerdan con los reportados por Sánchez et al.; 2002 y Tsutsui et al., 2003, quienes reportan una disminución de la movilidad del 27% en espermatozoides descongelados. Los resultados de este trabajo muestran que después de congelar y descongelar el semen canino la movilidad progresiva se reduce en forma lineal hasta alcanzar un valor del 25 % a los 21 días, lo cual concuerda con lo observado en estudios de congelación de semen (Iguer-Ouada y Verstegen, 2001; Rota et al; 1995), ovinos (Watson, 1981) y en equinos (Kazim, 2004). El mecanismo por el cual disminuye la movilidad no ha sido esclarecido por completo; sin embargo, se sabe que la movilidad espermática es particularmente dependiente de la función mitocondrial. Las mitocondrias se encuentran estratégicamente distribuidas alrededor de la pieza media del espermatozoide para proveer energía a la dineína que propulsa a los microtúbulos (Kao et al., 1998). Una hipótesis que también se plantea (Hayashida et al; 2005), explica que al descender la temperatura por debajo de 0 C disminuye la formación de ATP, por lo que la bomba de Na K disminuye su actividad. Esto causa que el K que atraviesa la membrana para salir, fluya a una tasa mayor que el K que entra, por lo que la concentración de K intracelular disminuye, y la relación Na K se altera. Esto causa una despolarización parcial de la membrana o total de la membrana. La movilidad progresiva es el parámetro más utilizado en el espermiograma como indicativo de la calidad del espermatozoide después de ser congelado y descongelado (Hay et al; 1997). Se puede afirmar que la movilidad podría ser un buen indicador de la calidad del espermatozoide después de la descongelación, y por tanto, ser un parámetro básico para determinar la capacidad fértil del semen (Monsalva et al; 2005). Entre tanto el número de anormalidades de espermatozoides en fresco, estuvo en el rango de 6 a 15%, siendo comparable con los resultados descritos por los siguientes autores (Sánchez et al; 2002; Corona et al; 2005). Las anormalidades encontradas se pueden explicar por el efecto que ejercen los radicales libres, ya que estos inducen daño a los fosfolipidos de la membrana y al ADN en espermatozoides humanos; la producción de radicales libres y el daño del ADN son mayores en espermatozoides inmaduros con retención citoplasmática y anormalidades morfológicas de la cabeza(ollero et al; 2001,). Las reacciones producidas por estos radicales son mas activas cuando el semen es almacenado a temperatura ambiente que en estado congelado (Vishwanath, 2001). Sin embargo durante la congelación y descongelación se forman radicales libres y estos tienen un efecto perjudicial en la membrana, además la generación de radicales libres por espermatozoides dañados tiene un importante impacto sobre las células viables restantes, ya que representan un daño acumulativo para los espermatozoides almacenados (Limaye, 1997). Sin embargo, la concentración seminal fluctúo de 520 a 760 X 10 6 células /ml, las cuales son inferiores a las encontrados por Sánchez et al, (2002); Corona et al, (2005), los valores que ellos encontraron en promedio son del orden 900 x Hay estudios que

7 muestran, que la producción seminal es dependiente de la cantidad de tejido testicular, por tanto, los ejemplares de razas grandes tienen mayor producción espermática que los de razas pequeñas que tienen testículos más pequeños (Johnston et al; 2001). En lo referente a la vitalidad espermática, en ambos protocolos de congelación, los valores medios de espermatozoides vivos eran prácticamente similares en las dos técnicas (oscilando estos desde un 50% a 67%). En estudio realizado, el porcentaje de vitalidad de espermatozoides canino presento una variabilidad del 50 y 80% (Hay et al; 1997; Peña y Linde-Forsberg, 2000). El problema en la congelación no es la habilidad del espermatozoide para mantenerse viable a -196º C, si no soportar el daño que ocurre durante el congelamiento y descongelamiento, al pasar la célula por una zona de temperatura crítica de 196 a 37.5º C durante el cual se producen fenómenos que se derivan del proceso de enfriamiento, tales como formación de cristales intra y extracelularmente, deshidratación y distorsión de la membrana (Amann et al.;1987); con la finalidad de entender mejor este proceso se hace necesario remontarse a la fisiología de la membrana espermática. La configuración bilaminar de las cadenas de ácidos grasos de los fosfolípidos, junto con las proteínas integrales y periféricas, conforman una barrera hidrofóbica difícil de atravesar. Los fosfolípidos de la membrana se pueden mover lateralmente sobre esta, por lo que se dice que la membrana es un mosaico fluido. La fluidez de la membrana puede alterarse por varios factores, entre ellos la temperatura. Al bajar ésta se produce un reacomodo de las cadenas de fosfolípidos en forma de paquetes, ya sea en forma bilaminar o hexagonal, formándose con esto regiones cristalinas (Du et al; 1993). Bajo condiciones normales, el daño que una célula sufre durante el congelamiento depende de la velocidad de enfriamiento a la que ocurra dicho proceso. Mientras disminuye la temperatura, antes de llegar a -5º C, los líquidos aún no sufren cambios, pero al bajar de esta temperatura, se comienzan a formar cristales extracelulares de agua pura, logrando que por el mismo fenómeno de cristalización todos los solutos queden separados del cristal, aumentando así la concentración de sales en la porción de agua que aún no se congela (Curry y Watson 1994). Dentro de la célula hay también agua precongelada, la cual se difunde hacia el exterior de la célula para que la concentración de las sales en el interior y el exterior de la célula se equilibren, sucediendo así la deshidratación celular. Si el agua no sale rápidamente hay formación de cristales intracelulares, que dañan mecánicamente a la célula (Stornelli et al; 2006). Conclusión. Se concluye que con la congelación de semen, se puede disponerse de mejores opciones para el mejoramiento del manejo reproductivo en esta especie. La tecnología de congelación y evaluación del semen representa una alternativa, entre cuyas cualidades se encuentra: a) Establecimientos de bancos de semen congelado de razas o líneas con características zootécnicas de importancia económica, b) Disponer del material germinal de machos probados genéticamente, aun cuando el animal ya no exista.

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