Manejo de la bacteria en el laboratorio

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1 Guía Práctica 2 Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Enfermedad: Bacteriosis común del frijol Manejo de la bacteria en el laboratorio Guillermo Castellanos, Experto en Investigación 2 Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigación Gloria Mosquera, Fitopatóloga, Ph.D., Líder de Proyecto Fitopatología de Frijol Contenido Generalidades 2-2 Procedimientos 2-3 A. Recolección y transporte de las muestras 2-3 B. Preparación del medio de cultivo YCDA 2-6 C. Aislamiento de Xap y Xpf 2-7 D. Incremento de la bacteria 2-10 E. Inoculación de las plantas Producción del inóculo Inoculación de plantas en el invernadero Inoculación en el campo 2-13 F. Conservación de la bacteria para almacenamiento Liofilización Conservación como suspensión en solución de peptona-sucrosa, en papel filtro a 20 C 2-20 G. Recuperación de la bacteria almacenada Liofilizada y conservada en ampolletas Conservada a 20 C en papel filtro de suspensión en peptona-sucrosa 2-23

2 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Generalidades La bacteriosis común es causada por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) (Smith) Dye y por Xanthomonas phaseoli var. fuscans (Xpf) (Burkholder) Starr & Burkholder, dos bacterias que inducen síntomas idénticos en hojas, tallos y vainas del frijol común. Su temperatura óptima de desarrollo está entre 28 y 30 C. El crecimiento de estas dos bacterias patógenas en un medio de cultivo presenta características diferentes: Xpf produce un pigmento de color café después de 24 horas en el medio de cultivo YCDA, mientras que Xap no produce esos pigmentos. La infección por bacteriosis común en las hojas y las vainas del frijol se manifiesta del modo siguiente: En las hojas, los síntomas iniciales son puntos acuosos que aparecen, generalmente, en su envés; estos puntos aumentan de tamaño y forman una lesión grande, como se aprecia en la Foto 1. Foto 1 En las vainas, los síntomas son manchas húmedas pequeñas que, cuando crecen y se juntan, cubren gran parte de la vaina, la deforman e infectan las semillas que están en su interior. Las áreas afectadas se muestran flácidas y se rodean de un borde de color amarillo que, después de cierto tiempo, se torna de color café y llega a cubrir un área grande de la hoja o de la vaina. La enfermedad se transmite a la planta a partir de semillas infectadas. 2-2

3 Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Enfermedad: Bacteriosis común del frijol Procedimientos A. Recolección y transporte de las muestras Para poder aislar la bacteria, es necesario obtener material vegetal (hojas o vainas de frijol) que presente los síntomas típicos de la enfermedad. Materiales Toallas de papel Bolsas de papel Rótulos para identificar el material Toallas de papel. La muestra de tejido de frijol infectado (de vainas, hojas o tallos) que se colectó se envuelve en una toalla de papel que sirve, además, para absorber su humedad. Si no hay toallas, pueden usarse materiales similares como servilletas, papel higiénico, pañuelos faciales y, en último caso, papel periódico. 2-3

4 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Bolsas de papel. Las muestras de tejido infectado envueltas en algún papel absorbente se colocan en bolsas o sobres de papel. No se deben usar bolsas plásticas porque no son porosas y contribuyen, por ello, a la acumulación de humedad en su interior; esta humedad favorece el crecimiento de microorganismos saprofitos, los cuales dificultarán el aislamiento del patógeno que se hace partiendo de tejidos de frijol. Rótulos para marcar las muestras. Es muy importante identificar claramente la muestra con la siguiente información: variedad (o genotipo) de frijol, tamaño y color de sus granos, lugar donde se toma la muestra (localidad, provincia, departamento, país), fecha de recolección de la muestra, nombre del recolector y, en lo posible, latitud y longitud (aproximadas) del lugar en que se hizo la recolección. El rótulo debe quedar bien adherido en cada muestra. Recomendaciones Indicar en el rótulo si la recolección se hizo en el campo de un agricultor o en una estación experimental. Cuando no haya suficientes rótulos para todas las muestras, marcar las bolsas con un código y registrar la información completa en una libreta de campo. 2-4

5 Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Enfermedad: Bacteriosis común del frijol No recolectar material vegetal húmedo; si está en esas condiciones, secarlo con toallas de papel antes de ser transportado. Una vez en el laboratorio, y si no se procesa inmediatamente, dejarlo sobre toallas de papel al aire libre para que termine de secarse. Pasos del proceso Paso 1 Tomar muestras de hojas o vainas que presenten los síntomas de la bacteriosis común (ver A. Recolección y ). Paso 2 Envolver la muestra en una toalla de papel, colocarla en una bolsa o sobre de papel y adherir a ésta el rótulo que corresponda (ver A. Recolección y ). Paso 3 Enviar las muestras, tan pronto como sea posible, al sitio o laboratorio donde se hará el aislamiento de la bacteria. Tener en cuenta dos recomendaciones: Nunca envíe las muestras dentro de bolsas plásticas o envueltas en papel aluminio (ver antes). No recolecte material vegetal húmedo; si está húmedo, secarlo con toallas de papel antes de transportarlo (ver antes). 2-5

6 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol B. Preparación del medio de cultivo YCDA Las siglas YCDA indican los componentes del medio: yeast (levadura), calcium carbonate (carbonato de calcio), dextrosa y agar. Materiales Extracto de levadura ( yeast extract ) 10 g Dextrosa 10 g Agar 15 g Carbonato de calcio (CaCO 3 ) 2 g Agua destilada 1000 ml Frascos erlenmeyer de 1000 ml 2 Cajas petri Preparación Se pesan los ingredientes, se colocan en un recipiente grande, que puede ser un vaso de precipitado, y se les agrega el agua; esta solución se envasa en dos frascos erlenmeyer (500 ml en cada uno). Los frascos erlenmeyer con el medio de cultivo YCDA se esterilizan en el autoclave. Esta máquina, con una presión de 20 libras y una temperatura de 121 C, realiza el proceso total de esterilización en 40 minutos. El medio esterilizado se deja enfriar hasta que pueda manipularse y se vierte luego en cajas petri, a razón de 20 ml por caja. 2-6

7 Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Enfermedad: Bacteriosis común del frijol C. Aislamiento de Xap y Xpf Materiales Material vegetal enfermo (muestra) Tijeras Pipeta pasteur Pinza Varilla de vidrio u otro instrumento que sirva para macerar Cajas petri pequeñas o tubos limpios (de plástico o vidrio) para macerar las muestras Agua destilada estéril Hipoclorito de sodio al 2.5% Medio de cultivo YCDA Asa microbiológica (Foto 2) Foto 2 Nota: Todos los procedimientos se deben ejecutar dentro de la cámara de flujo laminar; además, deben cumplirse todas las condiciones de asepsia y esterilidad que se exigen en un laboratorio. En otras palabras, se aplican siempre las buenas prácticas microbiológicas (BPM). Pasos del proceso Paso 1 Limpiar las tijeras con algodón impregnado en alcohol 70% y cortar luego varios trozos pequeños de la muestra. Sumergir los trozos durante 3 minutos en hipoclorito de sodio al 2.5% (Foto 3). Foto 3 2-7

8 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 2 Retirar el exceso de hipoclorito de sodio, y lavar la muestra con agua destilada estéril utilizando una pipeta pasteur estéril (Foto 4). Foto 4 Foto 5 Paso 3 Macerar la muestra en una caja petri pequeña (Foto 5) o en un tubo. Agregar luego 10 gotas de agua destilada estéril para obtener una suspensión de tejido macerado. Paso 4 Tomar con el asa microbiológica la suspensión del macerado (Foto 6) y hacer con ella un rayado sobre el medio de cultivo YCDA de una caja petri (Foto 7). Repetir el paso en otras cajas e incubarlas luego a 28 C. Foto 6 Foto 7 2-8

9 Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Enfermedad: Bacteriosis común del frijol Paso 5 Después de 36 horas de incubación, la bacteria habrá crecido sobre el medio. Del cultivo resultante tomar una colonia aislada, cuyas condiciones en el entorno del medio observado con el estereoscopio (Foto 8) indiquen que corresponde a la bacteria (colonia sugestiva de la bacteria), y con ella hacer un nuevo rayado en otra caja petri, como se indica en la Figura 1. Si hay cultivos contaminantes, su morfología es diferente de la del cultivo de esta bacteria y se nota a la vista. Proceder de igual manera con las colonias obtenidas de otros cultivos de la muestra de tejido infectado. De este modo se purifica una colonia que, una vez seleccionada, se incrementará más adelante. Foto 8 Técnica para el rayado de bacteria Para aislar bacterias de una muestra de tejido vegetal o para incrementar un cultivo de bacterias, seguir el patrón de rayas indicado en la Figura 1. El rayado se hace con un asa microbiológica estéril. Esta metodología permite la obtención de colonias aisladas y facilita la diferenciación entre las bacterias contaminantes y la bacteria de interés. Figura 1 2-9

10 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol D. Incremento de la bacteria Foto 9 Estas bacterias se incrementan partiendo de colonias que tengan entre 24 y 48 horas de crecimiento. Una colonia se transfiere a medio de cultivo YCDA haciendo en él un rayado con material de la colonia seleccionada mediante un asa microbiológica estéril (Foto 9). El rayado de bacteria se incuba luego a 28 C durante 24 a 48 horas. Se harán incrementos en cuantas cajas sean necesarias para la cantidad de plantas que se inocularán, ya sea en el campo o en el invernadero (ver cantidades sugeridas en E., 3. Inoculación en ). E. Inoculación de las plantas 1. Producción del inóculo Foto 10 Para este proceso se necesitan varios incrementos de la bacteria de 48 horas de crecimiento (en sus cajas petri). Pasos del proceso Foto 11 Paso 1 Obtener una suspensión del inóculo en las cajas en que están los incrementos agregando de 3 a 5 ml de agua destilada a cada una (Foto 10). Raspar luego con un triángulo estéril de vidrio la superficie de los incrementos para desprender del medio las colonias de la bacteria (Foto 11). 2-10

11 Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Enfermedad: Bacteriosis común del frijol Paso 2 Colectar la suspensión de todas las cajas del paso anterior en un solo recipiente esterilizado. Posteriormente medir la concentración de bacterias de esta suspensión en un espectrofotómetro. Ajustar la lectura de la suspensión en 0.5 unidades de absorbancia a una longitud de onda de 620 nm. Esto equivale a una concentración aproximada de 5 x 10 8 ufc/ml. (ufc = unidades formadoras de colonias) Paso 3 Tomar la suspensión del inóculo ajustada a la concentración de 5 x 10 8 ufc/ml (ver paso anterior) y diluirla 10 veces para obtener finalmente una concentración de 5 x 10 7 ufc/ml, que es la concentración de bacteria recomendada para hacer inoculaciones controladas. Ejemplo de dilución: diluir 100 ml de suspensión en 900 ml de agua. 2. Inoculación de plantas en el invernadero Paso 1 Insertar en un tapón de corcho (o de material blando similar) cinco agujas por el extremo del ojo, de manera que sobresalga del corcho 1.5 cm de cada punta; con estas puntas de aguja se perforará el tejido foliar para inocularlo. Tomar una caja petri y colocarle un círculo de espuma plástica de igual tamaño (Foto 12). Elegir en el invernadero plantas de 17 días de edad que presenten el primer trifolio expandido (ya desarrollado) en un 70%, aproximadamente. Foto

12 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 2 Verter un volumen de la suspensión de inóculo (Paso 3 anterior) en la espuma de la caja, de tal manera que la espuma quede totalmente impregnada, sin que la suspensión se derrame por los bordes en el momento de la inoculación. Colocar el trifolio (o un folíolo) elegido sobre la espuma. Perforar con las agujas del corcho el trifolio y presionarlas hasta el fondo de la caja para que, al retirarlas, la bacteria entre en contacto con las heridas de los folíolos e inicie la infección (Foto 13). Foto 13 Las plantas inoculadas permanecen en el invernadero a temperatura ambiente (temperaturas diurnas entre 25 y 30 C) hasta cuando sean evaluadas. Paso 3 Evaluar las plantas a los 15 días después de su inoculación (Foto 14), según la escala estándar del CIAT, cuyas categorías van del 1 al 9 y se distribuyen así: de 1 a 3: planta resistente de 4 a 6: planta de reacción intermedia de 7 a 9: planta susceptible Foto

13 Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Enfermedad: Bacteriosis común del frijol 3. Inoculación en el campo Se necesitan alrededor de 50 cajas petri (bien incrementadas con la bacteria) por hectárea de cultivo que se quiera inocular. Seguir los pasos siguientes: Obtener una suspensión de la bacteria de las cajas petri como se indicó antes y ajustar su concentración (ver E., 1. Producción del, Paso 3) en un volumen final de 12 litros para una bomba (aspersora) de motor. Aplicar alrededor de 10 a 12 bombas por hectárea de acuerdo con la edad del cultivo; se recomienda inocular a los 25 días después de la siembra y una semana después de esta inoculación (en la floración). F. Conservación de la bacteria para almacenamiento Para conservar estas bacterias se emplean dos métodos: la liofilización y el papel de filtro impregnado con una suspensión de la bacteria en solución de peptona-sucrosa. 1. Liofilización Es un método confiable para conservar los microorganismos que se almacenan. 2-13

14 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Materiales Liofilizador con dos tipos de soporte: gradilla y árbol. Ampolletas para liofilizar de cristal neutro ( neutral glass ) de 0.5 ml Pipetas pasteur largas Tijeras y algodón Cultivos de las bacterias en medio de cultivo YCDA Peptona al 10% Sucrosa (o dextrosa) al 20% Nota: Las cepas de bacteria que serán liofilizadas deben haberse incrementado 48 horas antes de este proceso (ver D. Incremento de ). Pasos del proceso Paso 1 Escribir o marcar en papel filtro la identificación de los aislamientos que se van a liofilizar. La identificación incluye el nombre de la bacteria (Xap o Xpf), el número del aislamiento (código empleado por cada laboratorio) y la fecha en que se almacena la bacteria. Esta información se escribe con letra pequeña en áreas reducidas del papel filtro (1 a 2 cm 2 ). 2-14

15 Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Enfermedad: Bacteriosis común del frijol Paso 2 Cortar, con una tijera estéril, los trozos de papel filtro con la identificación de la bacteria e introducir uno en cada ampolleta hasta el fondo. Preparar luego el tapón de algodón con que se tapa la ampolleta, de modo que cubra, más o menos, los dos tercios superiores de la ampolleta. Extender un trozo de algodón hasta que tenga unos 5 x 3 cm y enrollarlo sobre una pinza (o la parte delgada de un asa), presionando con los dedos hasta formar el tapón sobre ese extremo del asa (Fotos 15, 16 y 17). Dejar un poco de algodón sin enrollar en el lado opuesto del tapón. Introducir el tapón en la ampolleta y retirar la pinza (o el asa) suavemente con una mano, mientras se sostiene el tapón dentro de la ampolleta con la otra. Preparar ampolletas adicionales con sus respectivos tapones para tener más tapones en caso de que se necesiten. Si un tapón se desintegra al ser manipulado, es necesario remplazarlo con uno que esté esterilizado en las ampolletas adicionales. Foto 15 Foto 16 Paso 3 Llevar este material (ampolletas con sus tapones) al autoclave para esterilizarlo durante 40 minutos Foto 17

16 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 4 Preparación de las soluciones de peptona y de sucrosa Se toman 10 g de peptona y se disuelven en 100 ml de agua destilada. Se prepara de igual modo una solución de sucrosa (o de dextrosa) al 20%, disolviendo 20 g de este producto en 100 ml de agua destilada. Las dos soluciones, que se preparan por separado, se llevan al autoclave. Una vez esterilizadas, se mezclan partes iguales de cada una en un recipiente estéril para hacer una solución homogénea de peptona-sucrosa. Paso 5 Con una pipeta pasteur larga, succionar de 2 a 3 ml de la mezcla peptona-sucrosa (ver Paso 4) y depositarlo sobre el cultivo de bacteria que ha crecido durante 48 horas en la caja petri. Obtener luego un homogenizado de la bacteria en la solución de peptona-sucrosa haciendo succión y expulsión sucesivas de esa mezcla con la misma pipeta pasteur. Paso 6 Tomar, con la misma pipeta pasteur, unas gotas (2-3 ml) de esa suspensión de bacteria y depositarlas en el interior de la ampolleta siguiendo estos pasos: Tomar con una mano la pipeta pasteur y con la otra la ampolleta con su respectivo tapón (obtenida en el Paso 3). 2-16

17 Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Enfermedad: Bacteriosis común del frijol Sujetar la pipeta pasteur con los dedos índice y pulgar, y con el meñique de la misma mano retirar cuidadosamente el tapón de algodón de la ampolleta. Enseguida, verter la suspensión de la bacteria en el fondo de la ampolleta donde está el papel filtro con la identificación de la cepa. Tapar luego la ampolleta introduciendo suavemente en ella el tapón que ha estado sostenido entre el meñique y la palma de la mano. Si el algodón del tapón entra en contacto con otra superficie o con alguna sustancia, se contamina, por lo que se debe desechar y remplazar entonces con uno de los que se habían preparado (ver Paso 2) para estos casos. Paso 7 Cortar, con una tijera flameada, la parte del tapón que quedó por fuera de la ampolleta (Foto 18). Introducir finalmente en la ampolleta el resto del tapón de algodón empleando la punta de la tijera, hasta dejar 1 cm entre el borde de la ampolleta y el tapón (Foto 19). Paso 8 Colocar las ampolletas en una gradilla. Empujar luego el tapón de algodón hacia el fondo de cada una hasta que toque el trocito de papel filtro que lleva la identificación de la bacteria; para ello se ultiliza un objeto alargado (como la parte superior de un asa), el cual se flamea constantemente para evitar que se contaminen los tapones (Foto 20). Foto 18 Foto 19 Foto

18 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol La parte superior de la ampolleta, que no contiene algodón, se sellará después del proceso de liofilización (Paso 13). Paso 9 Una vez organizadas las ampolletas, llevarlas a un congelador a 0 C durante 15 minutos. Cuando las muestras se hayan congelado, se inicia el proceso de liofilización. Foto 21 Foto 22 Foto 23 Paso 10 Colocar la gradilla en la campana del liofilizador y encenderlo (Foto 21). El aparato hace descender en su interior la temperatura hasta 55 C e inicia un proceso de secamiento de la muestra porque le extrae el agua mediante una bomba de vacío. Este proceso tarda de 20 a 22 horas. Paso 11 Al día siguiente, apagar el liofilizador y retirar de él la gradilla con las ampolletas. Preparar luego una pistola de gas propano y proceder al estiramiento de las ampolletas en la parte opuesta a aquella en que está la muestra, es decir, hacer un cuello en cada una ablandando el vidrio con la llama y estirando la ampolleta por sus extremos (Fotos 22 y 23). El procedimiento requiere mucha precaución para evitar quemaduras en las manos por la llama. El objetivo de este paso es reducir el espacio por donde puede entrar aire (con humedad) a la muestra, antes de sellarla completamente. 2-18

19 Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Enfermedad: Bacteriosis común del frijol Paso 12 Una vez estiradas todas las ampolletas, colocarlas en el árbol del liofilizador insertando el extremo abierto de cada una en los soportes del árbol. De esta manera, el extremo que contiene la muestra quedará más visible (Foto 24). Repetir el proceso de secamiento en el liofilizador durante 1 hora, aproximadamente, para eliminar la humedad que pudo haber entrado a la muestra durante el Paso 11. Paso 13 Sin apagar el liofilizador, sellar al vacío las ampolletas, una por una, empleando la pistola de gas propano, derritiendo el vidrio con la llama donde se hizo el cuello o estiramiento (Foto 25). Una vez selladas, finaliza el proceso de liofilización. Foto 24 En caso de que se pierda el vacío al estar sellando una ampolleta, retirar esta parte de la ampolleta, remplazarla por una nueva y esperar que el vacío llegue al punto indicado para poder continuar con el sellado de las otras ampolletas. La duración de una muestra en almacenamiento, conservada mediante el proceso de liofilización, no se ha establecido formalmente; sin embargo, en nuestro laboratorio se han recuperado muestras liofilizadas que permanecieron almacenadas durante 30 años. La liofilización de muestras microbiológicas tiene, no obstante, una desventaja: para recuperar una muestra hay que romper toda la ampolleta y, por Foto

20 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol consiguiente, es necesario tener varias copias de cada una de las muestras liofilizadas para poder mantener adecuadamente una colección. 2. Conservación como suspensión en solución de peptona-sucrosa, en papel filtro a 20 o C La conservación de un patógeno suspendido en solución de peptona-sucrosa (o peptona-dextrosa) que se deposita en papel filtro es, después de la liofilización, uno de los métodos más efectivos para almacenarlo. Materiales Foto 26 Peptona al 10% Sucrosa (o dextrosa) al 20% Cajas petri (con incremento de bacteria) Pipetas (pasteur) Pinza Espátula Papel filtro (Foto 26) Preparación de las soluciones de peptona y de sucrosa (o dextrosa) Ver F., 1. Liofilización, Paso

21 Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Enfermedad: Bacteriosis común del frijol Pasos del proceso Paso 1 Tomar una caja petri que contenga un incremento de bacteria de 48 horas y agregarle 2 ml de la solución de peptona-sucrosa (o peptona-dextrosa) (Foto 27). Foto 27 Paso 2 Raspar, con una espátula o con la pipeta, el cultivo de la bacteria que ha crecido en la caja petri, para desprender de él colonias de la bacteria y suspenderlas en la solución agregada (Foto 28). Paso 3 Colocar en la suspensión de la bacteria (caja petri del paso anterior) 20 o más cuadritos de papel filtro esterilizados de 0.5 cm 2 (previamente recortados) e impregnarlos con esa suspensión (Foto 29). Paso 4 Retirar los cuadritos de papel filtro de esa caja petri con una pinza estéril y colocarlos en una caja petri estéril que tenga papel filtro en el fondo, para que se sequen a 24 C durante 7 días. Transcurrido ese tiempo, guardarlos en sobres estériles de papel mantequilla (Foto 30) para almacenarlos a 20 C, escribiendo en ellos los datos que identifiquen la bacteria: nombre del aislamiento, lugar de procedencia y fecha de almacenamiento (Foto 31). Foto 28 Foto Foto 30 Foto 31

22 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol G. Recuperación de la bacteria almacenada 1. Liofilizada y conservada en ampolletas Materiales Foto 32 Ampolletas con la bacteria liofilizada Solución de peptona al 10% Solución de sucrosa (o dextrosa) al 20% Cajas petri con medio de cultivo YCDA Pipeta con chupo Mazo de mortero Servilleta estéril Pinza (Foto 32) Pasos del proceso Foto 33 Paso 1 Romper la ampolleta que contiene la bacteria golpeándola con un mazo (Foto 33) por el extremo sellado (la servilleta sirve para amortiguar el golpe). Retirar con la pinza el algodón de la ampolleta (Foto 34). Foto

23 Guía Práctica 2: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Enfermedad: Bacteriosis común del frijol Paso 2 Depositar con la pipeta cuatro gotas de la solución de peptona-sucrosa (o peptona-dextrosa). Las células liofilizadas de la bacteria quedan así suspendidas en la solución (Foto 35). Paso 3 Retirar y sembrar la suspensión de células de la ampolleta en una caja petri que contenga el medio de cultivo YCDA (Foto 36). Esparcir la bacteria haciendo un rayado (ver Figura 1, p. 2-9) con un asa estéril e incubar a 28 C. En 48 horas, la bacteria habrá crecido sobre el medio de cultivo. Foto Conservada a 20 o C en papel filtro de suspensión en peptona-sucrosa (o peptona-dextrosa) La reactivación de una bacteria que ha sido almacenada conservándola según este protocolo se logra mejor si se agrega solución de peptona-sucrosa (peptona-dextrosa) al aislamiento almacenado, porque la solución le proporciona nutrientes a la bacteria para que reanude su crecimiento. Foto

24 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Pasos del proceso Paso 1 Sacar de los sobres de papel mantequilla (ver F., 2. Conservación como, Foto 31) de 3 a 5 trocitos de papel filtro que portan la bacteria, y sembrarlos en el medio de cultivo YCDA contenido en una caja petri (Foto 37). Paso 2 Depositar una gota de la solución de peptonasucrosa (o peptona-dextrosa) sobre cada trocito de papel filtro. Hacer luego un rayado de bacteria (ver Figura 1, p. 2-9) con un asa entre los trocitos de papel filtro sembrados. Paso 3 Incubar las cajas petri del paso anterior a 28 C. Después de 2 días, la bacteria habrá reactivado su crecimiento y estará lista para ser incrementada. Foto

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