MALARIA EIA TEST KITS

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1 Product Code: MALARIA EIA TEST KITS For the detection of antibodies to: Plasmodium falciparum Plasmodium vivax Plasmodium ovale Plasmodium malariae Newmarket Laboratories Ltd Lanwades Business Park, Kentford, Newmarket, CB8 7PN UK Tel: + 44 (0) Fax: + 44 (0) info@newlabs.co.uk web:

2 GB Newmarket Laboratories Ltd, Malaria EIA test (96 wells Product Code 60089, 480 wells Product Code 60090) kits Kits for the qualitative and semi-quantitative detection of antibodies to P.falciparum, P.vivax, P.ovale and P.malariae in human serum or plasma by Enzyme-Linked Immunoassay Clinical Background Malaria is one of the most common diseases in the world. More than half the world population lives in malariainfected areas. Over 200 million cases annually result in up to 3 million deaths each year; a majority of which are in young children. In non-endemic areas, it is one of the most important imported diseases, resulting in a number of deaths in late-diagnosed or unsuspected cases each year. The disease is caused by protozoa of the genus Plasmodium, transmitted by the bite of the female Anopheles mosquito. There are four species causing human malaria: P.falciparum, P.vivax, P. malariae, and P. ovale. The disease may also be transmitted by transfusion of infected blood. Once in the blood the sporozoite makes its way to the liver where for the next 2 weeks merozoites are produced. These are released into the blood where they invade the red cells and produce more merozoites, causing the cells to rupture. It is this rupturing that is responsible for the clinical symptoms. Of the four species, P. falciparum is the most common and the most virulent, causing most malaria-related deaths. P. vivax is the next most common cause of malaria. Although rarely fatal, this form of malaria can be accompanied by severe clinical symptoms. It is a common cause of malaria in S.E. Asia and S. America. People infected with Plasmodium spp. form antibodies in response. The Newmarket Laboratories MALARIA EIA kit is designed to detect antibodies occurring in subjects infected with P.falciparum, P.vivax, P.ovale and P.malariae Intended Use These kits are intended for use by appropriately trained and qualified personnel for the detection of antibodies to P.falciparum, P.vivax, P.ovale and P.malariae in human serum and plasma. Principle of the test Malaria EIA 96 and 480 test kits use four recombinant antigens in a sandwich test to produce a test that is both highly specific and sensitive. The antigens will detect P.falciparum, P.vivax, P.ovale and P.malariae - specific IgG, IgM, and IgA; enabling the test to detect antibodies during all stages of infection. All reagents except the Conjugate and Wash solution are supplied ready to use and colour-coded, and the procedure uses undiluted samples and standard volumes for ease of both manual and automated use. The assay can be used with both serum and plasma. The plastic wells are coated with a mixture of P. falciparum and P. vivax recombinant antigens. The antigenic similarity between Plasmodium species means that antibodies to all species can be detected. Specific antibodies in serum or plasma specimens combine with these antigens and with the same antigens conjugated to horseradish peroxidase, when conjugate is added to a well in which the specimen has been incubated. After unreacted material has been removed by washing, the presence of bound enzyme indicating the presence in the specimen of specific antibodies is revealed by a colour change in the substrate/chromogen mixture. The intensity of the colour is compared to that in control wells to determine the presence or absence of specific antibody. 2

3 Kit Contents R1 Plate (96 wells in 12 strips of 8), Polystyrene coated with recombinant antigens (96 tests) 5 (480 tests) R2 Positive control Human serum Red 1.5 ml 1.5 ml R3 Negative control Human serum Yellow 2.0 ml 2.0 ml R4 Conjugate Recombinant antigens conjugated to horseradish peroxidase Purple 0.8 ml 3 ml R5 Conjugate dilution buffer Buffered saline containing surfactant and stabilisers Green 8 ml 30 ml R6 Substrate Urea peroxide and tetramethyl benzidine Pink 7 ml 30 ml R7 Wash (20 x concentrated) Saline containing surfactant Colourless 125 ml 2 x 125 ml R8 Stop 0.5M H 2 SO 4 Colourless 7 ml 30 ml Bag for storing unused wells. Directions for use Warnings and precautions For in - vitro diagnostic use only. The control materials supplied are derived from human serum. They have been tested at donor level and found negative for Hepatitis B and C, and for HIV 1 and 2. However, they should be treated as if capable of transmitting disease. Specimens of human serum and plasma should be treated as microbiologically hazardous, and handled in accordance with the applicable regulations. Do not use the kit after its expiry date. Do not combine or interchange reagents from kits with different lot numbers. Storage Store at 2 8 C when not in use. Store bottles upright. Do not freeze. Do not expose substrate to direct sunlight. Diluted conjugate is stable for 4 weeks at 4 C Diluted wash buffer is stable for 4 weeks at 4 C Unused coated strips are stable for 4weeks at 4 C if stored in the re-sealable bag provided. 3

4 Equipment required Properly calibrated and maintained pipetting devices capable of delivering volumes of 50 microlitres (specimens and reagents) and approx 300 microlitres (wash fluids). Plate or strip reader to read at 450nm and (optionally) at a wavelength between 620 and 690 nm. 37 degree C incubator Newmarket Laboratories Malaria EIA may be automated for both liquid handling and result interpretation. A variety of systems have been used for this please consult the manufacturers of both the kit and the automation system for advice on automation. Equipment should be able to support the following tolerances: Volume dispensed +/- 10% Incubation temperature Incubation time +/- 2 C +/- 2 minutes. Specimens Serum or plasma (collected into EDTA, sodium citrate, or heparin) specimens should be free of blood cells and of obvious microbial contamination. They may be stored at 2-8 C for up to 7 days before testing. Specimens needing longer storage should be frozen at 20 C or lower. Frozen specimens should be thawed and well mixed before testing. Assay Protocol (manual) Bring all reagents and specimens to room temperature prior to use. Dilute Wash Buffer 1 in 20 with distilled or deionised water prior to use. Assay controls The Negative control must be tested three times with each lot of tests, and the Positive control twice. Verification of Specimen addition Verification is by detecting photometrically the difference between an empty well and a well containing serum or plasma at a wavelength of 450 nm. Wells containing specimen will have an A 450 reading of between and Procedural notes. Washing must be thorough, with complete filling and emptying of the wells at each cycle Procedure. Add 50 l of the undiluted sample (or control see Assay Controls above) to a coated well. Mix on a plate shaker for 30 seconds. Incubate (covered) at 37 o C for 30 minutes. Wash 5 x with working strength wash buffer. A short soak time of about 30 seconds is recommended between each wash cycle. Tap out excess liquid. 4

5 Conjugate Incubation Dilute conjugate in Conjugate Buffer. Add 50 l diluted conjugate to each well. Incubate (covered) at 37 o C for 30 minutes. Addition of conjugate is verified by reading at 450/ nm. A well with conjugate added must have an OD greater than 0.2 (50 l l per 10 wells) Wash 5 x with working strength wash buffer. A short soak time of about 30 seconds is recommended between each wash cycle. Tap out excess liquid. Substrate Incubation Add 50 l substrate/chromogen mixture to each well. Incubate at room temperature for 30 minutes. There is a clear difference of colour between an empty well and a well containing substrate. Addition of substrate is verified by reading at 550 nm. A well with substrate added must have an A 550 of greater than As the substrate is photosensitive, it is recommended that the plate be protected from light during this incubation. Stop Colour Development Add 50 l 0.5M sulphuric acid to each well. (Blue colour changes to yellow). Read Results Read at 450 nm (A 450 ) Use of a reference filter at nm will eliminate effects of scratches, bubbles, etc Cut-Off Value Calculated as the mean of the negative control values plus i.e. Negative Control 1 + NC2 + NC Example: = Cut-Off Value= =

6 Assay Validation A 450 of each Negative Control should be lower or equal to If one control is above this value the reading should be ignored and the cut off calculated using the remaining two. A 450 of each Positive Control should be greater than or equal to Interpretation Samples with an A450 value less than the Cut-off value are considered negative by Malaria EIA. Samples just below the Cut-off (C.O. 10% A450) should however, be interpreted with caution. It is advisable to retest the corresponding samples in duplicate when the systems and laboratory procedures permit. Re-tested samples that are above the cut-off in at least one duplicate are considered positive and should be investigated further. Samples that are below the cut-off in both duplicates are considered to be negative. Performance Characteristics Specificity External data from 13,608 donor samples deemed at risk to malaria infection gave 96.21% specificity. (95% confidence limits 93.63% 98.79%) Sensitivity External data for 76 acute P.falciparum cases showed 92.5% (95% confidence limits 90.5% %) External data for 258 IFAT > 80 for P.falciparum showed 94.4% (95% confidence limits 92.44% %) Internal data for P.vivax showed 100% (95% confidence limits 97.63% - 100%) Only small numbers of samples from P.ovale and P.malariae infections have been studied. Sensitivity for these was 80% and 67% respectively. Numbers were too small to allow meaningful statistical analysis. These figures will be updated as more samples from these infections are tested Precision Intra-assay CV Inter-assay CV Specimen No. No. of replicates Mean A 450 -A 620 (%) (%) (Negative)

7 Bibliography 1. Kitchen A.D. et al Evaluation of a malarial antibody assay for use in the screening of blood and tissue products for clinical use. Vox Sanguinis (2004) 87, Seed C.R. et al The efficacy of a malarial antibody enzyme immunoassay for establishing the reinstatement status of blood donors potentially exposed to malaria Vox Sanguinis (2005) 88, Kitchen A.D. et al Tranfusion transmitted malaria: current donor selection guidelines are not sufficient. Vox Sanguinis (2005) 88,

8 FR Newmarket Laboratories Ltd, Kits de test immuno-enzymatique pour le paludisme Malaria EIA (96 puits, Code produit 60089, 480 puits, Code produit 60090) Kits de détection qualitative et semi-quantitative d anticorps à P.falciparum, P.vivax, P.ovale et P.malariae dans le sérum ou le plasma humains par essai immuno-enzymatique Considérations cliniques générales Le paludisme est l une des maladies les plus répandues du monde. Plus de la moitié de la population mondiale vit dans des régions infestées par le paludisme. Plus de 200 millions de cas par an entraînent jusqu à 3 millions de décès chaque année ; dont la majorité sont des jeunes enfants. Dans les zones non endémiques, c est l une des plus importantes maladies importées, entraînant un grand nombre de morts frappant des cas diagnostiqués tardivement ou non suspectés chaque année. La maladie est causée par un protozoaire de l espèce Plasmodium, transmis par la piqûre d un moustique femelle l Anophèle. Quatre espèces plasmodiales sont contaminantes pour l homme : P.falciparum, P.vivax, P. malariae et P. ovale. La maladie peut également être transmise par transfusion de sang infecté. Une fois dans le sang, le sporozoïte s achemine dans le foie où pendant les 2 semaines qui suivent sont produits des mérozoïtes. Ceux-ci sont libérés dans le sang où ils envahissent les globules rouges et produisent de plus en plus de mérozoïtes, causant la rupture des cellules. C est cette rupture qui est responsable des symptômes cliniques. Des quatre espèces, P. falciparum est le plus répandu et le plus virulent, entraînant la majorité des morts liées au paludisme. P. vivax est la deuxième cause la plus répandue de paludisme. Bien qu il soit rarement fatal, cette forme de paludisme peut s accompagner de symptômes cliniques sévères. Il est une cause fréquente de paludisme en Asie du Sud-Est et en Amérique du Sud. Les personnes infectées par Plasmodium spp. produisent des anticorps en réponse à l infection. Le kit MALARIA EIA de Newmarket Laboratories est destiné à détecter les anticorps qui se forment chez les sujets infectés par les P.falciparum, P.vivax, P.ovale et P.malariae Usage prévu Ces kits sont destinés à être utilisés par un personnel adéquatement formé et qualifié pour la détection des anticorps à P.falciparum, P.vivax, P.ovale et P.malariae dans le sérum et le plasma humains. Principe du test Les kits de test Malaria EIA 96 et 480 font appel à quatre antigènes recombinants dans un dosage «en sandwich» qui donne un test à la fois hautement spécifique et sensible. Ces antigènes détectent les IgG, IgM et IgA spécifiques à P.falciparum, P.vivax, P.ovale et P.malariae, permettant au test de mettre en évidence ces anticorps durant tous les stades de l infection. Tous les réactifs, sauf le conjugué et la solution de lavage, sont fournis prêts à l emploi et codés couleur et la procédure utilise des échantillons non dilués et des volumes standards afin de faciliter une utilisation aussi bien manuelle qu automatisée. Ce test peut être réalisé aussi bien sur du sérum que du plasma. Les puits en plastique sont enduits d un mélange des antigènes recombinants de P. falciparum et de P. vivax. La similarité antigénique prévalente entre les espèces de Plasmodium signifie que des anticorps à toutes les espèces peuvent être détectés. Des anticorps spécifiques dans les échantillons de sérum ou de plasma se combinent avec ces antigènes et avec les mêmes antigènes conjugués à de la peroxydase de raifort lorsque du conjugué est ajouté dans un puits dans lequel l échantillon a été incubé. Après enlèvement par lavage des substances n ayant pas réagi, la présence de l enzyme lié indiquant la présence dans l échantillon d anticorps spécifiques est révélée par un changement de couleur du mélange substrat/chromogène. L intensité de la couleur est comparée à celle des puits témoins pour déterminer la présence ou l absence d anticorps spécifiques. 8

9 Contenu du kit R1 Microplaque (96 puits en 12 rangées de 8), Polystyrène enduit d antigènes recombinants (96 tests) 5 (480 tests) R2 Contrôle positif Sérum humain Rouge 1,5 ml 1,5 ml R3 Contrôle négatif Sérum humain Jaune 2,0 ml 2,0 ml R4 Conjugué Antigènes recombinants conjugués à de la peroxydase de raifort Pourpre 0,8 ml 3 ml R5 Tampon de dilution du conjugué Solution saline tamponné contenant un surfactant et des stabilisants Vert 8 ml 30 ml R6 Substrat Peroxyde d urée et tétraméthyle benzidine Rose 7 ml 30 ml R7 Solution de lavage (concentré x 20) Solution saline contenant un surfactant Incolore 125 ml 2 x 125 ml R8 Solution d arrêt 0,5M H 2 SO 4 Incolore 7 ml 30 ml Sachet pour les puits inutilisés. Mode d emploi Mises en garde et précautions d emploi Produits destinés au diagnostic in vitro seulement. Les substances de contrôle fournies proviennent de sérum humain. Elles ont été contrôlées au niveau du donneur et se sont révélées négatives pour l hépatite B et C et le HIV 1 et 2. Elles devront cependant être traitées comme risquant de transmettre ces maladies. Les échantillons de sérum et de plasma humains devront être traités comme présentant des risques du point de vue microbiologique et manipulés conformément aux réglementations applicables. Ne pas utiliser ce kit après la date de péremption. Ne pas combiner ou permuter les réactifs de kits de numéros de lots différents. Rangement Conserver le kit à une température comprise entre 2 et 8 C lorsqu il n est pas utilisé. Stocker les flacons verticalement. Ne pas congeler. Ne pas exposer le substrat à la lumière solaire directe. Le conjugué dilué est stable pendant 4 semaines à 4 C La solution de lavage diluée est stable pendant 4 semaines à 4 C Les rangées de puits enduits inutilisés sont stables pendant 4 semaines à 4 C si elles sont stockées dans le sachet réutilisable fourni. 9

10 Matériel requis Des dispositifs de pipetage correctement étalonnés et entretenus pouvant dispenser des volumes de 50 microlitres (échantillons et réactifs) et d environ 300 microlitres (liquides de lavage). Un lecteur de plaques ou de rangées de puits opérant à 450 nm et (en option) à une longueur d onde comprise entre 620 et 690 nm. Un incubateur 37 C Le test Malaria EIA de Newmarket Laboratories peut être automatisé aussi bien en ce qui concerne la manipulation des liquides que l interprétation des résultats. Toute une gamme de matériels peut être utilisée à cet effet pour de plus amples renseignements sur cette automatisation, veuillez consulter les fabricants à la fois du kit et du système robot. Ce matériel doit respecter les tolérances suivantes : Volume distribué +/- 10% Température d incubation Temps d incubation +/- 2 C +/- 2 minutes. Échantillons Le sérum ou le plasma à tester (recueillis dans de l EDTA, du citrate de sodium ou de l héparine) ne doit pas contenir de globules sanguins ou présenter de contamination microbienne évidente. Ces échantillons peuvent être conservés entre 2 et 8 degrés C pendant jusqu à 7 jours avant d être testés. Ceux ayant besoin d être conservés plus longtemps devront être congelés à 20 degrés C ou plus bas. Les échantillons congelés devront être décongelés et bien homogénéisés avant le test. Protocol de l essai (manuel) Laisser tous les réactifs et échantillons revenir à la température ambiante avant de les utiliser. Diluer au 1/20 ème la solution de lavage avec de l eau distillée ou désionisée avant l emploi. Contrôles de l essai Le contrôle négatif doit être testé trois fois avec chaque lot de tests et le contrôle positif deux fois. Vérification de l addition de l échantillon La vérification se fait par détection photométrique, à une longueur d onde de 450 nm, de la différence entre un puits vide et un puits contenant du sérum ou du plasma. Les puits contenant l échantillon auront une A 450 comprise entre 0,050 et 1,000. Remarques concernant la procédure Le lavage doit être poussé, avec un remplissage et un vidage intégral des puits à chaque cycle. Procédure Ajouter 50 l de l échantillon non dilué (ou du contrôle voir Contrôles de l essai ci-dessus) dans un puits enduit. Mélanger sur un agitateur à plateau pendant 30 secondes. Laisser incuber (puits couvert) à 37 o C pendant 30 minutes. 10

11 Lavage 5 fois avec de la solution de lavage à la concentration de travail. Une brève période de trempage d environ 30 secondes est recommandée entre chaque cycle de lavage. Tapoter pour évacuer l excès de liquide. Incubation du conjugué Diluer le conjugué dans un tampon de conjugué. Ajouter 50 l de conjugué dilué à chaque puits. Laisser incuber (puits couverts) à 37 o C pendant 30 minutes. L addition du conjugué est vérifiée par une lecture à 450 nm. Une cupule contenant du conjugué doit présenter une DO supérieure à 0.2 (50 l l par 10 puits) Lavage 5 fois avec un tampon de lavage à la concentration de travail. Une brève période de trempage d environ 30 secondes est recommandée entre chaque cycle de lavage. Tapoter pour évacuer l excès de liquide. Incubation du substrat Ajouter 50 l de mélange substrat/chromogène dans chaque puits. Laisser incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Il y a une nette différence de couleur entre un puits vide et un puits contenant du substrat. L addition de substrat est vérifiée par lecture photométrique à 550 nm. Un puits dans lequel a été ajouté un substrat doit avoir une A 550 supérieure à 0,080 Étant donné que le substrat est photosensible, il est recommandé de protéger la plaque contre l exposition à la lumière pendant l incubation. Arrêt du développement de la couleur Ajouter 50 l d acide sulphurique 0,5M dans chaque puits. (La coloration bleue vire au jaune). Résultats de lecture Faire la lecture à 450 nm (A 450 ) Utiliser un filtre de référence à nm pour éliminer l effet de rayures, bulles, etc. 11

12 Valeur seuil Calculée comme étant la moyenne des valeurs des contrôles négatifs plus 0,100 soit Contrôle négatif 1 + NC2 + NC3 + 0,100 3 Exemple : 0, , ,035 = 0,030 3 Valeur seuil = 0, ,100 = 0,130 Validation de l essai L A 450 de chaque contrôle négatif doit être inférieure ou égale à 0,080. Si un contrôle dépasse cette valeur, le chiffre lu ne devra pas être utilisé et le seuil calculé en utilisant les deux valeurs restantes. L A 450 de chaque contrôle positif doit être supérieure ou égale à 1,000. Interprétation Les échantillons ayant des valeurs de A450 inférieures au point seuil sont considérés comme négatifs pour le test Malaria EIA. Ceux ayant une valeur tout juste inférieure à la valeur seuil (P.S. 10% de l A450) doivent néanmoins être interprétés avec prudence. Il est conseillé de retester en double les échantillons correspondants lorsque les systèmes et les procédures de laboratoire le permettent. Les échantillons retestés dont au moins un double sera au-dessus du seuil seront considérés comme positifs et devront être revérifiés. Ceux dont les deux doubles seront en-dessous du seuil seront considérés comme négatifs. Caractéristiques de performances Spécificité Des données externes ayant porté sur 13,608 échantillons de donneurs estimés à risque d une infection par le paludisme ont indiqué une spécificité de 96,21%. (95% pour des limites de confiance de 93,63% 98,79%) Sensibilité Des données externes ayant porté sur 76 cas de P.falciparum aigü ont indiqué une spécificité de 92,5% (95% pour des limites de confiance de 90,5% - 94,5%) Des donnés externes ayant porté sur 258 tests IFAT > 80 pour P.falciparum ont indiqué une spécificité de 94,4% (95% pour des limites de confiance de 92,44% - 96,38%) Des données internes ayant porté sur P.vivax ont indiqué une spécificité de 100% (95% pour des limites de confiance de 97,63% - 100%) Seuls de petits nombres d échantillons d infections à P.ovale et P.malariae ont été étudiés. La sensibilité de ces échantillons a été de 80% et de 67% respectivement. Les nombres sont trop réduits pour permettre d obtenir une analyse statistique utile. Ces chiffres seront mis à jour à mesure qu un nombre plus grand d échantillons de ces infections sera testé. 12

13 Précision No. échantillon Nbre de doubles (négatifs) 16 Valeurs A A 620 moyennes CV intra-essais (%) CV inter-essais (%) 2,402 2,28 3,78 1,316 3,83 5,17 0,672 3,83 5,52 0,353 4,06 6,15 0,195 3,19 6,16 0,046 6,95 6,84 Bibliographie Se référer à la section Anglaise 13

14 IT Newmarket Laboratories Ltd, Kit per test Malaria EIA (96 pozzetti Cod. prodotto 60089, 480 pozzetti Cod. prodotto 60090) Kit per la determinazione qualitativa e semi-quantitativa di anticorpi anti-p.falciparum, P.vivax, P.ovale e P.malariae nel siero o nel plasma umano mediante saggio immunoenzimatico Profilo clinico La malaria è fra le patologie a massima diffusione nel mondo. Oltre la metà della popolazione del pianeta vive in zone infestate dalla malaria. Gli oltre 200 milioni di casi ogni anno causano fino a 3 milioni di decessi, particolarmente nella prima infanzia. Anche nelle zone non endemiche la malaria è una delle patologie maggiormente diffuse, ad esito fatale tra i casi diagnosticati tardivamente o non sospettati ogni anno. L agente eziologico sono i protozoi del genus Plasmodium, trasmessi dal morso della zanzara femmina Anopheles. Sono quattro le specie che causano la malaria nell uomo: P.falciparum, P.vivax, P. malariae e P. ovale. La malattia può inoltre essere trasmessa con trasfusione di sangue infetto. Dopo l ingresso in circolo, lo sporozoita raggiunge la sede epatica, dove produce merozoiti nelle 2 settimane successive. Questi ultimi vengono rilasciati nel sangue, invadendo gli eritrociti e portando a replicazione merozoitica, con conseguente disgregazione delle pareti cellulari. È questa disgregazione a causare l esordio dei sintomi clinici. Delle quattro specie suddette, P. falciparum è la più diffusa e virulenta ed è massimamente responsabile per le morti da malaria nel mondo, seguita dalla specie P. vivax. Anche se raramente fatale, questa forma malarica può essere caratterizzata da severa sintomatologia clinica. È l agente eziologico più diffuso nel Sud Est Asiatico e in Sud America. I soggetti con infezione da lasmodium spp. sviluppano anticorpi. Il kit MALARIA EIA di Newmarket Laboratories è studiato per determinare la presenza di anticorpi nei soggetti infetti da P.falciparum, P.vivax, P.ovale e P.malariae Applicazioni I kit devono essere utilizzati solo da personale qualificato specializzato nella determinazione degli anticorpi per P.falciparum, P.vivax, P.ovale e P.malariae nel siero e nel plasma umano. Principio del test I kit per test Malaria EIA 96 e 480 impiegano quattro antigeni ricombinanti nell ambito di un test sandwich; il saggio è altamente specifico e sensibile. Gli antigeni sono in grado di determinare la presenza di anticorpi di classe IgG, IgM e IgA P.falciparum, P.vivax, P.ovale e P.malariae specifici in tutte le fasi dell infezione. Tutti i reagenti, fatta eccezione per il coniugato e la soluzione di lavaggio, sono forniti pronti per l uso e codificati per colore; la procedura utilizza campioni non diluiti e volumi standard per agevolare l uso sia manuale che automatico. Il test si può eseguire su siero e anche su plasma. I pozzetti di plastica sono sensibilizzati con una miscela di antigeni ricombinanti del P. falciparum e del P. Vivax. L affinità antigenica fra le specie Plasmodium significa che è possibile determinare anticorpi per tutte le specie. Gli anticorpi specifici presenti nei campioni di siero o di plasma coagglutinano con questi antigeni e con gli stessi antigeni coniugati con perossidasi di rafano, quando il coniugato è dispensato in un pozzetto in cui è stato incubato il campione. Eliminando il materiale non reattivo con un lavaggio, la presenza dell enzima legato, ossia la presenza nel campione di anticorpi specifici, è rivelata dalla variazione di colore del substrato/miscela cromogena. L intensità cromatica è confrontata con quella dei pozzetti di controllo per determinare la presenza o l assenza di anticorpi specifici. 14

15 Contenuto del kit R1 Micropiastra (96 pozzetti in 12 strisce di 8 ciascuna) Polistirolo rivestito di antigeni ricombinanti (96 test) 5 (480 test) R2 Controllo positivo Siero umano Rosso 1,5 ml 1,5 ml R3 Controllo negativo Siero umano Giallo 2,0 ml 2.0 ml R4 Coniugato Antigeni ricombinanti coniugati a perossidasi di rafano Porpora 0,8 ml 3 ml R5 Tampone di diluizione per coniugato Salina tamponata contenente tensioattivo e stabilizzanti Verde 8 ml 30 ml R6 Substrato Perossido ureico e tetrametilbenzidina Rosa 7 ml 30 ml R7 Lavaggio (20 x concentrato) Salina contenente tensioattivo Incolore 125 ml 2 x 125 ml R8 Stop 0,5M H 2 SO 4 Incolore 7 ml 30 ml Sacchetto per la conservazione dei pozzetti non utilizzati Istruzioni per l uso Avvertenze e precauzioni Solo per uso diagnostico in vitro. Tutti i materiali di controllo forniti sono derivati di siero umano. A seguito di test dei donatori, sono risultati negativi per la presenza di Epatite B e C, come anche di HIV 1 e 2. Tuttavia, considerare i materiali come potenzialmente in grado di trasmettere patologie. I campioni di siero e di plasma umano devono essere considerati pericolosi dal punto di vista microbiologico e maneggiati nel rispetto dei regolamenti applicabili. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza indicata. Non usare insieme né scambiare reagenti da kit con diversi numeri di lotto. Conservazione Quando non si usano i kit, conservarli a 2 8ºC. Tenere sempre i flaconi verticali. Non surgelare. Non esporre il substrato alla luce solare diretta. Il coniugato diluito si mantiene stabile per 4 settimane a 4ºC. Il tampone diluito di lavaggio rimane stabile per 4 settimane a 4ºC. Le strisce rivestite non utilizzate sono stabili per 4 settimane a 4ºC, se conservate all interno del sacchetto richiudibile fornito. 15

16 Materiali non forniti Pipette calibrate e mantenute in modo corretto, in grado di erogare volumi di 50 microlitri (campioni e reagenti) e di circa 300 microlitri (liquidi di lavaggio). Lettore per micropiastre o strisce a 450 nm e (opzionale) a lunghezza d onda compresa tra 620 and 690 nm. Incubatore a 37ºC. Il saggio Malaria EIA di Newmarket Laboratories può essere automatizzato sia per la movimentazione dei liquidi che per l interpretazione dei risultati. A questo scopo sono stati utilizzati vari sistemi consultare i produttori del kit e del sistema di automazione per richiedere una consulenza in merito all automazione. Il sistema deve essere in grado di gestire i seguenti intervalli di tolleranza: Volume dispensato +/- 10% Temperatura di incubazione Intervallo di incubazione +/- 2 C +/- 2 minuti Campioni È possibile utilizzare campioni di siero o plasma (raccolto in EDTA, sodio citrato o eparina). Asportare le particelle ematiche e la contaminazione microbica macroscopica presente nel campione, prima di eseguire il test. È possibile conservare i campioni a 2-8 C se si intende eseguire il test entro 7 giorni, oppure a -20 C o meno per periodi più lunghi. Scongelare e miscelare a fondo i campioni prima del test. Protocollo per l esecuzione del saggio (manuale) Attendere che tutti i reagenti e i campioni raggiungano la temperatura ambiente prima dell uso. Diluire il tampone di lavaggio 1 : 20 con acqua distillata o deionizzata prima dell uso. Controlli Dosare tre controlli negativi e due controlli positivi per saggio. Verifica dell aggiunta dei reagenti La verifica avviene mediante determinazione fotometrica della differenza fra pozzetti vuoti e pozzetti contenenti siero o plasma, a una lunghezza d onda di 450 nm. I pozzetti contenenti campioni daranno un valore A 450 fra 0,050 e 1,000. Note procedurali. Il lavaggio deve essere rigoroso, riempiendo e svuotando completamente i pozzetti a ciascun ciclo. Procedura. Aggiungere 50 l di campione non diluito (o controllo vedere sopra alla voce Controlli ) a un pozzetto rivestito. Miscelare per 30 secondi su un agitatore per piastre. Incubare (coperti) a 37 o C per 30 minuti. Lavaggio Lavare 5 x con tampone di lavaggio alla concentrazione d uso. Si consiglia un periodo di immersione di circa 30 secondi fra un ciclo di lavaggio e l altro. Evacuare il liquido in eccesso. 16

17 Incubazione del coniugato Diluire il coniugato nel tampone di coniugato. Aggiungere 50 l di concentrato diluito a ciascun pozzetto. Incubare (coperti) a 37 o C per 30 minuti.. L addizione del coniugato è verificata leggendo a 450/ nm. Un pozzetto con coniugato aggiunto deve avere una OD maggiore di 0.2 (50 l l ogni 10 pozzetti) Lavaggio Lavare 5 x con tampone di lavaggio alla concentrazione d uso. Si consiglia un periodo di immersione di circa 30 secondi fra un ciclo di lavaggio e l altro. Evacuare il liquido in eccesso. Incubazione del substrato Aggiungere 50 l di substrato/cromogeno a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Vi è una netta differenza di colore fra i pozzetti vuoti e quelli contenenti substrato. L aggiunta del substrato viene verificata con lettura a 550 nm. I pozzetti a cui si è aggiunto substrato devono avere un valore A 550 di oltre 0,080 Poiché il substrato è fotosensibile, si consiglia di proteggere la piastra dalla luce durante la fase di incubazione. Stop dello sviluppo del colore Aggiungere 50 l di acido solforico 0,5M a ciascun pozzetto. (Il blu passa a giallo). Lettura dei risultati Leggere a 450 nm (A 450 ) L uso di un filtro di riferimento a nm eliminerà gli effetti di graffi, bollicine, ecc. Valore di cut-off Si calcola come media dei valori evidenziati dai controlli negativi più 0,100 es. Controllo negativo (NC) 1 + NC2 + NC3 + 0,100 3 Esempio: 0, , ,035 = 0,030 3 Valore di cut-off= 0, ,100 = 0,130 17

18 Convalida del saggio Il valore A 450 di ciascun controllo negativo deve essere inferiore o pari a 0,080. Se un controllo supera questo valore, ignorare la lettura e calcolare il cut off sulla base dei rimanenti due. Il valore A 450 di ciascun controllo positivo deve essere superiore o pari a 1,000 Interpretazione I campioni con valore A450 inferiore al valore di cut-off sono considerati negativi dal saggio Malaria EIA. I risultati appena inferiori al valore di cut-off ( C.O -10% A450) vanno tuttavia interpretati con cautela. Si consiglia di ripetere il test sui campioni corrispondenti in duplicato, laddove sistemi e procedure di laboratorio lo permettono. I campioni ritestati superiori al cut-off in almeno uno dei duplicati sono considerati positivi e vanno esaminati oltre. I campioni inferiori al cut-off in entrambi i duplicati sono considerati negativi. Prestazioni Specificità Uno studio esterno condotto su campioni prelevati da donatori ritenuti a rischio di contrarre l infezione malarica ha dimostrato una specificità del 96,21%. (Intervallo di confidenza al 95% 93,63% 98,79%) Sensibilità Uno studio esterno su 76 casi acuti di P.falciparum ha dimostrato una sensibilità del 92,5% (intervallo di confidenza al 95% 90,5% - 94,5%) Uno studio esterno su 258 IFAT > 80 per P.falciparum ha dimostrato una sensibilità del 94,4% (intervallo di confidenza al 95% 92,44% - 96,38%) Uno studio interno su P.vivax ha dimostrato una sensibilità del 100% (intervallo di confidenza al 95% 97,63% - 100%) Si è esaminato solo un numero limitato di campioni con infezione da P.ovale e P.malariae, che hanno evidenziato rispettivamente una sensibilità dell 80% e del 67%. Per via dell esiguo numero di campioni studiati, non è possibile formulare una valida analisi statistica. Queste cifre saranno aggiornate con la disponibilità di ulteriori campioni presentanti queste infezioni. Precisione CV intra-saggio CV inter-saggio Campione n. N. di duplicati Media A 450 -A 620 (%) (%) ,402 2,28 3, ,316 3,83 5, ,672 3,83 5, ,353 4,06 6, ,195 3,19 6,16 6 (Negativo) 16 0,046 6,95 6,84 Bibliografia Riferirsi alla sezione inglese 18

19 ES Newmarket Laboratories Ltd Kits de prueba Malaria EIA (96 pocillos Código del producto 60089, 480 pocillos Código del producto 60090) Equipos para la detección cualitativa y semicuantitativa de los anticuerpos a P.falciparum, P.vivax, P.ovale y P.malariae en suero o plasma humano mediante inmunoensayo enzimático (EIA) Antecedentes clínicos El paludismo es una de las enfermedades más comunes en el mundo. Más del 50% de la población mundial vive en áreas infectadas con él. Todos los años, más de 200 millones de casos causan 3 millones de fallecimientos; la mayoría de ellos de niños pequeños. En áreas no endémicas, es una de las enfermedades importadas más importantes, y todos los años causa algunos fallecimientos en casos de diagnóstico tardío o no sospechado. La enfermedad la causa un protozoario del género Plasmodium, transmitido por la picadura del mosquito hembra Anopheles. Existen cuatro especies que causan el paludismo humano: P.falciparum, P.vivax, P. malariae y P. ovale. La enfermedad también puede ser transmitida mediante transfusión de sangre infectada. Una vez que entra a la sangre, el esporozoito se dirige al hígado, en donde se producen merozoitos durante la quincena siguiente. Éstos entran a la sangre donde invaden a los eritrocitos, produciendo más merozoitos, y haciendo que las células estallen. Esta ruptura es la que ocasiona los síntomas clínicos. De las cuatro especies, P. falciparum es la más común y la más virulenta, causando la mayoría de los fallecimientos debidos al paludismo. Después de ésta, la especie más común del paludismo es P. vivax. Aunque es mortal en muy pocas ocasiones, esta forma de paludismo puede ir acompañada de síntomas clínicos graves. Es una causa común del paludismo en Asia sudoriental y Sudamérica. Las personas infectadas con Plasmodium spp. forman anticuerpos como respuesta a la infección. El equipo MALARIA EIA de Newmarket Laboratories se ha diseñado para detectar los anticuerpos producidos por las personas infectadas con P.falciparum, P.vivax, P.ovale y P.malariae Uso previsto Estos equipos deberán ser usados por personal capacitado y calificado apropiadamente para la detección de los anticuerpos a P.falciparum, P.vivax, P.ovale y P.malariae en suero y plasma humanos. Principio de la prueba Los kits de prueba Malaria EIA 96 y 480 emplean cuatro antígenos recombinantes en una prueba tipo sándwich para producir un ensayo de alta especificidad y sensibilidad. Los antígenos detectan IgG, IgM, y IgA específicos de P.falciparum, P.vivax, P.ovale y P.malariae; lo que permite detectar anticuerpos durante todas las etapas de la infección. Todos los reactivos, excepto el conjugado y la solución de lavado, se entregan listos para usarse y codificados por color, y en el procedimiento se usan muestras sin diluir y volúmenes estándar para permitir el uso manual o automatizado. El ensayo puede hacerse tanto con suero como con plasma. Los pocillos plásticos están recubiertos con una mezcla de antígenos recombinantes de P. falciparum y P. vivax. Gracias a la similitud antigénica entre las especies de Plasmodium, pueden detectarse los anticuerpos de todas las especies. Los anticuerpos específicos en las muestras de suero o plasma se combinan con estos antígenos y con los mismos antígenos conjugados de la peroxidasa del rábano picante, cuando el conjugado se añade a un pocillo en el cual se ha incubado la muestra. Después de eliminar por lavado el material que no ha reaccionado, se revela la presencia de la enzima enlazada que indica la presencia en la muestra de anticuerpos específicos gracias al vire de color en la mezcla de substrato/cromógeno. La intensidad del color se compara con la de los pocillos de control para determinar la presencia o ausencia de un anticuerpo específico. 19

20 Contenido del equipo R1 Placa (96 pocillos en 12 tiras de 8), Poliestireno recubierto con antígenos recombinantes (96 ensayos) 5 (480 ensayos) R2 Control positivo Suero humano Rojo 1,5 ml 1,5 ml R3 Control negativo Suero humano Amarillo 2,0 ml 2,0 ml R4 Conjugado Antígenos recombinantes conjugados con la peroxidasa del rábano picante Púrpura 0,8 ml 3 ml R5 Amortiguador de dilución del conjugado Solución salina amortiguada que contiene tensoactivo y estabilizadores Verde 8 ml 30 ml R6 Substrato Peróxido de urea y tetrametil bencidina Rosa 7 ml 30 ml R7 Lavado (20 x concentrado) Tensoactivo con solución salina Incoloro 125 ml 2 x 125 ml R8 Solución de stop 0,5M H 2 SO 4 Incoloro 7 ml 30 ml Bolsa para guardar los pocillos sin usar Instrucciones de uso Advertencias y precauciones Sólo para el empleo diagnóstico in vitro. Los materiales de control suplidos provienen de suero humano. Se han analizado a nivel donador y se encontró que son negativos a la hepatitis B y C, y al VIH 1 y 2. Sin embargo, deberán tratarse como si pudiesen transmitir enfermedades. Las muestras de suero y plasma humanos deberán tratarse como peligrosos microbiológicamente y manejarse de acuerdo con los reglamentos aplicables. No use el kit después de la fecha de caducidad. No combine ni intercambie reactivos provenientes de kits con números de lote diferentes. Condición Consérvese a 2 8ºC cuando no se use. Conserve las botellas en posición vertical. No se congele. No exponga el substrato a la luz solar directa. El conjugado diluido es estable durante 4 semanas a 4ºC. El amortiguador de lavado diluido es estable durante 4 semanas a 4ºC. Las tiras recubiertas sin usar son estables durante 4 semanas a 4ºC si se conservan en la bolsa resellable provista. 20

21 Equipo requerido Sistemas de pipetas calibrados y mantenidos correctamente capaces de introducir volúmenes de 50 microlitros (muestras y reactivos) y aproximadamente 300 microlitros (líquidos de lavado). Lector de placas o tiras para leer a 450 nm y (optativo) a una longitud de onda entre 620 y 690 nm. Incubador a 37ºC El equipo Malaria EIA de Newmarket Laboratories puede automatizarse tanto para el manejo de líquidos como para la interpretación de resultados. Para ello se han usado diversos sistemas. Consulte a los fabricantes del equipo y del sistema de automatización para obtener asesoría sobre dicha automatización. El equipo deberá estar capacitado para apoyar las siguientes tolerancias: Volumen dispensado +/- 10% Temperatura de incubación Tiempo de incubación +/- 2 C +/- 2 minutos. Muestras Las muestras de suero o plasma (recogidos en EDTA, citrato de sodio o heparina) no deben contener glóbulos sanguíneos o contaminación microbiana obvia. Podrán almacenarse a 2-8 ºC durante hasta 7 días antes de hacer los ensayos. Las muestras que requieren de almacenamiento más prolongado podrán congelarse a 20ºC o menos. Las muestras congeladas deberán descongelarse y mezclarse bien antes de hacer el ensayo. Protocolo de ensayo (manual) Dejar que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente antes de usar. Diluir el amortiguador de lavado 1:20 con agua destilada o desionizada antes de usar. Controles de ensayo El control negativo deberá ensayarse tres veces con cada serie de ensayos, y el control positivo dos veces. Verificación de la adición de la muestra La verificación se hace detectando fotométricamente la diferencia entre un pocillo vacío y un pocillo que contiene suero o plasma a una longitud de onda de 450 nm. Los pocillos que contienen muestra darán una lectura de A 450 entre 0,050 y 1,000. Notas de procedimiento. El lavado deberá ser meticuloso, llenando y vaciando completamente los pocillos en cada ciclo. Procedimiento. Añadir 50 l de la muestra sin diluir (o control ver Controles de ensayo arriba) a un pocillo recubierto. Mezclar en un agitaplacas durante 30 segundos. Incubar (cubierto) a 37ºC durante 30 minutos. 21

22 Lavado Cinco veces con amortiguador de lavado a la concentración de trabajo. Entre cada ciclo de lavado se recomienda un período corto de remojo de unos 30 segundos. Elimine el exceso de líquido con golpecitos ligeros. Incubación del conjugado Diluir el conjugado en amortiguador del conjugado. Añadir 50 l de conjugado diluido a cada pocillo. Incubar (cubierto) a 37ºC durante 30 minutos. La adición del conjugado se verifica leyendo a 450/ nm. Una probeta con adición de conjugado debe tener un OD mayor que 0.2 (50 l l por 10 pocillos) Lavado Cinco veces con amortiguador de lavado a la concentración de trabajo. Entre cada ciclo de lavado se recomienda un período corto de remojo de unos 30 segundos. Elimine el exceso de líquido con golpecitos ligeros. Incubación del substrato Añadir 50 l de mezcla de substrato/cromógeno a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se observa una clara diferencia de color entre un pocillo vacío y uno que contiene substrato. La adición del substrato se verifica leyendo a 550 nm. Un pocillo al que se le ha añadido el substrato deberá tener una A 550 mayor de 0,080. Ya que el substrato es fotosensitivo, se recomienda que durante la incubación se proteja la placa contra la luz. Paro del desarrollo del color Añadir 50 l de ácido sulfúrico 0,5M a cada pocillo. (El color azul vira a amarillo). Leer resultados Leer a 450 nm (A 450 ). El empleo de un filtro de referencia a nm eliminará los efectos de rayones, burbujas, etc. 22

23 Valor de corte Calculado como la mediana de valores del control negativo más 0,100 Es decir: Control negativo 1 + CN2 + CN3 + 0,100 3 Ejemplo: 0, , ,035 = 0,030 3 Valor de corte = 0, ,100 = 0,130 Validación del ensayo La A 450 de cada control negativo debe ser inferior o igual a 0,080. Si un control cae por encima de este valor, deberá ignorarse la lectura y calcularse el valor de corte usando los dos valores restantes. La A 450 de cada control positivo deberá ser mayor o igual a 1,000. Interpretación Las muestras con valores de A 450 inferiores al valor de corte se consideran negativas al usar Malaria EIA. Sin embargo, los resultados justo por debajo del valor de corte (V.C. 10% A450) deberán interpretarse con precaución. Es aconsejable repetir la prueba con las muestras correspondientes por duplicado cuando los sistemas y procedimiento de laboratorio lo permitan. Las muestras que se vuelva a ensayar y estén por encima del valor de corte en al menos uno de los ensayos duplicados se consideran positivas y deberán investigarse más. Las muestras que estén por debajo del valor de corte en los dos ensayos duplicados se consideran negativas. Características de actuación Especificidad Los datos externos obtenidos con muestras de donadores considerados bajo riesgo de padecer paludismo dieron una especificidad del 96,21% (límites de confianza al 95% entre 93,63% 98,79%). Sensibilidad Los datos externos para 76 casos agudos de P.falciparum demostraron una especificidad del 92,5% (límites de confianza al 95% entre 90,5% - 94,5%). Los datos externos para 258 IFAT > 80 para P.falciparum demostraron una especificidad del 94,4% (límites de confianza al 95% entre 92,44% - 96,38%). Los datos internos para P.vivax demostraron una especificidad del 100% (límites de confianza al 95% entre 97,63% -100%). Sólo se ha estudiado un número pequeño de muestras infectadas con P.ovale y P.malariae. La sensibilidad para éstas fue de 80% y 67%, respectivamente. El número fue demasiado bajo para permitir un análisis estadístico significativo. Se actualizarán estas cifras conforme se hagan pruebas con más muestras de estas infecciones. 23

24 Precisión Muestra No. No. de repeticiones (Negativo) 16 A 450 -A 620 media CV intraensayo (%) CV interensayo (%) 2,402 2,28 3,78 1,316 3,83 5,17 0,672 3,83 5,52 0,353 4,06 6,15 0,195 3,19 6,16 0,046 6,95 6,84 Bibliografía Referirse a la sección en ingles 24

25 P Newmarket Laboratories Ltd Conjuntos de teste EIA Malária (96 poços Código do Produto 60089, 480 poços Código do Produto 60090) Conjuntos para a detecção qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos a P.falciparum, P.vivax, P.ovale e P.malariae no soro ou no plasma humano por Imunoensaio Ligado por Enzima Historial Clínico A malária é uma das doenças mais comuns no mundo. Mais de metade da população mundial vive em áreas infectadas pela malária. Todos os anos, mais de 200 milhões de casos resultam em cerca de 3 milhões de mortos, sendo na sua maioria crianças pequenas. Em áreas não-endémicas, é uma das doenças importadas mais importante, resultando todos os anos num número de mortes em casos de diagnóstico tardio ou onde não há suspeita. A doença é causada por protozoários do género Plasmodium, transmitida pela picada da fêmea do mosquito Anopheles. Existem quatro espécies que causam a malária humana: P.falciparum, P.vivax, P. malariae e P. ovale. A doença também pode transmitir-se por transfusão de sangue infectado. Uma vez no sangue, o esporozoíto chega ao fígado, onde durante as 2 semanas seguintes se produzem merozoítos. Estes são libertados na corrente sanguínea, onde invadem os glóbulos vermelhos e produzem mais merozoítos, ocasionando a ruptura das células. É esta ruptura que é responsável pelos sintomas clínicos. Das quarto espécies, P. falciparum é a mais comum e a mais virulenta, causando a maior parte das mortes relacionadas com a malária. A segunda causa mais comum de malária é a P. vivax. Embora raramente seja fatal, esta forma de malária pode ser acompanhada por sintomas clínicos graves. É uma causa comum de malária no Sudeste asiático e na América do Sul. As pessoas infectadas com Plasmodium spp. formam anticorpos em resposta. O conjunto de teste EIA MALÁRIA da Newmarket Laboratories foi concebido para detectar anticorpos que ocorrem em sujeitos infectados com P.falciparum, P.vivax, P.ovale e P.malariae Utilização Prevista Estes conjuntos destinam-se a ser utilizados por pessoal devidamente formado e qualificado para a detecção de anticorpos ao P.falciparum, P.vivax, P.ovale e P.malariae no soro e no plasma humano. Princípio do teste Os conjuntos de teste EIA Malária 96 e 480 utilizam quatro antígenos recombinantes num teste alternado para produzir um teste que seja altamente específico e sensível. Os antígenos detectarão o IgG, o IgM e o IgA específico de o P.falciparum, P.vivax, P.ovale e P.malariae ; permitindo ao teste detectar anticorpos durante todas as fases da infecção. Todos os reagentes, excepto o conjugado e a solução de lavagem, são fornecidos prontos a utilizar e codificados por cores, e o procedimento utiliza amostras não diluídas e volumes normais para facilitar a utilização manual e a automática. O ensaio pode ser utilizado com soro e plasma. Os poços plásticos são revestidos com uma mistura dos antígenos recombinantes P. falciparum e P. vivax. A semelhança antigénica entre a espécie Plasmodium significa que podem detectar-se anticorpos a todas as espécies. Os anticorpos específicos em amostras de soro ou de plasma combinam com estes antígenos e com os mesmos antígenos conjugados para peroxidase de rábano, quando o conjugado é adicionado a um poço onde a amostra foi incubada. Após o material não reagido ter sido retirado por lavagem, a presença de enzima de ligação indicando a presença na amostra de anticorpos específicos é revelada por uma alteração da cor na mistura de substrato/cromogénio. A intensidade da cor é comparada à dos poços do controlo para determinar a presença ou a ausência de anticorpo específico. 25