SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº. 5 / 93 METODOLOGÍA DE TRABAJO EN VIROSIS DE ESPECIES HORTÍCOLAS PARA SU APLICACIÓN A LA JUDÍA GRANJA ASTURIANA

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1 METODOLOGÍA DE TRABAJO EN VIROSIS DE ESPECIES HORTÍCOLAS PARA SU APLICACIÓN A LA JUDÍA GRANJA ASTURIANA SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº. 5 / 93 Instituto de Experimentación y Promoción Agraria.

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3 METODOLOGÍA DE TRABAJO EN VIROSIS DE ESPECIES HORTÍCOLAS PARA SU APLICACIÓN A LA JUDÍA GRANJA ASTURIANA AUTORA: ANA JESÚS GONZÁLEZ RODRÍGUEZ SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº. 5 / 93 PROGRAMA DE HORTOFLORICULTURA INSTITUTO DE EXPERIMENTACIÓN Y PROMOCIÓN AGRARIA

4 Edita: Consejería de Medio Rural y Pesca Instituto de Experimentación y Promoción Agraria D.L.: AS

5 Programa de Hortofloricultura. METODOLOGIA DE TRABAJO EN VIROSIS DE ESPECIES HORTICOLAS PARA SU APLICACION A LA JUDÍA GRANJA ASTURIANA. INTRODUCCION El objetivo es dar un repaso a las técnicas utilizadas habitualmente en virología vegetal para su posterior aplicación al programa de investigación que se está desarrollando sobre la judía granja asturiana en el Instituto de Experimentación y Promoción Agraria. Para lo cual se acudió al Departamento de Patología Vegetal de la Universidad Politécnica de Valencia (Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos) ya que la Dra. Concepción Jordá es una referencia obligada en el tema de las virosis que afectan a especies de hortícolas en España. INFORMACION Utilización de la técnica ELISA para el diagnóstico de virosis vegetales. Las técnicas inmunoenzimáticas ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) se utilizan profusamente tanto en sanidad humana como animal y vegetal por su alta sensibilidad, especificidad, rapidez, economía, y gracias a ellas se pueden realizar un gran número de análisis pues es fácilmente automatizable. Los inconvenientes que presenta, sin embargo, son que no siempre se encuentran comercializados los sueros necesarios y también que el diagnóstico de algunos virus, por su poder inmunogénico, es necesario comprobarlo por otras técnicas. Actualmente en la Cátedra de Patología Vegetal de la E.T.S.I.A. de la Universidad Politécnica de Valencia están utilizando la llamada ELISA-DAS (doble sandwich de anticuerpos) de forma sistemática para detección del virus del bronceado del tomate (TSWV) en la realización de un trabajo que pretende determinar si existe transmisión por semilla de dicho virus. Técnicas de inoculación de virus vegetales. La inoculación de virus se utiliza con varias finalidades: a) Mantenimiento de virus, puesto que son parásitos obligados. Sin embargo, simultáneamente se deben de mantener los virus mediante congelación a - 40oC, -80oC o bajo nitrógeno líquido, dependiendo del tipo de virus, puesto que tras repetidos pases de inoculación en huéspedes pueden cambiar algunas características virales; por tanto, es necesario conservar los "orígenes" en frío. b) Para identificación mediante su pase a plantas indicadoras, utilizado ya desde hace mucho tiempo. SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº 5 / 1993 IEPA / 1

6 Programa de Hortofloricultura c) Para caracterizar biológicamente los aislados. La inoculación puede ser mecánica, por injerto o por vectores. - Inoculación mecánica: Se realiza directamente sobre la planta, utilizando primero un abrasivo y pasando luego la suspensión del virus, en el tampón adecuado, por las hojas de la planta. - Inoculación por injerto: Se utiliza para virus sistémicos que no pueden transmitirse mecánicamente, cuando la planta donante y la receptora sean compatibles. En los casos en los que se hace transmisión como método de diagnóstico, se utiliza una planta receptora en la que se produzcan síntomas característicos, es decir, que actúe como planta indicadora. - Inoculación por vectores: Hay virus que no se pueden trasmitir mecánicamente y es necesario utilizar su vector natural. También se puede utilizar para regenerar virus que hayan sufrido sucesivos pases por inoculación mecánica. Para llevarla a cabo hay que tener en cuenta si el virus es persistente o no persistente pues el tiempo que debe estar en contacto la planta con el vector dependerá de esta característica. En la Cátedra de Patología Vegetal de la Universidad Politécnica de Valencia estaban realizando inoculaciones con vectores por ejemplo para comprobar cultivares resistentes al virus del amarilleo del melón. Técnicas de purificación de virus. En algunas ocasiones es necesario purificar el virus, por ejemplo cuando no se encuentra suero comercial y es necesario obtenerlo inoculando el virus en un animal de ensayo o bien cuando se precisa obtener sondas marcadas para realizar el diagnóstico por hibridación de ácidos nucléicos; esto último es lo que estaban realizando en la Universidad Politécnica para el caso del Tomato yellow leaf curl virus o virus del enrollamiento en hoja de cuchara del tomate (TYLCV). Observación de virus por microscopía electrónica. Por observación al microscopio electrónico se puede conocer la forma de un virus, lo que constituye una ayuda importante para "orientar" el diagnóstico y también para corroborar el realizado por serología, aunque no se puede basar un diagnóstico sólo en la observación microscópica. En el caso de los virus esféricos la observación al microscopio electrónico plantea más problemas, pues tienen un aspecto similar al de los ribosomas y podrían ser confundidos fácilmente. Posibles aplicaciones al caso de la judía en Asturias. Abordar el diagnóstico de virosis podría tener importantes repercusiones en el programa de trabajo a realizar en judía. a) Obtención de semilla pre-base libre de virus. Para eliminar el virus del mosaico común de la judía (BCMV) de las semillas, se podrían cultivar las plantas en invernadero utilizando mallas anti-pulgones y aplicando los tratamientos fitosanitarios adecuados. Durante todo el cultivo se realizarían controles de todas las plantas cada 15 días eliminando tanto las que resultasen positivas como las dudosas en el análisis de BCMV. Una vez obtenida semilla de planta sana, sería necesario multiplicarla de forma adecuada para que no se infecte. Este es quizá el punto más conflictivo pues sería necesario buscar las SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº 5 / 1993 IEPA / 2

7 Programa de Hortofloricultura condiciones para que no se de la enfermedad o bien seguir cultivando en invernadero pero en mayor extensión. El inconveniente del método sería que sólo se puede conservar la semilla libre de BCMV si se mantiene un suministro continuado de semilla sana a los agricultores, pues en el momento en que esa semilla se siembra en los campos es susceptible de ser infectada de nuevo. b) Como apoyo al programa de Mejora Genética para chequear los híbridos obtenidos. c) Puesta a punto de un método de certificación de semillas de judía para BCMV. Este es un trabajo laborioso pero muy importante para realizar los análisis de virosis en lotes de semillas. Para llevarlo a cabo habría que estudiar primero la transmisibilidad por semilla del virus lo que se determinaría por el análisis de, al menos, semillas procedentes de plantas que hayan sido infectadas en los primeros estadíos del desarrollo. También habría que determinar la sensibilidad del test ELISA para análisis agrupados de varias muestras. Por último, como resolución de un problema estadístico, una vez conocida la premisa del porcentaje de transmisibilidad, se determinaría el "tamaño mínimo de muestra". SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº 5 / 1993 IEPA / 3

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10 Instituto de Experimentación y Promoción Agraria Programa de Difusión y Transferencia de Tecnología Agraria Aptdo Villaviciosa Asturias (España) Telf Fax:

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