Técnicas, Consejos, y Trucos

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1 Consejos para el mantenimiento de su equipo de HPLC Resolución de Problemas en HPLC:Troubleshooting Técnicas, Consejos, y Trucos Agilent Technologies Page 1

2 Pasos en la Resolución de Problemas Una vez que has detectado que hay un problema! Cómo lo solucionas? 1 st Falló el sistema o la calibración de la muestra? Hacer Blancos 2 nd Revisar el cumplimiento i del método Se ha seguido el procedimiento adecuadamente? Son correctos los parámetros en el instrumento? 3 rd Hágase más preguntas! Cuándo funcionó correctamente el sistema por última vez? Se ha cambiado alguna cosa? 4 th Revise TODOS los parámetros! Lo obvio no es siempre la causa Hubo más de un cambio? Page 2

3 Componentes del Sistema HPLC Bomba Inyector /Automuestreador uest eado Columna Detector Sistema de datos/integrador Los problemas pueden estar relacionados con todos los componentes del sistema Page 3

4 Encuesta a usuarios en LC-GC sobre Problemas de Columnas Column Problem Percentage of Respondents Alta presión, fritas obstruidas 24% Pobre reproducibilidad (formas de pico, retención) 16% Recuperación de muestra 14% Perdida de resolución 13% Inestabilidad 11% Volumenes muertos 8.1% Fugas, conexiones 4.8% Rango de ph 2.0% Bajo numero de platos 2.0% Saturación de la columna 20% 2.0% Cost 1.7% Miscellaneous 15% Page 4

5 Tipos de problemas del Sistema y la Columna A. Presión B. Forma del Pico C. Retención Page 5

6 Problemas de Presión Sintomas de la columna Alta columna empaquetamiento Baja presión - Fuga - Flujo incorrecto Posibles causas - Frita obstruida - Contaminación de la - Obstrucción en el Page 6

7 Corrección de la sobrepresión Determinación de la causa y corrección de una presión alta Muchos problemas de presión están relacionados con obstrucciones en el sistema. Comprobar la presión del sistema con y sin columna. Si la presión con columna es alta: Hacer un Back flush a la columna (con cuidado para el rendimiento futuro) Limpiar la frita bloquead (flujo reverso con un solvente fuerte) Lavar la columna Eliminar la contaminación en la column y limpiar el empaquetado bloqueado Retirar compuestos adsorbidos de alto peso molecular Limpiar precipitados introducidos de la muestra o del tampón Page 7

8 Obstrucción del empaquetado Tamaño de partícula Area (um 2 ) Diam intersticial medio (um) Porosidad de la frita(um) Cuidado d con las fases móviles tamponadas Los tampones contienen material insoluble filtrar La solubilidad del tampón decrece con el aumento del % de orgánico* - evitar 100%B con tampones salinos *Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, (2004) Page 8

9 Solubilidad del tampón La Tabla aba I presenta una estimación acó de la concentration ce ato soluble del tampón menos soluble (fosfato potásico a ph 7.0) en tres solventes orgánicos Page 9

10 Solubilidad de 5 tampones en mezclas con (a) metanol, (b) acetonitrilo, y (c) tetrahidrofurano metanol acetonitrilo THF El trazo representa acetato amónico a ph 5.0, representa fosfato amónico a ph 3.0, --- representa fosfato potásico a ph 3.0, representa fosfato amónico a ph 7.0, y representa fosfato potásico a ph 7.0. Page 10

11 Cambiar la frita puede no ser buena idea Puede que no sea posible con columnas de nueva generación Puede dañar columnas de alto rendimiento Column Inlet Frit Column Body Compression Ferrule Wear gloves Do not allow bed to dry Do not touch the column - body heat will extrude packing Do not overtighten Female End Fitting Male End Fitting Consejo: Prevenir es mucho mejor! Page 11

12 El Truco: Tecnicas de Prevención- La mejor elección! Usar protección de la columna - Filtros en linea - Salva columnas Filtrar las muestras Filtrar fases móviles tamponadas Fácil Extracción de la muestra(i.e. SPE) Lavado apropiado de la columna No tan fácil Page 12

13 Limpieza de la columna Limpiar con solventes más fuertes que la fase móvil Opciones de Solventes de Fase Reversa en orden de fuerza creciente Use al menos 25mL de cada solvente para columnas analíticas Esto lleva tiempo, amenudo se realiza Offline Fase Móvil sin sales de tampón 100% Metanol 100% Acetonitrilo 75% Acetonitrilo:25% Isopropanol 100% Isopropanol 100% Cloruro de Metileno* 100% Hexano* Debe revertirse para Re-Equilibrar *Consejo: Cuando use Hexano o Cloruro de Metileno debe lavar la columna con Isopropanol antes de volver a la fase móvil de fase reversa. Page 13

14 Limpieza i de la columna fase normal Use al menos 50mL o volumenes de columna para las columnas analíticas Opciones típicas de solventes en Fase Normal en orden de fuerza creciente: Solvent Composition Methanol:Chloroform 50:50% Ethyl Acetate 100% Page 14

15 Cuáles son los problemas más comunes de la forma de pico? 1. Picos dividos 2. Colas en los picos (simetría <1 ) 3. Picos anchos (mala resolución. Rs<2) Muchos problemas de formas de pico son combinaciones- i.e. ensanchamniento y colas o colas al incrementarse la retención. Los Síntomas no afectan necesariamente a todos los picos en el cromátograma. Cada uno de estos problemas pueden tener múltiples l causas. Page 15

16 Picos dobles por perturbacion en el flujo Perturbación en el flujo por un volumen muerto La L muestra fluye por diferentes vias a través de la columna Pobre empaquetamiento de las partículas El ph alto disuelva la Silice Normal Picos dobles o partidos Picos dobles Consejo: Un efecto similar se produce con una frita parcialmente obstruida Page 16

17 Picos divididos por efectos del solvente de inyección Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 μm Fase móvil: 82% H 2 O : 18% ACN Volumen de inyección: 30 μl Muestra: 1. Cafeina 2. Salicilamida 1 A. Solvente de inyección 100% Acetonitrilo B. Solvente de inyección Fase Móvil 0 10 Time (min) 0 10 Time (min) Consejo: Inyectar un solvente más fuerte que la fase móvil puede provocar problemas en los picos tales como picos divididos o ensanchamiento Truco: Mantener la concentración de orgánico en el solvente de muestra < Fase móvil Page 17

18 Colas, ensanchamiento y perdida de eficacia Pueden ser causadas por: Interacciones secundarias en la Columna Contaminación en la Columna Envejecimiento i de la columna Saturación de la columna Efectos extra columna Page 18

19 Forma del pico: Colas en los picos Simetría > 1.2 Normal Normal Cola Colas Causas Algunos picos con cola: Interacciones secundarias Efectos de Retención Interacciones con silanoles residuales. Pico pequeño eluyendo en la cola de un pico mayor. Todos los picos con colas: Efectos extra-columna. Acumulación de contaminación en la entrada de la columna. Metales pesados. Mala columna. Page 19

20 Colas en los picos- Contaminación en la Columna Consejo: Test Rápido para Determinar si la Columna está Sucia o está Dañada Truco: Revetir la columna y analizar Si hay mejora, una limpieza puede ayudar-no hay mejora-columna Dañada y necesita ser reemplazada Test QC dirección correcta Platos TF Test QC dirección inversa Platos TF Test QC despues lavado 100% IPA, 35 C Platos TF Time (min) Time (min) Time (min) Columna: StableBond SB-C8, 4.6 x 250 mm, 5μm Fase Móvil: 20% H 2 O : 80% MeOH Flujo: 1.0 ml/min Temperatura: R.T. Detección: UV 254 nm Muestra: 1. Uracilo 2. Fenol 3. 4-Cloronitrobenzeno 4. Tolueno Page 20

21 Forma de Picos: Picos con Frente (Fronting) 2000 mau Normal Simetría < 0.9 Fronting Tiempo(min) i Causas: Saturación de columna Page 21

22 Colas en los picos/ensanchamiento Efectos de carga de muestra Columnas: 4.6 x 150 mm, 5μm Fase Móvil: 40% 25 mm Na 2 HPO 4 ph 7.0 : 60% ACN Flujo: 1.5 ml/min Temperatura: 40 C Muestra: 1. Desipramina i 2. Nortriptilina tili 3. Doxepina 4. Imipramina i 5. Amitriptilina i tili 6. Trimipramina i i Factor de Cola Eclipse XDB-C8 USP TF (5%) i A. Alta Carga x10 C. Ensanchamiento Platos de una C8 A B Time (min) B. Baja Carga D Time (min) C D Time (min) 0 5 Time (min) Consejo: Evaluar tanto el Volumen como la Masa cargada Page 22

23 Forma de Picos: Picos Anchos Todos los picos ensanchan: Pérdida de Eficacia de la columna. Volumen muerto. Gran Volumen de Inyección. Algunos picos ensanchan: Elución tardía de una muestra previa (Pico fantasma). Alto Peso Molecular. Muestra - Proteina o Polímero. Page 23

24 Dispersión Extra-Columna Aumentando el Volumen Extra-Columna n Use tubos cortos de pequeño diámetro interno entre el inyector y la columna y entre la columna y el detector. n Asegúrese de que todas las conexiones de los tubos están hechas con los fittings adecuados. n Use una celda de detector de bajo volumen. n Inyecte pequeños volumenes de muestra. Page 24

25 Consejo: Malas Conexiones en el HPLC pueden Causar Ensanchamiento de Picos El Sistema se ha optimizado y : Todas las longitudes de los Tubos son Mínimas Se usó el diametro más pequeño de tubo Una celda de flujo de volumen adecuado Los Síntomas parecen mostrar que todavía hay demasiado Volumen Extra-Columna Qué está mal? ha hecho las conexiones adecuadamente? Page 25

26 Conectores de Columna Usados en HPLC Troubleshooting LC Fittings, Part II. J. W. Dolan and P. Upchurch. LC/GC Magazine 6:788 (1988) Swagelok in. Waters in. Parker in. Rheodyne in. Valco in. Uptight in. Page 26

27 Qué Ocurre si las conexiones no son correctas? Incorrecto demasiado largo La Férrula no asienta adecuadamente Incorrecto demasiado corto X Si la distancia X es muy larga, habrá fuga Cámara de mezcla X Si la distancia X es demasiado corta, se generará un volumen muerto o cámara de mezcla Page 27

28 Los cambio en Retención puedes ser Químicos o Físicos Pueden estar causados por: Envejecimiento de la columna Contaminación de la columna Equilibración insuficiente Pobre combinación columna/fase móvil Cambio en la fase móvil Cambio en el flujo. Diferentes volumenes de retraso del gradiente Page 28

29 Envejecimiento de la fase móvil/equilibración Causan Cambios en la Retención/Selectividad Columna 1 Tras lavado con Columna 1 - Inicial Columna 1 Dia siguiente i 1% H 3 PO 4 /Equilibración Time (min) Time (min) El analito primario era sensible al envejecimiento de la fase movil/ acondicionamiento c o a de la columna La forma de pico fue un asunto secundario (compuesto quelante de metal)resuelto por des-activación de la contaminación activa del metal Page 29

30 Los compuestos sensibles a los metales pueden Quelarse H Pista: Busca un par solitario de Electrones en :O: o N que pueda formar anillos de 5 or 6 miembros con un Metal C : O : : OH + M +2 : : H C O O H M +2 Salicilaldehido Complejo Anillo de 6-miembros N: M +2 OH : : C C O : : N : OH M +2 8-hidroxiquinolina Complejo Anillo de 5- miembros a-benzoinoxomina Complejo Anillo de 5- miembros Page 30

31 Un lavado Acido puede mejorar la forma de pico Antes del lavado Después del lavado ácido acido mls 1% H 3 PO 4 HO OH - OH OH M +2 HO OH OH OH 1 Columnas: ZORBAX SB-Phenyl 4.6 x 150 mm Fase Móvil: 75% 25 mm tampón fosfato amónico / 25% CAN Flujo: 1.0 ml/min. Temperatura: RT Tamaño muestra: 5 ml Tf: 3.7 Tf: 1.2 Se usó una solución del 1% H 3 PO 4 en columnas SB; en columnas desactivadas puede usarse un 0.5 %. Page 31

32 ph de la Fase Móvil y ph de tampones Porqué son tan importantes en HPLC? El ph afecta la Ionización Superficie de la Silica de la Columna Componentes de Interés de Muestra Tampones Resisten Cambios de ph y Mantienen la Retención Mejoran la Forma de Pico de los Compuestos Ionizables Efectos en el tiempo de Vida de la Columna phs bajos liberan las cadenas as alquilicas de la Fase estacionaria a a phs altos Disuelven la Silica Los cambios de ph tienen un gran efecto en la forma de pico, la retención y la reproducibilidad lote a lote Page 32

33 Porqué preocuparse del ph? ph, pka y Ácidos Débiles RCOOH RCOO - + H + K a = COOH COO _ [[RCOO - ][H + ] [RCOOH] + H + K = 6.4x10-5 a pk a = 4.2 A ph 4.2 la muestra contiene ácido benzoico e ión benzoato en proporción de 1:1. La forma de Pico puede ser pobre A ph 5.2 el 91% de la muestra es ión benzoato. La retencion RP disminuye. A ph 3.2 el 91% de la muestra es ácido benzoico. La retencion RP aumenta. Page 33

34 Efecto del ph en la Forma de Pico a o cerca del pka de la Muestra Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Móvil: 40% 5 mm KH 2 PO 4 : 60% ACN Flujo: 1.0 ml/min. Temperatura: RT ph 4.44 ph 3.0 CH 3 CHCOOH CH 2 CH(CH 3 ) 2 Ibuprofeno pk a = Time (min) Time (min) Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y esto debe evitarse. Page 34

35 Porqué preocuparse del ph? ph, pka y Bases Débiles R 3NH + R 3N + H K a = [R 3N][H ] CHOCHCHN 2 2 [R 3 NH + ] + K =1x10-9 a 10 + H CH 3 CH 3 CH 3 CHOCHCHN CH 3 H + pk a = 9 A ph 9 la muestra contiene difenhidraminas protonadas y desprotonadas en relación 1:1. La forma de pico puede ser pobre A ph 10 91% de la muestra es difenhidramina i desprotonada. d A ph 8 91% de la muestra es difenhidramina protonada. Page 35

36 ph vs. Selectivdad para Acidos y Bases Columna: Nucleosil-C18 Fase Móvil: 45% ACN/55% tampón fostato Muestra: Acidos Biliares SCD 40 Columna: mbondapak-c18 Fase Móvil: 60% 25 mm tampón fostato 40% Metanol 1. Ácido Salicílico 5 2. Fenobarbital 3. Fenacetin 4. Nicotina 5. Metamfetamina log k« UDC 5 SOC 4 3 C OC J.C. 111(1975) ,12 - OC + Retentio on J.C. 268(1983) ph A B C ELUENT ph La Retención y la selectividad puede cambiar dramáticamente cuando se cambia el ph. Page 36

37 Importancia del ph y los Tampones Un Ejemplo Práctico Por qué la Muestra impone las condiciones de uso Qué pasa cuando el tampón se usa con efectividad Qué pasa cuando se ignora el tampón o se usa inadecuadamente Page 37

38 Tampones más usados en Fase Reversa HPLC Buffer pka Buffer Range UV Cutoff (nm) Phosphate Formic acid* Acetic acid* Citrate Tris Triethylamine* Pyrrolidine * Volatile buffers for LC/MS applications La capacidad de tamponamiento óptima se dá a un ph igual al pka del tampon. La mayoría de los tampones tienen una capacidad d adecuada d de tamponamiento para controlar el ph de la fase movil solo en ±1 unidades de su pka Page 38

39 Importancia del ph y Tampones - Un Ejemplo Práctico Condiciones Isocráticas Optimizadas para Fármacos Cardíacos Columna: StableBond SB-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Móvil: 45% 25 mm NaH 2 PO 4, ph 3.0 ( ) 1-3 1) 55% MeOH Flujo: 2.0 ml/min. Temperatura: 35 C Detección: UV 254 nm Muestra: Fármacos Cardíacos 1. Diltiazem 2. Dipyridamol 3. Nifedipina 4. Lidoflazina 5. Flunarizina Time (min) Page 39

40 No Tengo Tiempo de Hacer Tampones o Ajustar el ph Fuertes interacciones secundarias de la muestra (aminas) con la superficie de la columna Columna: StableBond SB-C x 150 mm, 5 mm Fase Móvil: A: 20% H 2 O B: 80% MeOH Flujo: 1.0 ml/min. Temperatura: 35 C Detección UV:254 nm Muestra: Fármacos Cardíacos Incluso a muy alto % MeOH La mayóría de componentes fuertemente retenidos muestran pobre forma de pico debido al IEX en la superficie Time (min) Los Tampones son críticos para una buena retención y forma de pico en muchas separaciones. Page 40

41 Qué pasa si trabajas fuera del rango del tampón? 2 Se añadió tampón, pero no controla el ph a Forma de Pico Inadecuada Columna: StableBond SB-C x 150 mm, 5 mm Fase Móvil: A: 30% 25 mm NaH 2 PO 4, ph 4.8 no tamponado B: 70% MeOH Flujo: 10mL/min 1.0 ml/min. Temperatura: 35 C Detección UV:254 nm Muestra: Fármacos Cardíacos 1. Diltiazem 2. Dipyridamol 3. Nifedipina 4. Lidoflazina 5. Flunarizina Time (min) Page 41

42 No olvidar- Elegir la columna adecuada al ph de la Fase Móvil para el Máximo Tiempo de Vida ph Alto y Temperatura Ambiente (ph 11 RT) Inicial Fase Móvil: 50%ACN: 50% Agua : 0.2% TEA (~ ph 11, disolución de la sílica) Después de 30 inyecciones Consejo: Usar las columnas diseñadas para el ph elegido Page 42

43 Efecto del Tiempo de Respuesta del Detector El Sistema está operando bien- los ajustes se hicieron mal! Bajas Velocidades de Adquisición Pueden Dificultar la Detección de Impurezas y Reducir la Sensibilidad 1 er pico = 1.2 seg A 20 pts/seg = 24 pts 1 er pico = 1.2 seg A 5 pts/seg = 6 pts Tiempo de Respuesta 0.1 seg 0.2 seg 0.5 seg 1.0 seg 2.0 seg Time (min) 1.0 Agilent 1100 DAD Agilent 1100 WPS with ADVR Columna: Poroshell 300SB-C18 21x75mm 2.1 mm, 5um Fase Móvil: A: 95% H 2 O, 5% CAN con 0.1% TFA B: 5% H 2 O, 5% CAN con 0.1% TFA Flujo: 2 ml/min Temperatura: 70 C Detector: UV 215 nm Embolada de Piston : 20 Muestra: 1. Neurotensina 3. Lisozima 2. RNasaA 4. Mioglobina Consejo: Adjuste la velocidad de respuesta del detector para una mejor detección de picos. Page 43

44 Conclusiones Los problemas en Columnas HPLC más comunes son: Alta Presión (Prevenir mejor que curar) Malas Formas de Pico Cambio en la Retención/Selectividad A menudo estos problemas no están asociados con la columna y pueden ser causados por el instrumento o por problemas químicos: ph de la Fase Móvil Conexiones del Instrumento Parámetros del Detector Contaminación por Metales Comenzar con las pregunta correctas Encontrar las respuestaesta Las respuestas conducirán a soluciones Page 44

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