Biomarcadores moleculares y genómica en los sarcomas

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1 Biomarcadores moleculares y genómica en los sarcomas Jesús García-Foncillas SARCOMAS DEL ESTROMA GASTROINTESTINAL (GIST) c-kit (CD117) CD34 RUTINARIO RECOMENDABLE Mutaciones c-kit Mutaciones PDGFR-alfa DOG1.1 EVIDENCIA INSUFICIENTE EL c-kit (CD117) Métodos de medición Como método de determinación se utiliza la inmunohistoquímica. La técnica recomendada para c-kit es la inmunohistoquímica (IHC). Además, existe una alta tasa de correlación entre la determinación de la expresión del c-kit por IHC entre el laboratorio local y la determinación en un laboratorio central (1). Utilidad clínica Tiene valor diagnóstico, pronóstico y predictivo. En la última década se ha producido una evolución rápida en el diagnóstico y el manejo de los sarcomas y especialmente en los tumores del estroma gastrointestinal (GIST). Antes de los 80, los GIST constituían un grupo de tumores del músculo liso que se clasificaban en leiomiomas, leiomiosarcomas y leiomioblastomas. Con el desarrollo de la inmunohistoquímica se observó que los GIST a menudo mostraban evidencia fenotípica que no correspondía a una diferenciación de músculo liso con características, en ocasiones, de diferenciación neural, mixta o fenotipos nulos. El término genérico GIST ganó un amplio uso. En este trabajo los autores demostraron que los GIST eran normalmente positivos inmunohistoquímicamente para la proteína KIT. De esta manera, varios otros investigadores confirmaron el uso de la inmunotinción para KIT en el diagnóstico del GIST. La inmunohistoquímica de c-kit ha llegado a ser crítica para el diagnóstico diferencial de los tumores mesenquimales del tracto gastrointestinal. KIT constituye un marcador específico y altamente sensible en este contexto. Más del 95% de los GIST son positivos para KIT, mientras que la fibromatosis dermoide, los leiomiomas, los leiomiosarcomas y los schawanomas son mayoritariamente siempre negativos. La inmunohistoquímica de c-kit no tiene valor pronóstico ni predictivo en el manejo de los GIST, restringiéndose su papel al diagnóstico. 1

2 Marcadores moleculares y Genómica en Oncología RECOMENDACIÓN La inmunohistoquímica de c-kit debe realizarse en el diagnóstico de todos los sarcomas donde se sospecha, como posibilidad, un GIST. EL CD34 Métodos de medición Como método de determinación se utiliza la inmunohistoquímica. Además, existe una alta tasa de correlación entre la determinación de la expresión del CD34 por IHC entre el laboratorio local y la determinación en un laboratorio central (2). Utilidad clínica: valor diagnóstico, pronóstico y predictivo Se ha comprobado que CD34, el marcador positivo más útil en GIST antes del KIT, es positivo en el 70-80% de estos tumores, mientras que muy pocos tumores del músculo liso son positivos. Es un marcador característico de las células hematopoyéticas, así como de algunas células de estirpe fibroblástica en la matriz de algunos tumores. Los tumores GIST del esófago y del recto expresan con más frecuencia positividad para CD34 que los tumores de localización gástrica o a nivel del intestino delgado. La expresión de CD34 suele ser recíproca con la expresión de la actina del músculo liso (SMA). La inmunohistoquímica de CD34 no tiene valor pronóstico ni predictivo en el manejo de los GIST, restringiéndose su papel al diagnóstico. RECOMENDACIÓN La inmunohistoquímica de CD34 debe realizarse en el diagnóstico de todos los sarcomas donde se sospecha como posibilidad un GIST. MUTACIONES EN EL GEN C-KIT El gen C-KIT, localizado en el cromosoma 4q12, presenta un tamaño de 70 Kb con 21 exones que dan lugar a un ARNm de 5230 bp y codifica para una proteína glucosilada con actividad tirosincinasa de 145 kda. Contiene un dominio extracelular con homología a la estructura de las inmunoglobulinas, un dominio transmembrana y un dominio yuxtamembrana con dos subdominios: uno de unión al ATP (región casete de unión al ATP) y un lugar catalítico, donde se produce la fosfotransferencia. La activación de la proteína c-kit promueve a su vez, por transfosforilación, la activación de la fofatidilinositol 3 cinasa. Método de evaluación El análisis de las mutaciones del gen c-kit requiere amplificación por PCR de los exones con cebadores intrónicos, y una posterior reacción de secuenciación y electroforesis en gel de poliacrilamida o capilar. Utilidad clínica: valor pronóstico y predictivo Al menos el 85% de los GIST tienen mutaciones activadoras en el gen KIT, la mayoría de los cuales, hasta un 70%, ocurren en el dominio yuxtamembrana (exón 11). Un significativo subconjunto, alrede- 2

3 INFORMACIÓN POR TUMORES BIOMARCADORES MOLECULARES Y GENÓMICA EN LOS SARCOMAS dor de uno 15%, presentan mutaciones en el dominio extracelular (exón 9), mientras que las mutaciones en los dominios de actividad cinasa (exón 13-17) son poco frecuentes (menor al 5%). Los tumores GIST con mutaciones en el exón 9 tienen, como origen, casi exclusivamente el intestino delgado. Distintos estudios han sugerido que la presencia de mutaciones en el gen KIT se correlaciona con un comportamiento más agresivo, mientras que otros autores han encontrado que las mutaciones en KIT son eventos frecuentes incluso en los tumores GIST pequeños, hallados incidentalmente y de curso aparentemente benigno. Por tanto, estas mutaciones en el gen KIT podrían constituir un evento iniciador en la tumorogénesis y no predecir en sí mismas un comportamiento más agresivo (3). El tratamiento de los pacientes con GIST avanzado se ha revolucionado con la introducción del imatinib, que ha mostrado una significativa eficacia en el tratamiento de los pacientes con enfermedad metastásica. Aproximadamente más del 80% de estos pacientes experimentan una respuesta clínica objetiva al imatinib en términos de respuesta parcial o estabilización. Estudios de fase-ii y III han demostrado tasas de respuesta objetiva y supervivencias libres de progresión en los pacientes con tumores irresecables y/o metastásicos. En febrero de 2002, la FDA aprobó el imatinib para el tratamiento de pacientes con GIST metastásico y/o irresecables positivos para c-kit (CD117) (4). La dosis de inicio sugerida de imatinib era de 400 mg por día. No obstante, un aumento en la supervivencia libre de enfermedad se observó en los pacientes con dosis más altas (800 mg/día). Los pacientes con mutación en el exón 11 del gen KIT muestran un mayor beneficio con el tratamiento basado en imatinib, con aproximadamente un 85% de tasa de respuesta. La supervivencia libre de progresión es significativamente más larga para los pacientes con GIST que presentan mutación en el exón 9 del gen KIT cuando el imatinib se administra a la dosis de 800 mg diarios. Algunos datos preliminares sugieren que los GIST con mutación en el exón 9 del gen KIT pueden ser más sensibles a sunitinib que aquellos con mutación en el exon11 del KIT (5). Recientes datos avalan el uso de imatinib a la dosis de 800 mg por día en los pacientes con mutaciones en el exón 9 del gen que codifica para KIT. En un estudio aleatorizado en fase III de la EORTC, el tratamiento con altas dosis de imatinib mostró un incremento significativo en la supervivencia libre de progresión con una reducción del riesgo relativo del 61% (p = 0,0013), en pacientes cuyos tumores mostraban mutación en el exón 9 del gen KIT. A los pacientes con GIST avanzados, que no manifiestan respuesta clínica al imatinib, se les ha etiquetado como resistencia primaria. Por el contrario, la resistencia secundaria hace referencia a los pacientes que han experimentado una respuesta inicial seguida de una progresión subsecuente de la enfermedad, la cual ocurre en la mayoría de los pacientes de GIST tratados con imatinib, frecuentemente después de dos años. La resistencia primaria puede aparecer en pacientes cuyos tumores manifiestan determinadas mutaciones específicas en el gen KIT o en el PDGFRA, que provocan oncoproteínas que son resistentes a la inhibición por imatinib o en la ausencia de mutaciones en estos genes. En la mayoría de los casos de resistencia secundaria, se ha detectado una segunda mutación en el gen KIT en adición a la mutación oncogénica primaria en el dominio cinasa, lo cual lleva a una resistencia al tratamiento con imatinib, como ocurre en las mastocitosis sistémicas. En algunos casos, se pueden producir múltiples mutaciones secundarias en el gen KIT, sugiriendo que la exposición a este fármaco conduce a la selección de clones resistentes (6). El sunitinib, un inhibidor tirosincinasa de segunda generación, se ha aprobado recientemente para los pacientes en que falla el imatinib. Aunque el sunitinib prolonga significativamente la supervivencia, la mejor respuesta es generalmente la estabilización del tratamiento. Algunos pacientes desarrollan resistencia primaria al imatinib y en otros la resistencia llega a ser evidente después de varios meses, al tiempo que la enfermedad progresa. Sunitinib (SU11248) constituye un inhibidor tirosincinasa multidiana que puede inducir respuestas objetivas y controlar la enfermedad en progresión en los pacientes con GIST resistente a imatinib. 3

4 Marcadores moleculares y Genómica en Oncología En un estudio placebo aleatorizado controlado en fase-iii, sunitinib aportó un claro beneficio clínico significativo en los pacientes resistentes o con intolerancia a imatinib. En los pacientes resistentes a imatinib, sunitinib mostró una mejoría significativa en la mediana de tiempo de progresión (27,3 versus 6,4 semanas) y una significativa mayor supervivencia global. El tratamiento con sunitinib indujo respuesta parcial en 14 pacientes (6,8%) y estabilización (22 semanas o más) en 36 pacientes (17,4%) versus no respuesta parcial y enfermedad estable en dos pacientes en el brazo de placebo (1,9%). En el grupo de intolerancia al imatinib, 4/9 pacientes, aleatorizados a sunitinib, alcanzaron respuesta parcial con progresión de la enfermedad sólo en un paciente. Por el contrario, 3 de los 4 pacientes aleatorizados a placebo mostraron progresión de la enfermedad en el momento del análisis y no se observó respuesta parcial. La tolerancia a sunitinib fue correcta, por lo que, en enero de 2006, recibió la aprobación de la FDA para el tratamiento de los tumores GIST después de la progresión de la enfermedad o de intolerancia al imatinib. MUTACIONES EN EL GEN PDGFR-ALFA (PDGFRA) El gen PDGFRA, localizado en el cromosoma 4q12, presenta un tamaño de 65 Kb con 23 exones que da lugar a un ARNm de 5300 bp y que codifica para una proteína glucosilada con actividad tirosincinasa de 140 kda. Contiene un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular con dos subdominios: uno de unión al ATP (región casete de unión al ATP) y un lugar catalítico donde se produce la fosfotransferencia. La activación de la proteína PDGFRA promueve, a su vez, por transfosforilación la activación de la fofatidil-inositol 3 cinasa. Utilidad clínica: valor pronóstico y predictivo Un pequeño subconjunto de los GIST, en torno a un 5-10%, presentan mutaciones en el receptor tirosincinasa homólogo PDGFRA. La mayoría ocurren en el segundo dominio cinasa (exón 18, 85%), aunque dos tercios de estos son mutaciones puntuales D842V, el cual se caracteriza por una clara resistencia al imatinib. Mucho menos frecuente son las mutaciones en el exón 12 en el dominio yuxtamembrana o en el exón 14 (primer dominio cinasa). Prácticamente la mayoría de los tumores GIST con PDGFRA mutado ocurren en el estómago, omento o mesenterio, y muestran una morfología epitelioide. La expresión de KIT en los tumores GIST con PDGFRA mutado, a menudo, es débil, focal o enteramente negativa, lo cual puede conducir a dificultades en la confirmación de su diagnóstico sin un adecuado análisis mutacional. Los GIST, con PDGFRA mutado, muestran similitudes a los GIST con KIT mutado en términos de activación de las vías similares de transducción de señal, así como a nivel de cambios citogenéticos. Entre un 5% y un 10% de los tumores GIST no presentan o no se detectan mutaciones en el gen KIT o en el gen PDGFRA, respectivamente, siendo denominados GIST nativos. Incluso en estos casos de tumores nativos se muestran una extensa inmunopositividad para KIT, así como su correspondiente activación por fosforilación a través de otros eventos moleculares, indicando que la señalización mediada por KIT juega un papel biológico esencial en estos tumores (7). Por el contrario, los tumores GIST con mutación D842V en el exón 18 del gen PDGFRA no muestran respuesta a imatinib, mientras que otras mutaciones dan lugar a una respuesta variable (8). Método de evaluación El análisis de las mutaciones del gen c-kit requiere amplificación por PCR de los exones con cebadores intrónicos, posterior reacción de secuenciación y electroforesis en gel de poliacrilamida o capilar. 4

5 INFORMACIÓN POR TUMORES BIOMARCADORES MOLECULARES Y GENÓMICA EN LOS SARCOMAS EL DOG1.1 Como métodos de determinación se utilizan la inmunohistoquímica y la PCR en tiempo real. La técnica recomendada es la inmunohistoquímica (IHC). Utilidad clínica: valor diagnóstico, pronóstico y valor predictivo Este marcador fue el resultado de un estudio de expresión génica masiva donde se detectó su expresión en el 97,8% de los GIST. En los casos donde la expresión de c-kit, CD34 o PDGFRA es dudosa, la detección de la expresión de este marcador, mediante inmunohistoquímica o PCR en tiempo real, puede ayudar a concretar el diagnóstico en situaciones de duda por ausencia de expresión del resto de los posibles marcadores diagnósticos (9). SARCOMAS DE PARTES BLANDAS RUTINARIO RECOMENDABLE Translocaciones cromosómicas específicas (en caso de dudas de tipo histológico) EVIDENCIA INSUFICIENTE Detección de transcritos de fusión específicos en sangre periférica (en caso de dudas de tipo histológico) Translocaciones cromosómicas específicas Tumor Translocación Fusión Incidencia ES/PNET t(11;22)(q24;q12) EWS-FLI1 85 ES/PNET t(21;22)(q22;q12) EWS-ERG 10 ES/PNET t(7;22)(p22;q12) EWS-ETV1 Rara ES/PNET t(17;22)(q12;q12) EWS-E1AF Rara ES/PNET t(2;22)(q33;q12) EWS-FEV Rara DSRCT t(11;22)(p13;q12) EWS-WT1 95 Liposarcoma mixoide t(12;16)(q13;p11) TLS-CHOP 95 Liposarcoma mixoide t(12;22)(q13;q12) EWS-CHOP 5 Condrosarcoma extraesquelético mixoide t(9;22)(q22;q12) EWS-CHN 75 Melanoma maligno de partes blandas t(12;22)(q13;q12) EWS-ATF1 ND Sarcoma sinovial t(x;18)(p11.23;q11) SYT-SSX1 65 Sarcoma sinovial t(x;18)(p11.21;q11) SYT-SSX2 35 RMS alveolar t(2;13)(q35;q14) PAX3-FKHR 75 RMS alveolar t(1;13)(p36;q14) PAX7-FKHR 10 DFSP t(17;22)(q22;q13) COL1A1-PDGFB ND Fibrosarcoma congénito y nefroma mesoblástico t(12;15)(p13;q25) ETV6-NTRK3 ND ES: sarcoma de Ewing; PNET: tumor neuroectodérmico primitivo; DFSP: dermatofibrosarcoma protuberans; DSRCT: tumor desmoplásico de células pequeñas redondas; ND: no determinado; RMS: rabdomiosarcoma. 5

6 Marcadores moleculares y Genómica en Oncología Métodos de medición Como método de determinación se puede utilizar: la RT-PCR en tiempo real con sondas fluorescentes específicas para cada translocación. También se puede utilizar la RT-PCR anidada con una segunda ronda de amplificación con cebadores internos sobre el amplicón de la primera reacción de PCR. Se utilizan la RT-PCR estándar con electroforesis en gel de acrilamida o de agarosa, y la FISH con sondas específicas. La técnica de detección recomendada es la RT-PCR en tiempo real con sondas fluorescentes específicas para cada translocación. Utilidad clínica: valor diagnóstico, pronóstico y predictivo Las translocaciones cromosómicas son actualmente necesarias para el correcto diagnóstico histológico de estas neoplasias. Tienen por tanto un valor diagnóstico (10). Algunos estudios están reportando que algunas variantes de transcritos de fusión podrían tener un valor pronóstico diferente, pero no hay datos suficientes que ratifiquen estos resultados. En el caso de los sarcomas de Ewing con translocación EWS/FLI1, el tipo 1 de transcrito de fusión podría identificar pacientes con mejor supervivencia y menor probabilidad de recurrencia que los pacientes con transcrito tipo 2 (11). Se deben realizar transcritos de translocaciones específicas en sangre periférica. TRANSCRITOS DE FUSIÓN ESPECÍFICOS La detección de determinados transcritos específicos de las translocaciones cromosómicas, que definen a cada sarcoma, puede ser eficaz para la diagnóstico precoz de recurrencia de la enfermedad. Esto se ha evaluado en el caso concreto de los sarcomas de Ewing/tumores neuroectodérmicos, tumores desmoplásicos de células redondas y en los rabdomiosarcomas. Utilidad clínica: valor pronóstico y predictivo Distintos estudios han mostrado que la detección de transcritos específicos en sangre periférica puede indicar un peor pronóstico o una mayor probabilidad de recidiva de la enfermedad. Por otra parte, la presencia de transcritos en los productos de las células hematopoyéticas de soporte, en pacientes sometidos a tratamiento con altas dosis de quimioterapia, se ha correlacionado con una mayor probabilidad de recaída tras el tratamiento (12). BIBLIOGRAFÍA 1. Yamaguchi M, Tate G, Endo Y, Miyaki M. Immunohistochemistry and c-kit gene analysis in determining malignancy in gastrointestinal stromal tumors. Hepatogastroenterology 2003; 50 (53): Badalamenti G, Rodolico V, Fulfaro F, et al. Gastrointestinal stromal tumors (GISTs): focus on histopathological diagnosis and biomolecular features. Ann Oncol 2007; 18 Suppl 6: vi136-vi Zhu MJ, Ou WB, Fletcher CD, Cohen PS, Demetri GD, Fletcher JA. KIT oncoprotein interactions in gastrointestinal stromal tumors: therapeutic relevance. Oncogene 2007; 26 (44): McAuliffe JC, Lazar AJ, Yang D, et al. Association of intratumoral vascular endothelial growth factor expression and clinical outcome for patients with gastrointestinal stromal tumors treated with imatinib mesylate. Clin Cancer Res 2007; 13 (22 Pt 1): Nilsson B, Sjolund K, Kindblom LG, et al. Adjuvant imatinib treatment improves recurrence-free survival in patients with high-risk gastrointestinal stromal tumours (GIST). Br J Cancer 2007; 96 (11): Nishida T, Kanda T, Nishitani A, et al. Secondary mutations in the kinase domain of the KIT gene are predominant in imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumor. Cancer Sci 2008; 99 (4):

7 INFORMACIÓN POR TUMORES BIOMARCADORES MOLECULARES Y GENÓMICA EN LOS SARCOMAS 7. Wardelmann E, Buttner R, Merkelbach-Bruse S, Schildhaus HU. Mutation analysis of gastrointestinal stromal tumors: increasing significance for risk assessment and effective targeted therapy. Virchows Arch 2007; 451 (4): Tabone-Eglinger S, Subra F, El SH, et al. KIT mutations induce intracellular retention and activation of an immature form of the KIT protein in gastrointestinal stromal tumors. Clin Cancer Res 2008; 14 (8): West RB, Corless CL, Chen X, et al. The novel marker, DOG1, is expressed ubiquitously in gastrointestinal stromal tumors irrespective of KIT or PDGFRA mutation status. Am J Pathol 2004; 165 (1): Ludwig JA. Ewing sarcoma: historical perspectives, current state-of-the-art, and opportunities for targeted therapy in the future. Curr Opin Oncol 2008; 20 (4): de AE, Kawai A, Healey JH, et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing s sarcoma. J Clin Oncol 1998; 16 (4): Yaniv I, Cohen IJ, Stein J, et al. Tumor cells are present in stem cell harvests of Ewings sarcoma patients and their persistence following transplantation is associated with relapse. Pediatr Blood Cancer 2004; 42 (5):