Herramientas diagnós.cas para la determinación de alérgenos en alimentos. Mgr., Bqca. Patricia Silvina Knass Romer Labs La:n America Adviser

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Óscar Aranda Contreras
hace 8 años
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1 Herramientas diagnós.cas para la determinación de alérgenos en alimentos Mgr., Bqca. Patricia Silvina Knass Romer Labs La:n America Adviser

2 Resumen de la presentación Porqué vamos a analizar? Qué vamos a analizar? Cuales son las técnicas disponibles? Cuales son las fortalezas y debilidades de algunos métodos? Errores y problemas comunes en el análisis de alérgenos Cuando analizar Validación

3 Porqué vamos a analizar? Las verdaderas alergias alimentarias presentan una respuesta inmunológica a proteínas específicas de algunos alimentos. Los métodos analí:cos pueden determinar las proteínas de interés o el material gené:co que produce esas proteínas (DNA) El método analí:co debe ser lo más específico posible para el producto de interés. El método analí:co debe ser capaz de detectar el/los analito/s de interés bajo una gran variedad de circunstancias (procesos a los que se somete al alimento, incluyendo el tratamiento térmico)

4 Determinación de Alérgenos: Tendencias Protección de la marca Legislación y estándares mercado Allergen-free Interés de los medios Retiro de Productos Alérgenos alimentarios = riesgo para la inocuidad alimentaria

5 Cual es el escenario para el analista? Niveles umbral Toma de muestra Unidades y definiciones Validaciones & Aprobaciones Test kits Calibración El análisis es solo una pequeña parte

6 Qué vamos a analizar? (donde buscar alérgenos) Ingredientes o materias primas. Productos terminados. Muestras ambientales. Limpieza o Superficies en contacto con alimentos o Agua de enjuague o Primera porción de la producción

7 Qué vamos a analizar? Analitos: alérgenos/ marcadores Proteínas involucradas en las reacciones adversas Proteína no involucrada en la reacción adversa, pero caracterís:ca del alimento considerado como alergénico Marcado res DNA Qué marcador estamos utilizando?

8 Cuáles son las técnicas disponibles? Métodos inmunoquímicos: o ELISA o Disposi.vos de Flujo lateral (FLD) o Mul.plex Métodos de biología molecular: o PCR o Mul.plex Espectrometría de masas Genéricos/No específicos (limpieza) o Proteínas o ATP o Inspección visual Otros métodos

9 Selección de un método para detectar alérgenos Propósito Tipo de muestra Matriz o producto Efecto del Procesamiento Tiempo de Respuesta Disponibilidad de recursos

10 ELISA Detección de la proteína específica (u otra asociada) por medio de an:cuerpos ELISA Sándwich es más común en métodos para alérgenos 1 a 2 horas para el análisis Cualita:vo o Cuan:ta:vo Empleado para ingredientes, productos finales, muestras ambientales, hisopos, agua de enjuague.

11 Ventajas y Limitaciones del ELISA Ventajas Sensible (ppm) Cuantitativo o semicuantitativo Anticuerpos que detectan proteínas alergénicas o marcadoras Relativamente rápido Poco equipamiento Nivel de habilidad: medio Limitaciones Entrenamiento /Seguir el protocolo Muestreo Extracción Matriz (polifenoles, ph, procesamiento, aceites) Tipo de proteína Falta de matrices de referencia Necesidad de validación in house

12 Y además. (cuando monitoreamos después de la limpieza) Cuando la proteína alergénica se desnaturaliza (detergentes, procesos) se presentan falsos nega:vos. En presencia de leche de soja, no se detecta gluten con el an:cuerpo R5 cuando se extrae con EtOH 60% La prueba inmunoquímica puede verse afectada por la presencia de residuos de detergentes o desinfectantes. Métodos alterna.vos!!!!!!

13 FLD (.ras) Dispositivos basados en la tecnología ELISA. (Cualitativos / Semicuantitativos) Se visualiza con la aparición de una línea de color Muestras ambientales, verificación de limpieza, screening de alimentos. Rápidos (10 ) / In Situ

14 PCR Método cualita.vo DNA, primers, dntps, polimerasa, termociclador Desnaturalización (95 C) Unión del primer Síntesis de DNA (DNA- polimerasa 72 C) Siguiente ciclo Electroforesis en gel de agarosa

15 PCR Método para la detección del DNA específico de la especie (no la proteína alergénica) Es un método cualitativo donde se amplifica el DNA específico y luego se detecta. Es útil cuando los resultados de ELISA son cuestionables (proteínas liofilizadas, para aceites problemas con la extracción acuosa-, lecitina de soja en leche en polvo) Se requiere de habilidad y equipamiento más costoso.

16 Real.me PCR Método cuan.ta.vo Sonda adicional de ADN (TaqMan probe) Ciclo umbral

17 Realtime PCR PCR en Tiempo Real es un método cuan:ta:vo Se adiciona una sonda específica de ADN Cuando la sonda encuentra el target, se elimina el quencher y se emite una señal fluorescente. Durante la reacción se mide la fluorescencia en el termociclador. La cuan:ficación se lleva a cabo a par:r del ciclo umbral (Ct value). La can:dad original de DNA se calcula con estándares internos. Mar:n Röder, Stefan Vieths, Thomas Holzhauser, Sensi:ve and specific detec:on of poten:ally allergenic almond (Prunus dulcis) in complex food matrices by Taqman real- :me polymerase chain reac:on in comparison to commercially available protein- based enzyme- linked immunosorbent assay, Analy:ca Chimica Acta, Volume 685, Issue 1, 24 January 2011, Pages 74-83,)

18 Espectrometría de Masas Detecta proteínas y pép:dos Extracción, cleanup, ionización, separación de las proteínas/pép:dos ionizados, detección Alto grado de sensibilidad y resolución Provee información de la composición proteica, estructura y secuencia. Detección y confirmación de la proteína en un solo paso Detección y cuan:ficación de pép:dos sencilla.

19 Ventajas y Limitaciones de MS Ventajas Identificación y cuantificación certera de las proteínas alergénicas Método muy sensible Método de elección para la confirmación Limitaciones Mucha experiencia Equipamiento costoso Laborioso y gran inversión de tiempo Se requiere de extracción y cleanup No es útil para los procedimiento de rutina hpp:// comprehensive- survey- of- interna:onal- soybean- research- gene:cs- physiology- agronomy- and- nitrogen- rela:onships/proteomics- and- its- use- in- obtaining- superior- soybean- genotypes

20 Antes de los métodos no especíﬁcos.

21 Validación y Verificación Los procedimientos de limpieza requieren de ambos: de validación y verificación Validación que la limpieza será efec:va Verificación que la limpieza fue efec:va

22 Validación y Verificación Métodos de Validación ELISA Microbiología tradicional Métodos PCR (DNA) Métodos de Verificación Pruebas rápidas para alérgenos Bioluminiscencia de ATP Proteínas (colorimetría)

23 Toma de muestra para validar la limpieza Debe asegurar la recuperación de los residuos de alérgenos de la superficie o del producto final, y el nivel de recuperación y repe:bilidad debe ser suficiente para cumplir con los criterios definidos para considerar efec:va la limpieza. Donde, cuando y como deben tomarse las muestras puede inferir en el resultado de la validación.

24 Toma de muestras: Aguas de lavado y enjuague Agua de enjuague: solo cuando no pueda accederse al equipo (CIP) Agua de lavado: si se recicla o si es común (lavado de bandejas o utensilios. Agua de pre- enjuague y de enjuague (para verificar la reducción del alérgeno) Material de purga: limpieza a seco (industria farmacéu:ca) Análisis de agua de enjuague y primer producto para determinar maní (4 limpiezas/3 muestras) Etapa de la limpieza ELISA para maní (ug/ml) Test de Bradford (ug/ml) Resultado Agua de enjuague Pre- lavado 98, ,9 917,6 posi:vo Luego de limp. alc. ND ND nega:vo Luego de limp. Ac. ND ND nega:vo Producto Luego de limpieza ND 1,1 ND nega:vo Stephan et al (2004)

25 Toma de muestras: Superficies Hisopos pre- humedecidos (compa:bles con el método analí:co seleccionado) Enjuague de partes con una can:dad conocida de solución de extracción. En caso de polvos alérgenos (harinas) permi:r que se asiente antes de tomar la muestra.

26 Toma de muestras: Producto final Primer producto del lote (luego de la limpieza) Verificar que las materias primas no contengan alérgeno

27 Método no específico: Bioluminiscencia de ATP Efec.vidad de la sani.zación Detecta ATP proveniente de fuentes biológicas Hisopos convencionales de ATP (higiene) Hisopos de alta sensibilidad (residuos de alimentos) Ventajas: rápido (< 30 segundos) Más económico que ELISA La prueba se lleva a cabo in situ ( :empo real ) Limitaciones: Aplicación (limpieza húmeda de superficies) Puede tomar ATP de la fuente de suministro de agua Mide la presencia de ATP, no de alérgenos Indicador de alérgeno: solamente validando y correlacionando con prueba alérgeno- específica

28 Método no específico: Proteínas totales Efec.vidad de la sani.zación Ventajas: rápido (< 30 segundos) Más económico que ELISA Mide proteínas Limitaciones: Aplicación (limpieza húmeda de superficies) Determina todas las proteínas (no solo alérgenos)

29 Desacos en la detección de alérgenos Falta de materiales de referencia Sin estandares cer.ficados disponibles Qué an.cuerpo detecta la proteína correcta?? For:ficación diwcil Extracto de la proteína (que se detecta?) Alérgeno (alimento) For:ficar extracto For:ficar muestra

30 Cuando analizar alérgenos? Inves:gación de reclamos Validación de métodos de limpieza Validación de materias primas (Análisis del producto terminado?)

31 Herramientas diagnós.cas para la determinación de alérgenos en alimentos Mgr., Bqca. Patricia Silvina Knass Romer Labs La:n America Adviser

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