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2 En microbiología industrial hay que pensar en mantener las colecciones durante períodos de años y no de meses, por lo tanto se utilizan otras técnicas que nos ahorran trabajo y disminuyen los riesgos.

3 Subcultivos Consiste en la transferencia periódica del cultivo en un medio nutritivo fresco (intérvalo de transferencia varía con el organismo) Inconvenientes Posibilidad de que aumenten las mutaciones Riesgo contaminación Alteración del medio de cultivo (desecación)

4 Mantenimiento bajo capa de aceite Simple y efectiva Consiste en cubrir el cultivo (medio sólido) con una capa de aceite mineral o vaselina. Pueden conservarse por periodos de tiempo largos (varios años) a temperatura ambiente. Pueden ocurrir mutaciones, luego de los 3 años de mantenimiento.

5 Desecación La eliminación del agua (deshidratación) es un método de conservación que reduce drásticamente el metabolismo. No todos los microorganismos sobreviven a estos métodos de secado, por lo que se hace necesario añadir agentes protectores (leche descremada, glutamato sódico al 10%). Es importante mantener el producto sellado (tapón de rosca o ampolla) para evitar el contacto con el aire ya que son higroscópicos.

6 Soportes, se suelen utilizar arena suelo gel de sílica discos o tiras de papel agar discos de gelatina Estos deben ser previamente secados y esterilizados por calentamiento con aire caliente (no se recomienda utilizar autoclave y sí calor seco).

7 Sobre estos soportes se añade la suspensión de los microorganismos y se deja secar a temperatura ambiente. Estos métodos de secado son particularmente útiles para conservar microorganismos productores de esporas (actinomicetos).

8 Congelación Al bajar la temperatura hasta el punto de congelación o por debajo de éste se reduce el metabolismo drásticamente hasta el caso de prácticamente anularlo con nitrógeno líquido (-196 C).

9 La formación de cristales de hielo (pueden romper las células), para evitar esto se deben utilizar: suspensiones que contengan el mínimo de sales posibles agentes protectores como el glicerol (25%) o dimetilsulfóxido (DMSO al 10%) que neutralizan el efecto de las sales. Algunos recomiendan una bajada gradual de temperatura (1 C/min) hasta -20 C para luego enfriar rápidamente. La descongelación debe ser rápida.

10 La congelacion debe ser lenta a la par con una descongelación rápida Condiciones Un grado C por minuto hasta -20 C y luego un rápido descenso en la temperatura. Temperatura de conservación más baja recomendada es -70 C (esto evita la recristalización intracelular)

11 -196 C: nitrógeno líquido. Se utiliza para la conservación de bacterias, virus y líneas celulares. Existen varios problemas prácticos: el nitrógeno se evapora continuamente por lo que se debe rellenar regularmente; se deben utilizar recipientes que resistan bien estas temperaturas y que estén bien cerrados para evitar la entrada del nitrógeno. -30 C: congelador de frigorífico. -70 C: nieve carbónica (CO 2 sólido) o ultracongeladores Es el método más utilizado en los laboratorios de microbiología.

12 Ventajas Se puede usar por periíodos largos o cortos de tiempo. Se utiliza N 2 líquido a -196 C. El microorganismo se cultiva hasta la fase estacionaria (muestra más resistencia a daños por congelación y descongelación). Se utiliza un crioprotector.

13 Glicerol 10% Dimetilsulfóxido Glucosa Dextranos Sacarosa Suero de conejo Lactosa Extracto de malta

14 Liofilización Es el método más utilizado por las colecciones internacionales de cultivos de microorganismos. Consiste en congelar rápidamente una suspensión de microorganismos y eliminar el agua como vapor de agua directamente del hielo sin pasar por el estado líquido. El sistema requiere tres componentes: mecanismo de congelación bomba de vacío una trampa de agua.

15 Los microorganismos liófilizados se conservan entre 0 y 5 C durante muchos años. Para su recuperación se resuspenden los organismos en el medio de cultivo adecuado y se incuban a la temperatura adecuada.

16 Debido a la gran variedad que presentan los microorganismos no existe ningún método óptimo para todos. En líneas generales podemos asumir lo siguiente:

17 En general: La mayor parte de los cultivos se han mantenido como subcultivos seriados a temperaturas entre 10 y 15 C. Para crecer estos cultivos se necesita luz, ya que son fotosintéticos. Las algas no toleran bien la liofilización ni la desecación. Con relación a la congelación los mejores resultados se obtienen con nitrógeno líquido.

18 Prácticamente se han usado todos los métodos conocidos con buenos y malos resultados, aunque en líneas generales el mejor método es la liofilización debido a su facilidad de transporte.

19 Se han utilizado todos los métodos, pero obteniendo en líneas generales baja estabilidad. Se recomienda para su conservación durante largos períodos de tiempo el nitrógeno líquido.

20 La mayoría de los hongos pueden conservarse por desecación en suelo.

21 Waites, M.J.; Morgan, N.L.; Rockey, J.S. & Higton G. (2001). Industrial Microbiology, an Introduction. Blackwell Science. 288pp.

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