ECOLOGÍA MICROBIANA Y COMPORTAMIENTO BACTERIANO COMUNITARIO

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1 5 TRABAJO PRÁCTICO ECOLOGÍA MICROBIANA Y COMPORTAMIENTO BACTERIANO COMUNITARIO OBJETIVOS: 1 Observar y comprender la diversidad bacteriana que coexiste en un mismo nicho en un dado ecosistema y las interrelaciones que entre ellas ocurren mediante el empleo de la Columna de Winogradsky. 2 Introducir al alumno en el concepto de comportamiento bacteriano social mediante el estudio de los fenómenos conocidos como formación de biofilms, swarming y formación de cuerpos fructíferos. Construcción de la columna de Winogradsky. (se realiza durante Clase 2. Trabajo Práctico N 1). A) Materiales : Tubos de vidrio de aproximadamente 50 cm. de longitud o botellas plásticas de agua mineral o soda de 1.5 lts. En el caso de tratarse de botellas plásticas, cortar la parte correspondiente al pico. Fuente de luz incandescente. Drogas: SO 4 Ca, CO 3 Ca, PO 4 HK 2 (Se puede utilizar huevo duro y tiza) Papel de filtro o residuos vegetales. Fango proveniente de pantano, zanja o río como fuente de inoculo. (Se aconseja una zona del río con aguas estancadas) B) Procedimiento por grupo: Colocar 1.6 kgr. de inóculo en el interior una de las botellas. Adicionar: 16 gr. de CO 3 Ca 16 gr. de SO 4 Ca 16 gr. de PO 4 HK 2

2 trozos de papel de filtro o papeles vegetales Mezclar bien. Dividir la mezcla en dos botellas y aprisionar bien el fango evitando que queden burbujas de aire entrampadas. Completar con agua de canilla hasta aproximadamente la ¾ partes de tubo, vertiéndola suavemente contra las paredes a fin de evitar remover el barro. Controlar periódicamente el nivel de agua durante el desarrollo de la experiencia. Proceder a tapar las columnas con tapones de algodón. Colocar a las dos botellas al abrigo de la luz (tapar con papel de diario) durante el lapso de una semana. Al término de este tiempo, destapar una de las botellas y exponerla a la acción de una fuente de luz incandescente en forma permanente. Incubar las columnas a una temperatura de aproximadamente de 25 o C. Observar periódicamente y tomando pormenorizada nota de los cambios desencadenados en cada una de las columnas para su posterior interpretación, anotando los cambios observados en la tabla a continuación Se aconseja además fotografiar. Semana Cambios macroscópicos observados Ubicación en la columna Proceso metabólico y/o químico Fotografía

3 6 7 8 Día 1: Para algunos de los experimentos se utilizarán las cepas de Bacillus subtilis natto, 3610, Marburg y JH642. B. subtilis 3610, natto y MARBURG son cepas salvajes. Esto quiere decir que han sido incorporadas al laboratorio recientemente y mantienen las características fenotípicas y funcionales que exhibían en la naturaleza. B. subtilis JH642 es una cepa domesticada, esto quiere decir que desde hace muchos años se repica en condiciones de laboratorio. Es por ésto que muchas de estas cepas pierden características fenotípicas y funcionales útiles en la naturaleza, debido a que dejan de ser necesarias en las condiciones de laboratorio. Grupo 1 y 4: Cuerpos fructíferos. Preparar 1 placa de medio agar Casoy suplementado con 4% de extracto de levadura y una placa de LB suplementado con 4% de extracto de levadura. Secar bien las placas en la estufa (será entregada por los ayudantes). Inocular en cada una de las placas 2 µl de cada uno de los cultivos ON de las siguientes bacterias (serán entregados por los ayudantes): 1 B. subtilis B. subtilis MARBURG 3 B. subtilis JH642 4 B. subtilis natto Incubar en estufa a 37 ºC por 24 48hs (el medio hacia arriba). Grupo 2: Swarming. Preparar 3 placas de LB agar 0,7%. Secar las placas (no excesivamente porque sino las bacterias no corren; serán entregadas por los ayudantes). Inocular en el centro de cada

4 placa 2µl de cultivo ON (serán entregados por los ayudantes) de las siguientes bacterias: 1 B. subtilis 3610 (salvaje) 2 B. subtilis MARBURG (salvaje) 3 B. subtilis JH642 (domesticada) Incubar en estufa a 37ºC por 24 hs (las placas se deben incubar con el medio hacia abajo para evitar que se caiga el medio). Grupo 3: Formación de biofilms. Inocular con 10 μl de cultivo ON de las bacterias (serán entregados por los ayudantes) detalladas a continuación, en tubos de hemólisis conteniendo 1 ml de LB estéril (serán entregados por los ayudantes). 1 B. subtilis B. subtilis MARBURG 3 B. subtilis JH642 4 B. subtilis natto Incubar sin agitación en estufa a 37 C. Todos los grupos: Análisis de la columna de Winogradsky. 1 Observar y discutir los cambios macroscópicos que fueron observando en la columna a lo largo de los laboratorios. 2 Tomar muestras de distintas regiones interesantes de la columna utilizando pipetas Pasteur y espátulas. Observar al microscopio óptico. 3 Colocar las columnas adentro de palanganas y extraer muestras perforando las columnas con la ayuda de jeringas y agujas. Observar al microscopio óptico. Día 2: Observar y discutir con la comisión entera los resultados de los experimentos de cuerpos fructíferos y swarming. Formación de biofilms:

5 1 Observar a simple vista la existencia de biofilms en la interfase líquido aire en cada caso. 2 Retirar cuidadosamente el líquido utilizando pipetas Pasteur y observar la presencia de películas adheridas al vidrio. 3 Efectuar 3 lavados con agua destilada, escurrir bien y agregar 1 ml de solución de cristal violeta 0,1%. 4 Incubar 10 min. 5 Lavar 3 veces con agua destilada. 6 Observar resultados. CUESTIONARIO GUIA 1 Qué ventajas y desventajas encuentra usted en el uso de columnas de vidrio para el desarrollo de éste trabajo? 2 Cuál es la importancia de la selección de una fuente de luz incandescente?. Puede ser sustituida por otra fuente lumínica? 3 Cuál es el rol que cumple cada droga (incluído el papel de filtro) incorporado por usted en el desarrollo del ecosistema?. Es posible prescindir de alguna de ellas?. Justifique. 4 Qué conveniencia le asigna usted al origen del inóculo utilizado?. Explique probables consecuencias del uso de muestras provenientes de aguas de libre curso. 5 Por qué es necesario mantener el nivel de agua de los tubos por encima de la mitad de la longitud de los mismos?. 6 Las precauciones que tuvo que tener en cuenta para el armado de las columnas cumplen objetivos determinados. Cuáles cree usted que son éstos? 7 Qué ventajas encuentra usted al hecho de mantener con tapones a los tubos durante todo el desarrollo de la experiencia? 8 Qué gravitación hubiese tenido no dejar todas las columnas al abrigo de la luz durante 7 días, según lo indicado por la guía? 9 Fue factible para usted explicarse de manera coherente cada transformación ocurrida en el ecosistema que ha analizado? 10 Por qué es aconsejable siempre una primera siembra en medios líquidos, para recién luego pasar a medios de cultivo agarizados?

6 11 Es importante el criterio de selección del material que se usa en cualquier experiencia. Cree usted que existen ventajas en la utilización de tubos de ensayo y de frascos de penicilina, en forma diferencial para aerobios y anaerobios? 12 Qué efectos le asigna a la presencia de oxígeno en el medio de cultivo de un microorganismo anaerobio estricto? Para la siembra que usted realizó de tales microorganismos debió tener presente este factor. Puede el manejo técnico ser la causa de la inviabilidad de los mismos? 13 Qué criterio siguió usted para la selección de la fuente de luz, en lo que respecta a la cantidad y calidad de la misma para cada microorganismo en cuestión? 14 Defina medio de enriquecimiento. Discutir columna de winogradsky en este contexto. 15 Qué son los biofilms?. Qué beneficios que otorgan a las bacterias?. 16 Cuál es la diferencia entre el swarming y el nado bacteriano? 17 Mediante qué proceso es en general regulado el comportamiento bacteriano social?. Cómo funciona a nivel molecular? 18 Defina cuerpos fructíferos. Qué ventajas otorga a las bacterias este modo de especialización? Videografía: Swarming: Biofilms Cuerpos fructíferos

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