PRACTICA 3 TECNICAS BASICAS DE CULTIVO

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1 PRACTICA 3 TECNICAS BASICAS DE CULTIVO OBJETIVOS DE APRENDIZAJE: Cuando haya realizado el experimento, usted deberá ser capaz de: 1. Llevar a cabo la técnica de transferencia aséptica de microorganismos para subcultivo. 2. Esterilizar correctamente los instrumentos de inoculación en la flama del mechero. 3. Manipular correctamente sus dedos para remover y recolocar las tapas de tubos de cultivo. 4. Realizar los procedimientos de rayado de placas (siembra por estrías y/o cultivo por extensión para separar células de un cultivo mixto de modo que se aíslen colonias discretas. 5. Preparar un cultivo puro o stock de un organismo usando aislados de cultivos mixtos preparados en una placa de Petri por el método de rayado de placas y/o siembra por extensión. PRINCIPIO: Los microorganismos están por doquier: suelo, agua, alimentos, efluentes y en las superficies corporales. El microbiólogo separa estas poblaciones mixtas en especies individuales para su estudio. El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio. Un cultivo conteniendo una sola especie de células, no adulteradas, se llama cultivo puro. Para aislar y estudiar microorganismos en cultivos puros, se requieren una serie de instrumentos básicos de laboratorio y la aplicación de técnicas específicas. Medios: La supervivencia y crecimiento continuo de microorganismos depende de un suministro adecuado de nutrientes y un ambiente favorable al crecimiento. Como nutrientes, la mayoría de los microorganismos necesita de sustancias solubles de bajo peso molecular que se derivan frecuentemente de la degradación enzimática de nutrientes complejos. Una solución conteniendo estos nutrientes es un medio de cultivo. Básicamente, los medios de cultivo son 1

2 líquidos, solidos o semisólidos. Un medio liquido carece de un agente solidificante y se denomina caldo de cultivo. Si a un caldo se le adiciona un agente solidificante como agar, se forma un medio semisólido o sólido. El agar se licúa a 100 ⁰C y solidifica a 40 ⁰C. El medio sólido tiene la ventaja que sobre su superficie endurecida crecen microorganismos que pueden ser aislados en colonias discretas usando técnicas especializadas. Cada colonia es un aglomerado de células que se originan por la multiplicación de una única célula y representa el crecimiento de una única especie de microorganismo (cultivo puro). Los medios sólidos se pueden tener en placas especiales, tipo plato, llamadas placas de Petri, así como en tubos de cultivo, en posición inclinada (agar slant), para siembra de microorganismos en la superficie. Los tubos inclinados son muy buenos para almacenar cultivos puros. Tubos similares, pero en los que el medio se solidifica en posición recta, se utilizan para siembra de microorganismos a lo interno del medio (agar deep tube), para estudiar los requerimientos de gas de los microorganismos. Las placas de Petri ofrecen una gran superficie de cultivo, lo cual permite un mejor aislamiento y estudio de microorganismos. Esterilización: Es el proceso de eliminar todas las formas de vida de un medio o material. Esto puede lograrse por calor, filtración, agentes químicos y radiación. Tubos de cultivo y Placas de Petri: Tubos de cultivo de vidrio y placas de Petri, de vidrio o plástico, son utilizados para el cultivo de microorganismos. Los tubos de cultivo deben estar provistos de un cierre adecuado, como los 2

3 tapones modernos de metal o plástico que son de uso común. Las placas de Petri proveen mayor área de cultivo y crecimiento. Normalmente contienen de 15 a 20 ml de medio, el cual se añade derretido y se deja solidificar antes de su uso. La placa consiste en dos partes, la inferior que contiene el medio, y la parte superior que sirve de tapa. Luego de ser inoculadas (sembradas con microorganismos), las placas de Petri se incuban en posición invertida, para evitar que la condensación que se forma en la tapa gotee en la superficie del agar solidificado. Instrumentos de Transferencia: Los microorganismos deben ser transferidos de un recipiente a otro, o de un cultivo stock a diversos medios para mantenimiento y estudio. Una transferencia de dicho tipo se llama subcultivo, y debe llevarse a cabo en condiciones estériles para evitar contaminación. Para realizar las transferencias se utilizan agujas o asas bacteriológicas, hechas de metal inerte como platino, e insertadas en un manubrio de metal. Son muy duraderas y esterilizables incinerándolas en la porción azul (la más caliente) de la llama de un mechero. Para la transferencia de medios líquidos, debe utilizarse una pipeta esterilizada. Cámaras de Incubación: Los microorganismos deben ser cultivados a su temperatura óptima de crecimiento. Por esta razón, se utilizan unas cámaras llamadas incubadoras, para mantener la temperatura deseada durante todo el proceso de crecimiento. La mayoría de las incubadoras utilizan calor seco. Se mantiene la humedad ambiental colocando un beaker con agua durante el periodo de incubación. Transferencia de microorganismos de un medio a otro: Los microorganismos son transferidos de un medio a otro por subcultivo. Esta técnica es de importancia básica y se utiliza rutinariamente para preparar y mantener cultivos stock, y en procedimientos de tests microbiológicos. Como los microorganismos están en todos los lugares y en todas las superficies, éstas pueden ser fuente de contaminación externa e interferir con resultados experimentales a menos que se utilicen las técnicas adecuadas durante el subcultivo. Los pasos esenciales para la transferencia aséptica de microorganismos son los siguientes: 1. El asa bacteriológica o la aguja inoculadora deben ser esterilizadas manteniéndolas en la porción más caliente de la llama de un mechero (la parte azul interna), hasta que se torna roja. Luego la parte superior se pasa rápidamente por la flama. El asa se mantiene en la mano, sin tocar superficies, y se deja enfriar por 10 a 20 segundos. En la palma de 3

4 la otra mano se sostienen el tubo de cultivo y el tubo que será inoculado, asegurados con el pulgar. Los dos tubos se separan para formar una V en la mano. 2. Se remueven las tapas de los tubos con los dedos meñique y anular de la mano que sostiene el asa. Se sostienen en la mano mientras dure el procedimiento, sin colocarlos en la mesa, para no comprometer el procedimiento estéril. Los cuellos de los tubos se pasan suavemente por la llama del mechero y el inoculador se enfría tocando la superficie interna del tubo de cultivo antes de remover parte del inóculo. 3. Se toma una muestra del inóculo tocando suavemente la superficie del medio en una parte que muestre crecimiento, sin penetrar en el medio con el asa. 4. El asa, lleno de células, se introduce en el medio de cultivo. En un caldo de cultivo, el inoculador se sumerge y se agita ligeramente. En un medio sólido, el inoculador se pasa suavemente por la superficie en línea recta o zigzag. En un medio de cultivo profundo (deep tube), la aguja de inoculación se inserta hasta el fondo del tubo en línea recta y se saca rápidamente a lo largo de la línea de inserción. 5. Luego de la inoculación, se extrae el instrumento, se flamean de nuevo las bocas de los tubos y se les coloca de nuevo la misma tapa a cada tubo. 6. El asa bacteriológica o aguja son flameados de nuevo para destruir organismos restantes. 4

5 Identifique el tubo con el nombre del microorganismo y el número de grupo Sostenga los tubos en la mano separados por el pulgar Flamee el asa o aguja hasta que esté al rojo vivo Destape los tubos sosteniendo el asa con las manos. Flamee la boca de los tubos pasándolos por la llama del mechero. En caldo: agite asa en el caldo suavemente. En slant: siguiendo la inserción, trace un dibujo en zigzag de abajo hacia arriba. En tubo profundo: Inserte la aguja hasta el fondo del tubo y extráigala en la misma dirección. Flamee la boca de los tubos pasándolos por la llama del mechero. Tape de nuevo los tubos Flamee el asa o aguja hasta que esté al rojo vivo 5

6 Aislamiento de colonias discretas de un cultivo mixto: Las técnicas usadas para aislar colonias discretas requieren que el número de organismos en el inóculo sea reducido, de modo que, luego de la inoculación, las células individuales estén lo suficientemente lejanas unas de otras en la superficie del agar y se efectúa, de dicha manera, la separación de las diferentes especies presentes. Uno de las técnicas usadas para lograr la dilución deseada se conoce como Método de Rayado de Placas o siembra por estrías. En este método se unta una cantidad del cultivo en la superficie de un plato de agar. Vamos a describir el método de 4 cuadrantes para el rayado: a. Coloque un asa de cultivo en el agar. Flamee el asa (inoculador) y enfríelo tocando una porción no usada del agar cercano a la periferia del mismo, y páselo varias veces a lo largo del área o cuadrante 1. b. Flamee el asa de nuevo y enfríela, gire el plato de Petri 90⁰. Toque con el asa una esquina del cultivo en el área 1 y arrástrelo varias veces a través del área 2. El asa no debe entrar de nuevo al área 1. c. Flamee el asa de nuevo y enfríela, gire el plato de Petri 90⁰. Repita el paso b en el Área 3. d. Sin flamear de nuevo, repita el paso c, comenzando en una esquina del Área 3 y arrastrándola al Área 4. No deje que el asa toque las áreas 1 a 3. Aislamiento de Cultivos puros a partir de preparaciones de rayado de placas o siembra por extensión. Cuando se desarrollan colonias discretas, bien separadas, en la superficie del medio nutritivo, cada una puede ser tomada con una aguja de inoculación y transferida a un tubo de agar inclinado. Cada uno de estos cultivos representa el crecimiento de una única especie bacteriana y se llama cultivo puro o stock. 6

7 Flamee la aguja hasta que esté roja Con la aguja, toque la superficie de la colonia seleccionada Quite la tapa del tubo y flamee la boca Inocule el agar dibujando con la aguja en zigzag a lo largo de la superficie del agar. No penetre el agar. Flamee la boca del tubo y coloque la tapa de nuevo Flamee la aguja nuevamente hasta que esté roja 7

8 EN LA MESA DE TRABAJO PARTE A: TECNICAS DE TRANSFERENCIA DE CULTIVOS. MATERIALES Y EQUIPOS: CULTIVOS: Cultivo de 24 horas en caldo y en agar inclinado (slant) de Serratia marcescens. MEDIOS DE CULTIVO: Por cada grupo de trabajo: un caldo de cultivo nutritivo, un tubo inclinado de agar nutritivo y un tubo de agar nutritivo. EQUIPAMIENTO: Mechero de alcohol, asa bacteriológica, aguja de inoculación, y lápiz de marcado de cristalería. PROCEDIMIENTO: 1. Identifique todos los tubos de medios estériles indicando siempre: a. Nombre del microorganismo, b. Nombre del medio, c. Dilución de la muestra (si la hay), d. Nombre del grupo e. Fecha 2. Siguiendo el procedimiento descrito e ilustrado previamente, realice las siguientes transferencias: a. S. marcescens, del caldo de cultivo a un tubo de agar nutritivo inclinado, a un tubo de cultivo profundo (deep tube), y a un caldo nutritivo. b. S. marcescens, del tubo de agar inclinado a un tubo de agar nutritivo inclinado, a un tubo de cultivo profundo (deep tube), y a un caldo nutritivo. 3. Incube todos los cultivos por 24 a 48 horas, a 25 ⁰C. PARTE B: TECNICAS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS. 8

9 MATERIALES Y EQUIPOS: CULTIVOS: Cultivos de 24 a 48 horas, en caldo nutritivo, de una mezcla compuesta por una parte de Serratia marcescens y tres partes de Micrococcus luteus y una mezcla de una parte de Escherichia coli y diez partes de Micrococcus luteus y una muestra de cultivos mixtos del ambiente (superficie de una mesa, lavamanos, fuente de agua, etc.). MEDIOS: 3 placas de Petri con Tripticase Soy Agar por cada grupo de trabajo, por cada técnica de cultivo a ser realizada. EQUIPAMIENTO: Mechero de alcohol, asa bacteriológica, tubos de cultivo con 1 ml de agua estéril, marcador de cristalería, hisopos estériles. PROCEDIMIENTO: 1. Siguiendo el procedimiento descrito de rayado de placas, prepare una inoculación de cada cultivo de prueba en una placa de Petri debidamente identificada. Observe con cuidado las indicaciones del profesor. 2. Prepare un cultivo mixto del ambiente: a. Humedezca un hisopo estéril con el agua estéril. Remueva el exceso de agua presionando el hisopo contra la pared interna del tubo. b. Con el hisopo humedecido, obtenga su muestra mixta de uno de los ambientes descritos en la sección de Cultivos. c. Coloque el hisopo contaminado de nuevo en el tubo con agua. Agite suavemente y déjelo 5 minutos en reposo. d. Realice un rayado de placas (o una siembra por extensión) en una placa de Petri debidamente identificada. 3. Incube todas las placas en posición invertida, por 48 a 72 horas a 25 ⁰C. 9

10 PARTE C: AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS MATERIALES CULTIVOS: Cultivo mixto, en agar nutritivo, por rayado de placas o siembra por extensión, de S. marcenscens y M. luteus, M. Luteus y E. coli y la muestra ambiental de la parte B. MEDIOS: 4 tubos inclinados (slants) de Tripticase Soy Agar por cada grupo de trabajo. EQUIPOS: Mechero de alcohol, aguja de inoculación, marcador de cristalería. PROCEDIMIENTO: 1. Transfiera asépticamente, tomando muestras de colonias bien aisladas, el M. luteus amarillo, la blanca E. coli y las roja S. marcescens, y una colonia discreta de la muestra ambiental, a los tubos inclinados de agar debidamente identificados. 2. Incube los tubos a 37 ⁰C hasta la próxima práctica. NOTA: Esta parte se hace en la sesión de una hora donde se evalúan los resultados de las prácticas. 10

11 PRACTICA 3 OBSERVACIONES Y RESULTADOS PARTE A: 1. Examine todos los cultivos buscando crecimiento de organismos. Esto se indica como turbidez en caldo de cultivo y la apariencia de crecimiento naranja-rojizo en la superficie del agar inclinado y a lo largo de la línea de inoculación en el tubo profundo (deep tube). 2. Registre sus observaciones en la siguiente tabla: Crecimiento (+) o (-) Pigmentación naranjaroja (+) o (-) Dibuje la distribución de crecimiento Caldo de Cultivo Agar Inclinado Agar Profundo 11

12 PREGUNTAS DE REPASO: 1. Explique por qué los siguientes pasos son esenciales durante el subcultivo: a. Flamear el instrumento de inoculación antes y después de cada inoculación. b. Sostener las tapas de los tubos en la mano como se hizo. c. Enfriar el instrumento de inoculación antes de obtener el inóculo. d. Flamear el cuello de los tubos inmediatamente después de destaparlos y antes de volver a taparlos. 2. Describa los propósitos del procedimiento para subcultivo. 3. Explique por qué se usa una aguja recta de inoculación para inocular el tubo de agar profundo. 4. Observando su cultivo en el tubo de agar inclinado, usted sospecha que el cultivo está contaminado. Bosqueje el método que utilizaría para verificar si su sospecha es justificada. 12

13 PARTE B: Examine todos los cultivos en placas de Petri para identificar la distribución de las colonias. Registre sus resultados en la tabla siguiente. 1. Dibuje la distribución de las colonias en cada placa de cultivo. 2. Seleccione dos colonias discretas que difieran una de otra en cada placa. Describa las colonias de acuerdo a su (ver guía al final): a. Forma: circular, irregular o extendida. b. Elevación: llana, ligeramente elevada, muy elevada. c. Pigmentación d. Tamaño: puntiaguda, pequeña, mediana o grande. 3. Retenga los cultivos para la parte C del experimento. Dibujo de las colonias que aparecen en cada placa de agar S. marcescens y M. luteus M. luteus y E. coli Descripción de la colonia: Forma: Elevación: Pigmentación: Tamaño: 13

14 Muestra medioambiental Dibujo de las colonias que aparecen en cada placa de agar Descripción de la colonia: Forma: Elevación: Pigmentación: Tamaño: PARTE C: 1. Dibuje e indique el tipo de crecimiento de cada aislado de cultivo puro (use como guía para evaluar el tipo de crecimiento la figura al final de la práctica). 2. Observe el color del crecimiento y registre su pigmentación. 3. Indique los nombres de los organismos aislados. 14

15 Dibuje la distribución del crecimiento en el agar inclinado Pigmentación: Tipo de crecimiento: Nombre del organismo: PREGUNTAS DE REPASO: 1. Puede prepararse un cultivo puro a partir de un cultivo mixto en caldo o en agar inclinado? Explique. 2. Por qué se utiliza una aguja para aislar colonias individuales de una placa sembrada por estrías? 15

16 3. Cómo puede determinar si la colonia que se eligió para aislar es un cultivo puro? Formas Circular Rizoide Entero Irregular Plana Lobulado Ondulado Elevada Convexa Márgenes Serrado Filamentoso Umbonada Elevación Colonias en Placas de Petri Filiforme Espinado Perlado Difuso Arborescente Rizoide Crecimiento en agar slant 16

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