OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS

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1 Introducción Objetivo Fundamento Trabajo Práctico Nº 4 OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS Procedimiento Resultados Instrucciones para el uso del Sistema Anaeróbico Gaspak Bibliografía INTRODUCCIÓN En los ambientes naturales los microorganismos se encuentran usualmente como poblaciones mixtas, pero si queremos estudiarlos, caracterizarlos e identificarlos, necesitamos tenerlos como cultivos puros. Un cultivo puro es aquel en el que todos los microorganismos provienen de una sola célula. La obtención de un cultivo puro, a partir de una población mixta, se lleva a cabo en dos etapas: 1. La muestra debe diseminarse de manera tal que los diferentes microorganismos queden lo suficientemente separados sobre la superficie de un medio de cultivo sólido, de manera que luego de la incubación ellos formen colonias visibles aisladas. Este proceso se conoce como aislamiento. En esta placa tendremos diferentes tipos de colonias correspondientes a los diferentes microorganismos presentes en la población original.

2 2. Luego de tener las colonias aisladas, éstas deben transferirse con el filamento a un tubo que contenga agar nutritivo estéril para cultivar esa colonia aislada; este procedimiento se conoce como transplante. Para garantizar la pureza del cultivo obtenido, es conveniente, a partir de cada tipo de colonia aislada, repetir el proceso de aislamiento antes descrito. Se considerará que se ha obtenido un cultivo puro, cuando al realizar este proceso, todas las colonias obtenidas presenten las mismas características. El medio de cultivo utilizado en el proceso de aislamiento dependerá, entre otros factores, de los requerimientos nutricionales de los microorganismos que se espera aislar y de la presencia de microorganismos que, por sus características y/o por la cantidad en que se encuentren en la muestra, dificulten la obtención del microorganismo objeto del aislamiento. En este último caso, se deben utilizar medios de enriquecimiento y medios selectivos que inhiban el desarrollo de gérmenes contaminantes. La temperatura y otras condiciones de incubación, variarán según los microorganismos, usualmente la temperatura óptima de los microorganismos patógenos para el hombre oscila entre 30 y 40ºC. Cuando el microorganismo que se intenta aislar es anaeróbico, deben tomarse las precauciones necesarias a fin de eliminar la presencia de oxígeno en el ambiente donde se desarrollará el mismo. Basándose en el origen y naturaleza de la muestra se pueden inferir los posibles microorganismos que se encuentran presentes en la misma, y ese conocimiento ayudará en la selección del medio y las condiciones de cultivo adecuadas. Para iguales fines, es de gran utilidad el conocimiento de los síntomas de la enfermedad que padece la persona de quien se obtuvo la muestra analizada. OBJETIVO Al finalizar el trabajo práctico el estudiante estará en capacidad de: Ejecutar las técnicas básicas para el aislamiento de microorganismos en cultivo puro, a partir de una muestra que contiene una población mixta. FUNDAMENTO Al diseminar sobre un medio de cultivo sólido una muestra de bacterias, diluida convenientemente, las células individuales quedarán lo suficientemente separadas unas de otras y crecerán en forma de colonias aisladas, a partir de las cuales se puede obtener un cultivo puro. 4.2

3 PROCEDIMIENTO Preparación de las placas de aislamiento (Cada estudiante preparará dos placas) 1. Marcar la tapa de cada placa estéril con su número de equipo y la fecha. 2. Fundir en un baño de agua hirviendo los tubos con 20 ml de agar nutritivo 1, luego de que estén completamente fundidos, colocar en un baño de agua a 50 C. 3. Tomar el tubo con los 20 ml de agar fundido y enfriado a 50 C, secarlo bien por fuera, flamear la boca del tubo y verter en la placa de Petri. 4. Después de verter el medio, si es necesario, rotar la placa cuidadosamente para distribuir el agar en forma homogénea, teniendo cuidado de no salpicar la tapa. 5. Dejar solidificar, lo cual ocurre en aproximadamente 10 minutos y proceder a secar las placas abiertas y en posición invertida en la estufa. 1 Con fines didácticos y por razones de índole económica, las muestras suministradas a los alumnos han sido contaminadas con gérmenes que se desarrollan bien en agar nutritivo, por tal motivo, éste será el medio de cultivo que utilizarán para el trabajo de aislamiento. Sin embargo, debe recordarse que, el o los medios de cultivo a utilizar para el aislamiento, se seleccionarán basándose en los requerimientos de los microorganismos más frecuentemente encontrados en la muestra analizada. 4.3

4 Aislamiento 1. Tomar una gota de la suspensión microbiana con el asa de platino estéril y fría, y colocarla sobre el agar en el sitio marcado con una X en la figura siguiente. X 2. Diseminar la muestra haciendo estrías con el asa sobre el agar en la dirección indicada en la figura siguiente. X 3. Esterilizar el asa y enfriarla en el centro de la placa, hacer estrías en dirección perpendicular a las estrías anteriores como se indica en la figura siguiente. X 4. Esterilizar el asa y enfriarla en el centro de la placa, hacer estrías en dirección perpendicular a las estrías anteriores como se indica en la figura siguiente. 4.4

5 X 5. Incubar una de las placas en posición invertida y en condiciones aeróbicas a 32,5 +/- 2,5ºC por 24 h. 6. Introducir la otra placa en posición invertida en una jarra para cultivo de anaerobios (sistema Gaspak e incubar a 32,5 +/- 2,5ºC por 24h, siguiendo las instrucciones para el uso de las jarras que se suministran en la página 3.8). 7. Observar el crecimiento obtenido en las placas. RESULTADOS Anotar lo observado Dibujar lo observado Estudio de la morfología de la colonia Cuando se cultivan los microorganismos sobre medios de cultivo sólidos, las células aisladas se multiplican sucesivamente hasta dar un crecimiento visible conocido con el nombre de colonia, las características de estas colonias son estudiadas y se usan en la identificación de las especies. 4.5

6 Las características que se le estudian a las colonias son: Tamaño Pigmentación Forma Borde Elevación Apariencia general Superficie Forma de las colonias ENTERO ONDULADO LOBULADO EROSIONADO RAMIFICADO RIZADO Borde de las colonias PLANA ELEVADA CONVEXA PULVINADA Elevación de las colonias Elevación de las colonias UMBILICADA 4.6

7 Observar a simple vista y con la ayuda de la lupa, las colonias de las placas que le suministre el profesor, para determinar las características de las mismas. RESULTADOS Anotar lo observado Dibujar lo observado Transplante 1. Usando el filamento, trasplantar a un tubo con agar nutritivo inclinado, la colonia que le indicó el profesor, de la que ya anotó las características de acuerdo con lo indicado en el aparte anterior. 4.7

8 2. Incubar a 32,5 +/- 2,5ºC por 24 horas. RESULTADOS Anotar lo observado Dibujar lo observado INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL SISTEMA ANAERÓBICO GASPAK 1. Colocar las placas o los tubos en la jarra Gaspak. 2. Tomar un sobre indicador anaeróbico, abrirlo hasta la mitad y colocarlo como se indica en la figura siguiente, de manera que la tira de papel sea visible desde el exterior de la jarra. En condiciones anaeróbicas, el indicador se mantiene incoloro, en condiciones aeróbicas se torna azul. 3. Cortar la esquina de un sobre generador de Hidrógeno + CO 2 Gaspak y colocarlo en la jarra como indica la figura siguiente. 4.8

9 4. Medir con una pipeta 10 ml de agua en el sobre, por el extremo abierto. No introducir la pipeta o algún otro objeto en el interior del sobre. 5. Colocar la tapa de la jarra, luego la pinza y asegurarla con el tornillo apretándolo a mano. No usar ninguna herramienta para apretar la tapa porque puede dañarla. No usar grasa en el borde de la jarra, la empacadura proporciona un sello efectivo. 6. Colocar el sistema Gaspak en la estufa a 32,5 +/- 2,5ºC. BIBLIOGRAFÍA BBL Manual of products and laboratories procedures Fifth edition. BBL division of Beckton, Dickinson and Co. Benson H. J Microbiological Application. A Laboratory Manual in General Microbiology. Third edition. Wm. C. Brown Company Publishers. Dubuque, Iowa Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M Microbiología. Manual de Métodos Generales. Segunda edición. Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. Seeley, H.W.I, Jr and P.J. Van Demark Microbes in action. W.H. Freeman and Company. Prof. Magaly Pedrique de Aulacio Prof. Sofía Gutiérrez de Gamboa Noviembre 2001 Revisión

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