DETERMINACIÓN DE PATULINA EN JUGOS DE MANZANA Extracción líquido-líquido
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- María Mercedes Valdéz Toro
- hace 8 años
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1 Página 1 de 9 1. OBJETIVO Detectar y cuantificar la presencia de la micotoxina patulina en jugos de manzana. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE El método es aplicable a los jugos y concentrados de manzana. El rango de concentración en que puede ser usado este método es de 15 a 500 ng/ml. La cantidad mínima de muestra que puede ser analizada son 5 gramos. 3. FUNDAMENTO Se basa en la extracción de la Micotoxina con una mezcla de acetato de etilo y hexano, limpieza de la muestra mediante bicarbonato de sodio, y posterior concentración e inyección en HPLC. 4. DOCUMENTOS DE REFERENCIAS 4.1 Marks H. Rapid Gas Chromatographic/ Mass Spectrometry Determination and Confirmation of Patulin in Apple Juice. Journal of AOAC International vol. 90, Nº3, TERMINOLOGÍA 5.1 Patulina: es una micotoxina producida por varias especies de hongos, se puede encontrar como contaminante natural principalmente en manzanas. Principal síndrome que provoca es neurotóxico afectando el sistema nervioso. 5.2 HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución. 6. REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 REACTIVOS Bicarbonato de Sodio p.a Acetato de Etilo p.a Hexano p.a Sulfato de Sodio anhidro p.a Acetonitrilo, grado HPLC Ácido acético glacial, p.a Etanol absoluto, p.a Agua desionizada filtrada. DUEÑO DE PROCESO: Encargada de Laboratorio Toxinas Marinas y Micotoxinas ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE DE DOCUMENTO CONTROLADO SE CONSIDERA COPIA NO CONTROLADA APROBADO: Jefe Subdepartamento
2 Página 2 de Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida Estándar madre de patulina de aprox 200 µg/ml: Estándar stock de Patulina 10 µg/ml en etanol: Estándar intermedio de Patulina de 1 µg/ml en etanol 6.2 INSUMOS Micropipeta de 1000 µl Micropipeta de 200 µl Tubos de centrífuga de 15 o 50 ml con tapa rosca Viales silanizados de 4 ml ámbar con tapa: Lavar los viales con 1 ml aprox. de Acetonitrilo al 20 30% tres veces y secar antes de usar Pipetas Pasteur Pipetas volumétricas de vidrio, clase A de 5 y 10 ml Viales de HPLC Material usual de laboratorio (probetas, papel secante, cronómetro, etc.) 6.3 EQUIPOS Equipo HPLC con detector UV/DAD de longitud de onda variable Espectrofotómetro Shimadzu UV-Visible Refractómetro Balanza de precisión 0.01 g Concentrador de Nitrógeno Centrífuga para tubos de 15 a 50 ml capaz de alcanzar los 3000 rpm Calentador de bloque capaz de alcanzar 80 ºC Vortex
3 Página 3 de 9 7. DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado en punto materiales, insumos y reactivos esté disponible. A continuación se describe el método analítico, es crucial si no se dispone de práctica con el método leer completo este procedimiento antes de comenzar a trabajar. Es necesario utilizar guantes para este trabajo analítico como medida de bioseguridad. 7.1 MUESTREO / MUESTRA Chequear que antecedentes de la muestra en guía de ingreso coincida con lo rotulado en la muestra. Registrar la recepción de la muestra en el cuaderno Registro de análisis Laboratorio de Toxinas Marinas y Micotoxinas RG y el análisis de ésta en el mismo registro Almacenar la muestra de acuerdo a indicaciones del envase. Si no las tuviera, almacenar la muestra refrigerada hasta su análisis Al finalizar el trabajo y una vez informada la muestra, si la cantidad restante lo permite, almacenar aproximadamente 30 g de muestra como contramuestra y eliminar lo restante en bolsa de eliminación de desechos de laboratorio (bolsa roja o amarilla). 7.2 PREPARACIÓN DE REACTIVOS Estándar madre de patulina de aprox 200 µg/ml: Agregar 1mL de acetato de etilo a 10 mg de estándar de patulina (agregar al vial que contiene los cristales). Disolver adecuadamente y colocar en vortex por 10 segundos. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 50 ml. Repetir el proceso y verter en matraz dos veces más. Diluir el estándar a 50 ml con acetato de etilo. Transferir el estándar a un frasco ámbar, y cerrar lo más herméticamente posible. Almacenar en congelador. Registrar preparación de estándar en Registro RGG Estándar stock de Patulina 10 µg/ml en etanol: Estabilizar la solución madre de Patulina (7.2.1) a temperatura ambiente. Transferir 2.5 ml de esta solución a un matraz de 10 ml. Esta solución tendrá una concentración preliminar de 50 µg/ml. Registrar preparación de estándar en Registro RGG Verificar la concentración de este estándar por espectrofotometría según método AOAC Diluir con etanol la solución anterior a 10 µg/ml correctamente de acuerdo a la concentración determinada luego de la medición por espectrofotómetro UV. Transferir estándar stock a frasco ámbar y cerrar lo más herméticamente posible. Almacenar en refrigerador.
4 Página 4 de Estándar intermedio de Patulina de 1 µg/ml en etanol: Tomar 1 ml del estándar stock de 10 µg/ml (7.2.4) y diluir en matraz aforado a 10 ml con etanol. Transferir estándar stock a frasco ámbar y cerrar lo más herméticamente posible. Almacenar en refrigerador. Registrar preparación de estándar en Registro RGG PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN Preparar soluciones estándares de trabajo en un rango de 25 a 500 ng/ml transfiriendo con una micropipeta los microlitros correspondientes según la concentración del estándar intermedio (7.2.5), evaporar bajo corriente de nitrógeno y reconstituir inmediatamente con 1 ml de fase móvil. 7.4 PREPARACIÓN DE CONTROLES Se recomienda preparar un fortificado a partir de una muestra de un valor cercano a 50 ppb y/o al límite de cuantificación del método, o un material de referencia (remanente de ensayo interlaboratorio o material de referencia certificado) en cada lote de muestras analizadas. 7.5 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA O ETAPAS PREVIAS A REALIZAR LA MEDICIÓN Cuando se analizan concentrados de fruta, diluir la muestra con agua desionizada de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. En último caso, cuando se desconozca la dilución recomendada diluir el jugo a 11.5 ºBrix utilizando la siguiente formula: º Brix del concentrado x gramo de jugo a diluir = 11.5 ºBrix finales x 10 gramos finales Determinar los ºBrix del concentrado con un refractómetro, ingresar el valor a la fórmula y determinar los gramos de concentrado a diluir hasta 10 gramos de jugo diluido con agua Pesar 5 g de jugo de fruta en un tubo de centrifuga de 15 ml Agregar al tubo con muestra 5mL de solución extractante (Acetato de Etilo- Hexano 95:5) Agregar al tubo 0.5 g de Bicarbonato de Sodio Agitar y/o mezclar con Vortex por 2 minutos. Realizar esta etapa lo más rápidamente posible, debido a que la patulina es inestable en medio alcalino Centrifugar a 1500 RPM por 2 minutos Colocar en un vial de 4 ml 30 µl de ácido acético Transferir 3 ml de la capa superior del extracto centrifugado al vial con ácido.
5 Página 5 de Evaporar bajo corriente de nitrógeno sin calor Reconstituir en 300 µl de fase móvil (agua- acetonitrilo 97:3) en un vial de autosampler, poner vial en vortex e inyectar en el HPLC. 7.6 ANALISIS DE LA MUESTRA O REALIZACIÓN DE LA MEDICIÓN. CONDICIONES INSTRUMENTALES. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS Columna C18 5 μm, 4.6 x 150 mm Fase móvil: agua- acetonitrilo grado HPLC 97+3 con la siguiente gradiente (duración total de la corrida es de 45 minutos): Tiempo % Acetonitrilo % Agua minutos Flujo: 1 ml/min Longitud de honda: 275 nm Temperatura del horno: 25 ºC Volumen inyectado: 60 Μl 7.7 CÁLCULO DE RESULTADOS Identificación: Identificar la patulina comparando los tiempos de retención de las muestras con los de los estándares. La identidad de la patulina debe ser confirmada (Ejemplo: por análisis espectral) Cuantificación: Si la técnica se realiza sin modificaciones, la concentración de patulina en la muestra en μg/kg (ppb) corresponde a un décimo de la concentración entregada por la curva de calibración que da el equipo. En el caso de que se realicen modificaciones en la metodología, calcular el nivel de toxina en la muestra usando la siguiente fórmula:
6 Página 6 de 9 Concentración Patulina ng/g = C HPLC * (Vsext/P) * (Vrec/Vevp) Donde: C HPLC : Concentración entregada por el equipo para Patulina en ng/ml Vsext: Volumen de solución extractante (usualmente 5 ml) P: Peso de la muestra (usualmente 5g) Vrec: Volumen de reconstitución del extracto luego de la evaporación (Usualmente 0.3 ml) Vevp: Volumen que es extraído y evaporado (usualmente 3 ml) CONFIRMACIÓN En el caso de determinar que una muestra contiene una cantidad de patulina superior a la permitida por la reglamentación del Codex Alimentarius (50 ppb) se deberá confirmar su presencia si es posible por medio de GC/MS Derivatización: Para realizar la confirmación de patulina se debe realizar el tratamiento de la muestra tal como lo indicado anteriormente para HPLC hasta el punto de la evaporación (7.4.10). Luego de ello se deben seguir los siguientes pasos: Reconstituir el extracto en 300 µl de acetonitrilo y agitar en vortex Transferir 150 µl del extracto reconstituido a un vial de vidrio de 2 ml Agregar al vial 50 µl de derivatizador BSTFA Tapar, agitar y calentar por 15 minutos a 70 ºC en un calentador de bloque Enfriar e inyectar en GC/MS Preparar una solución estándar de calibración de 1.5 µg/ml en acetonitrilo. Esta solución puede ser preparada diluyendo 75 µl del estándar madre de 200 µg/ml en 10 ml con acetonitrilo en un matraz aforado. Para construir la curva de calibración, utilizar los volúmenes indicados por la tabla a continuación:
7 Página 7 de 9 Concentración de Patulina equivalente en jugo, en µg/l A Combinar las alícuotas en µl de lo siguiente en el vial en el que se derivatizará y mezclar: Solución de calibración de Patulina 1.5 µg/ml Acetonitrilo HPLC µg de Patulina en los 150 µl de solución a ser derivatizada: B A. Para jugo equivalente: 50 µg/l en jugo equivalen a 0.25 µg de patulina en una alícuota de 5 ml. Se asume que, los 0.25 µg completos son transferidos a los 5 ml de fase orgánica durante la extracción. La porción de 3 ml entrega 3/5 de los 0.25 µg, es decir, 0.15 µg. Se asume que, los 0.15 µg completos son recuperados luego de la etapa de secado con N 2, y resolubilizados en 300 µl. La alícuota utilizada para derivatizar de 150 µl por tanto, contiene µg de patulina. B. Para los estándares de calibración: Una alícuota de 50 µl del estándar de 1,5 µg/ml de patulina, contiene µg de patulina, a la cual el solvente es agregado para igualar el volumen de 150 µl. Luego, el jugo y la solución estándar de calibración son equivalentes Derivatizar los estándares, de la misma forma que las muestras, adicionándoles 50 µl de BSTFA, para un volumen final de 200 µl. Tapar, agitar y calentar por 15 minutos a 70 ºC en un calentador de bloque. Enfriar e inyectar en GC/MS Condiciones cromatográficas: - Energía de ionización: +70 ev. - Flujo de gas carrier (Helio): 1 ml/min. - Temperatura inyector: 280ºC. - Temperatura línea transferencia: 250ºC. - Modo y volumen de inyección: Splitless 2 µl. - Solvent delay: 6 minutos. - Rampa de temperatura: Temperatura inicial del horno 100 ºC por 2 minutos, rampa de 10 ºC/minuto a 200 ºC, y luego 200 ºC a 300 ºC, mantener por 3 minutos. - Columna GC: Columna capilar HP MS 5, fase enlazada 5%, 5% fenilmetilsilicona, 30 m * 0.25 mm d.i. * 0.25 µm.
8 Página 8 de 9 - Iones monitoreados: m/z 226, 211, 198, 183, 170, 155, 154 y 136 desde los 9 a los 11 minutos, y el m/z 183 hasta el final de la corrida a los 20 minutos. 7.8 ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DEL ENSAYO Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos realizados con el método de ensayo recogido en este procedimiento. Los controles de calidad quedan agrupados en tres niveles de control: a. Nivel I: Ensayos de intercomparación, según disponibilidad. b. Nivel II: Muestras fortificadas por el analista. 7.9 EXPRESIÓN DE RESULTADOS La forma como se expresan los resultados en el informe de ensayo es en ppb de Patulina. 8. CONTROL DE REGISTROS IDENTIFICACION RESPONSABLE TIEMPO RGG Registro preparación de soluciones estándares puros RG Registro de análisis de Toxinas Marinas y Micotoxinas Técnico y profesional del laboratorio Técnico y profesional del laboratorio ALMACENAMIENTO MEDIO SOPORTE LUGAR RESPONSABLE/ RECUPERACION 5 años Papel Laboratorio de Toxinas marinas y micotoxinas/ Carpeta 5 años Papel Laboratorio de Toxinas marinas y micotoxinas/ Cuaderno foliado DISPOSICION Picado en trozos, basura normal Picado en trozos, basura normal 9. CONTROL DE CAMBIOS VERSION FECHA PRINCIPALES PUNTOS MODIFICADOS RESUMEN DE MODIFICACIONES Se modifica documento a nuevo formato institucional Se incluye registro de estándares dentro del procedimiento Se especifican detalles en recepción y preparación de muestra
9 Página 9 de CUADRO DE RESPONSABILIDADES Responsabilidades con la ejecución del Método Ejecuta el método (Cargo) Técnico o Encargado de Laboratorio Elabora el informe de resultados (Cargo) Encargado de Laboratorio Aprueba el informe de resultados (Cargo) Jefe de Sección Química de Alimentos y Jefe de Subdepartamento 11. ANEXOS No Aplica
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