UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA

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1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA MANUAL DE PRÁCTICAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

2 MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL COMPILADORES: Principal: M. en C. Laura Elena Santana Contreras Colaboradores: M. en C. Ma. Zulema Poncio Acosta Revisado por: Academia de Biologia 2011 Ciudad Juárez, Chihuahua Universidad Autónoma de Ciudad Juárez 2011 p. 45

3 M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biología D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biología Dr. Alejandro Martínez Martínez Jefe del Departamento de Ciencias Químico-Biológicas M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomédicas Aprobados por la Academia de Biología, 2011

4 INTRODUCCIÒN Los microorganismos (bacteria, virus, hongos, protozoarios y algunas algas) pueden encontrarse virtualmente en cualquier parte del medio ambiente, están presentes en aire, agua, suelo, alimentos etc. Estos organismos son extremadamente importantes en la salud humana y en el ambiente. Las prácticas de laboratorio en este manual ayudaran al estudiante a conocer y manejar adecuadamente algunas de las técnicas que se utilizan en la realización del análisis microbiológico de diversas muestras del medio ambiente y conocer los principales grupos de microorganismos objeto de estudio de la Microbiología Ambiental. El estudiante llevara una bitácora personal en la registrara los siguientes datos: hora en que se llevo a cabo la practica, resultados, cálculos, conclusiones, observaciones, entre otros, este registro se realizara durante todo el transcurso de su practica, estas anotaciones le serán de utilidad para realizar el reporte final de laboratorio. Los conocimientos que el estudiante adquiera en este laboratorio se consideran necesarios para la correcta interpretación y conocimiento de procesos ambientales por un titulado en el área ambiental y comprenda la importancia de los microorganismos en la biosfera y su papel en el mantenimiento del equilibrio de los ecosistemas. 3

5 Contenido INTRODUCCIÒN 3 CONTENIDO 4 OBJETIVO GENERAL 5 INDICACIONES DE SEGURIDAD 5 PRÁCTICA 1. MICROORGANISMOS EN EL MEDIO AMBIENTE. 6 PRÁCTICA 2. COLUMNA DE WINOGRADSKY. 11 PRÁCTICA 3. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO POR DILUCION SERIADA. 14 PRÁCTICA 4. TINCIONES Y MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA DE COLONIAS DE SUELO 19 PRÁCTICA 5. PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS DE SUELO 22 PRÁCTICA 6. DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES EN AGUA POR EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE. 26 PRÁCTICA 7. DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES EN AGUA POR EL MÉTODO DE FILTRO DE MEMBRANA 34 PRÁCTICA 8. ELABORACIÓN DE VINAGRE. 39 PRÁCTICA 9. RECUENTO DE ORGANISMOS COLIFORMES EN PLACA EN MUESTRAS DE QUESO. 41 4

6 OBJETIVO GENERAL El objetivo de este manual es complementar las sesiones teóricas de la asignatura de Microbiología Ambiental impartida en el área terminal Ambiental del Programa de Química. Durante las sesiones de laboratorio, el estudiante desarrollará habilidades y aptitudes en el aislamiento e identificación de algunos microorganismos y conocerá las técnicas para su aislamiento en matrices como aire, suelo, agua y alimentos, INDICACIONES DE SEGURIDAD Cualquier alumno que sufra alguna alteración de sus defensas o presente heridas debe comunicarlo al maestro antes de comenzar las prácticas. Sólo se permite el acceso al laboratorio a los alumnos que estén realizando las prácticas. No se admiten visitas por razones de seguridad. Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se esté trabajando en el laboratorio. La bata no debe utilizarse fuera del laboratorio. Se prohíbe beber, comer o masticar chicle en el laboratorio. Evite llevarse a la boca algún objeto o tocarse los ojos, nariz y boca. No debe depositarse en ningún momento en las mesas de trabajo libros, ropa u objetos personales. Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del material asignado, así como de los microscopios que haya usado. Utilizar los mecheros Bunsen con precaución, no dejando material inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobará que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el laboratorio. Está prohibido pipetear con la boca. Ante un vertido accidental de material microbiológico debe informarse inmediatamente al maestro. Utilizar guantes apropiados para el manejo de el autoclave o material recién esterilizado. La eliminación de residuos biológicos infecciosos, material desechable y material reciclable se realizará utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto. Se debe lavar las manos con jabón antiséptico ante cualquier sospecha de contaminación y antes de marcharse del laboratorio. En caso de accidente se cuenta con un botiquín para atención de emergencias y tomar las medidas necesarias para evitar un percance mayor. 5

7 PRÁCTICA 1 MICROORGANISMOS EN EL MEDIO AMBIENTE 1. Introducción Los microorganismos (bacteria, virus, hongos, protozoarios, y algunas algas) se pueden encontrar virtualmente en todo el medio ambiente. Se encuentran en el aire, agua, suelo, alimentos, petróleo, en la materia orgánica en descomposición y en las superficies del cuerpo. Estos organismos son extremadamente importantes para la salud humana y el medio ambiente además en los avances en inmunología, virología, genética y biología molecular. En microbiología, la esterilización se define como la destrucción o remoción de cualquier forma de vida. Un objeto que esté libre de cualquier organismo viviente, se dice que está estéril. La esterilización es uno de los mecanismos utilizados para el control de los microorganismos, existen otros métodos de control que sólo matan o inhiben una parte de la población microbiana como son: desinfección, pasteurización, quimioterapia y asepsis. Estos métodos permiten prevenir la contaminación de los materiales de laboratorio y de cultivos puros, evitan las infecciones y facilitan el tratamiento de enfermedades. La esterilización es muy importante en los laboratorios de microbiología porque la mayoría de los experimentos son realizados con cultivos puros o axénicos (cultivos que solamente tienen un tipo de microorganismo) o con cultivos mixtos o consorcios (cultivos constituidos por más de un tipo de microorganismo) por lo que es necesario primero esterilizar los materiales y medios de cultivo. Los métodos de esterilización, principalmente los que destruyen a los organismos, fueron diseñados para eliminar aún a los organismos más resistentes, las endosporas. Bacterianas de los géneros de Bacillus y Clostridium, por lo que éstas son utilizadas como indicadores biológicos de esterilización durante el proceso. Existen varios métodos de esterilización para la gran variedad de materiales, medios de cultivo y sustancias que pueden ser esterilizados. Los métodos más empleados en los laboratorios son los que utilizan calor. La velocidad con la cual los microorganismos mueren cuando son expuestos a temperatura elevadas es función de la naturaleza del medio en el cual ocurre el calentamiento (ph, concentración de sales y tipo de nutrientes), la longitud del tiempo de exposición y la temperatura de calentamiento. Por otro lado, el crecimiento microbiano sólo es posible si las condiciones físicas (temperatura de incubación, y la cantidad de oxígeno presente) y químicas (constituyentes del medio de cultivo, ph, etc.) son apropiadas. Se utilizan varios tipos de medios de cultivo, los cuales pueden clasificarse de la siguiente forma: 6

8 1. En base a su composición química pueden ser: sintéticos o definidos (cuando se conoce la composición química cualitativa y cuantitativa exacta de todos los componentes) y complejos (cuando no se conoce la composición química cualitativa y cuantitativa exacta de alguno de los componentes). 2. En base a la presencia de factores de crecimiento pueden ser: enriquecidos (si contienen) y mínimos (si no contienen). 3. Por su función pueden ser: selectivos (para el desarrollo de un grupo o tipo de microorganismos) y diferenciales (para distinguir tipos de microorganismos) 4. Por su consistencia pueden ser líquidos (llamados caldos) con los nutrientes disueltos en agua; sólidos, a los cuales se les adiciona un agente solidificante como el agar a una concentración de 1.5% p/v (otro agente solidificante es la sílica gel); y semisólidos, a los cuales se les adiciona agar en una menor concentración. Antes de utilizar los materiales de laboratorio y los medios de cultivo preparados a partir de ingredientes o de preparados comerciales, deben ser envasados, esterilizados y protegidos adecuadamente para conservar la esterilidad durante su uso y almacenamiento, lo cual va a asegurarnos que se trabajará exclusivamente con los microorganismos deseados. 2. Objetivos. Aprender a preparar adecuadamente el material de laboratorio para su esterilización y almacenamiento. Aprender a preparar, envasar y esterilizar medios de cultivo. Investigar los tipos de microorganismos que puedan estar presentes en el aire, cuerpo y superficies. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. 10 tubos de 16 x 150 mm con solución salina 0.85% Vasos de precipitado de 250 y 500 ml Matraces de 250 y 500 ml Probetas 10, 100 y 500 ml 10 cajas Petri de vidrio estériles Cotonetes estériles Autoclave Balanza Analítica Gradilla Agar Nutritivo y Agar nutritivo con 5% sucrosa Agar Czapeck y Agar para hongos y levaduras Agar sangre Agua destilada esteril Yogurt natural 7

9 Papel para esterilizar (Kraft) Cinta indicadora de esterilización Indicador de esterilización de esporas Bote de aluminio para esterilizar pipetas Mechero Espátula Succionador para pipetas Microscopio, Portaobjetos y cubreobjetos 4. Procedimiento Preparación de material de vidrio para esterilizar. a) Tubos de ensaye de 16 x Colocar en 10 tubos 9 ml con solución salina 0.85%, tapar cada tubo con un tapón de algodón ayudado de unas pinzas (pueden ser de disección de punta roma). 2. Colocar los tubos en una gradilla y cubrirlos con papel Kraft. Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 minutos. Preparación de medios de cultivo. 1. Pesar los gramos necesarios de acuerdo a las instrucciones del fabricante para preparar 500 ml de medio Agar Nutritivo, Agar nutritivo con 5% sucrosa, Agar Czapeck y Agar para hongos y levaduras Adicionar el agua destilada y calentar a ebullición para disolver con agitación.. Medir y ajustar el ph si es necesario. 2. Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min. 3. Distribuir 20 ml de medio a cada caja de Petri, dejar solidificar y someter a prueba de esterilización a 37 C 4. Procedimiento 1. Remover la tapa de la caja petri que contiene el agar nutritivo, el agar hongos y levaduras y Czapeck. Déjelo por espacio de 1 hora abierto, una vez concluido el tiempo tápelo, inviértalo y márquelo. Incúbelo a temperatura ambiente de 3 a 4 días. Una vez transcurrido el tiempo efectúe el registro de sus observaciones de las colonias formadas. 2. Humedecer un cotonete con agua estéril y frótelo en la piel, estríelo en la caja petri con agar nutritivo. Tápelo, inviértalo y márquelo. Incúbelo a 37 C por 48 a 8

10 72 hrs. Una vez transcurrido el tiempo efectúe el registro de sus observaciones de las colonias formadas.. 3. Humedecer un cotonete con agua estéril y frótelo dentro de su boca, estríelo en la caja petri con agar nutritivo con 5% sucrosa. Tápelo, inviértalo y márquelo. Incúbelo a 37 C por 48 a 72 hrs. Una vez transcurrido el tiempo efectúe el registro de sus observaciones de las colonias formadas. 4. Se introduce la torunda en la boca, evitando el contacto con la lengua y otras zonas de la boca, y se frota contra la mucosa de la faringe. a).- Frotar con un hisopo estéril sobre un segmento de la placa agar sangre, haciéndolo girar a la vez para descargar toda la muestra. Extender el inóculo inicial con el asa bacteriológica. b).- Con el asa flameada y fría extender el inóculo sobre otro segmento. Flamear el asa y repetir dos veces el paso 2, sin llegar a tocar el inóculo inicial. c).- Clavar el asa dos o tres veces en el agar, al principio de la siembra, para obtener cultivo bajo la superficie. Incubar las placas 18 h a C. Una vez transcurrido el tiempo efectúe el registro de sus observaciones de las colonias formadas y de la presencia de hemólisis. 5.- Colocar una gota de agua estéril en un portaobjetos. Flamear el asa de siembra hasta que adopte un color rojo. a).- Tomar una muestra del líquido del yogurt intentando no tocar con el asa la parte sólida de la materia del yogurt (contiene demasiada grasa y puede dificultar la observación. b).-hacer un frotis de la muestra en la gota de agua (extenderlo completamente). Fíjela con calor en el mechero hasta que el agua se evapore. c).- Cubrir el portaobjetos con azul de metileno, deje actuar por un minuto. Una vez transcurrido el tiempo lavar cuidadosamente la preparación con agua para eliminar el exceso de colorante. Deje un par de gotas y cubra con el portaobjetos intentando no dejar burbujas de aire. Observar en el microscopio en el mayor aumento posible y registre sus observaciones.. 5. Discusión y Conclusiones. 1. Mencione con que esporas bacterianas se realiza el control biológico para el método de esterilización de: a) calor húmedo b) calor seco c) óxido de etileno 2.- Las bacterias del yogurt son autótrofas o heterótrofas? Explique porqué. 3.- Que tipo de hemólisis presentaron las colonias en la placa agar sangre y explique a que se debe la reacción hemolítica observada en el medio? 9

11 6. Bibliografía. Claus. G. W Understanding Microbes. A Laboratory Textbook for Microbiology. Ed. W. H. Freeman and Company, Nex York. U.S.A. Difco Manual. Dehydrated culture Media and Reagentes for Microbiology. Difco laboratories Detroit Micg higan.tenth Edition Merck. Manual de Medios de Cultivo. 10

12 PRÁCTICA 2 COLUMNA DE WINOGRADSKY 1. Introducción. La biosfera de nuestro planeta contiene un gran número de ecosistemas en los cuales los microorganismos participan en forma muy importante, inclusive, existen ecosistemas, los cuales están ocupados exclusivamente por microorganismos (ejemplo: tapetes microbianos). La hidroecósfera comprende a todos los ambientes acuáticos, los cuales ocupan la mayor parte de la biosfera donde se llevan a cabo las transformaciones mediadas por microorganismos. Entre los sistemas acuáticos más importantes se encuentran los océanos, estuarios, lagos, charcas, manantiales y ríos subterráneos o superficiales. El tipo de estudio de la estructura de la comunidad microbiana acuática o de su actividad depende del objetivo de la investigación que se pretenda realizar. Los estudios microbiológicos tradicionales han sido la identificación taxonómica de la diversidad microbiana en la naturaleza, mientras que el campo de la ecología microbiana se busca identificar la función, bioquímica e interacciones de los microorganismos en la naturaleza como con la sociedad humana. La columna de Winogradsky, denominada así en honor del microbiólogo ruso Sergei Winogradsky, es un modelo de ecosistema que se utiliza para el estudio de los microorganismos acuáticos y de los sedimentos. En la columna se desarrollan poblaciones bacterianas fotosintéticas que utilizan el sulfuro de hidrógeno como donador de electrones en su metabolismo fotoautrotrófico. Este modelo de ecosistema imita la situación de una columna anóxica de agua que recibe luz. Debido a lo anterior se produce una zonación semejante a los sedimentos naturales, pero en escala milimétrica. 2. Objetivos. El alumno enriquecerá algunas de las poblaciones bacterianas presentes en los ambientes acuático y de sedimentos. El alumno realizará el experimento de la columna de Winogradsky para observar el desarrollo de las diferentes poblaciones heterótrofas y fotoautótrofas por medio de las características presentadas en cada zona de la columna. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. 2 Probetas de 500 ml de vidrio 2 hojas de papel filtro Sulfato de calcio Carbonato de calcio Muestra de sedimento Arena (color claro) Agua destilada 11

13 Agua de charco 2 Plato desechable Restos de hojas, plantas, ramas, etc. Espátula Papel parafilm Papel aluminio Balanza analítica o granataria Focos de 60 watts 4. Procedimiento. Realizar el experimento en dos columnas, una de las cuales servirá como testigo. 1. Utilizando una espátula tomar una muestra de sedimento y pesar 300 g. 2. Cortar trozos pequeños de papel filtro. 3. Mezclar la muestra de sedimento con 1 g de sulfato de calcio, y 1 g de carbonato de calcio, restos de hojas, plantas, ramas, etc. y con las trozos de papel filtro. 4. Agregar la mezcla al fondo de la probeta de vidrio 5. Agregar arena hasta un volumen de 450 ml. 6. Adicionar agua del lugar de donde proviene la muestra (de preferencia) hasta casi al borde. 7. Cubrir con papel parafilm la parte superior de la columna e incubar en presencia de la luz. 8. Exponer la columna a luz continua de un foco de 60 watts a una distancia entre 30 y 40 cm. 9. Realizar el mismo procedimiento desde el punto 1 al 7 con una segunda probeta de 500 ml, columna que se envolverá en papel aluminio para incubarla bajo condiciones de oscuridad. 10. Haga observaciones de su columna diariamente durante 1 semana y cada tercer día durante las siguientes tres semanas. Registre los cambios macroscópicos que se presenten. 11. Mantenga el volumen de agua adicionando agua destilada en caso de observar evaporación. Al final del experimento observar al microscopio muestras de la columna de agua como del sedimento. 12

14 5. Discusión y Conclusiones. Informe. Reporte las observaciones periódicas de la apariencia de la columna, haciendo hincapié en los cambios macroscópicos, tales como la aparición de organismos fotosintéticos, o cualquier otro cambio observado. También reporte las observaciones al microscopio, describiendo las características de los organismos encontrados en el agua y sedimento de la columna. Cuestionario. 1. Porqué se adiciona el sulfato de calcio a la muestra de sedimento? 2. Cuál es la función de los restos de hojas, plantas, ramas. etc. en la columna? 3. Porqué razón la columna testigo se mantiene en la oscuridad durante el transcurso del experimento? 1. Bibliografía. Atlas, R. M., Bartha, R Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental. PEARSON EDUCACIÓN, S. A., Madrid, España. Colomé, J. S., Kubinski, A. M Laboratory Excercises in MICROBIOLOGY. West Publishing Company. E. U. A. Davis, B. D., Dulbecco, R Tratado de Microbiología. 2da. Edición. Ed. Salvat Editores. España. 13

15 PRÁCTICA 3 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO POR DILUCION SERIADA 1. Introducción En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando comunidades de diversos géneros y especies, por lo que es casi imposible encontrar un hábitat con un solo género de microorganismos. Por lo que para los estudios en que se requiera el conocimiento de un solo organismo de esa comunidad (estudio autoecológico), es necesario el aislamiento del mismo. Obviamente se debe tener en mente que muchas reacciones fisiológicas, bioquímicas y hasta algunas morfológicas, requieren de la presencia del resto de los integrantes de la comunidad para que se expresen (estudios sinecológicos). Se han empleado una serie de métodos para la propagación de los microorganismos a partir de células individuales. El cultivo en caja de Petri es un sistema sencillo y rápido para el aislamiento de los microorganismos de una mezcla, permitiendo que a partir de una célula o un conglomerado de células del mismo género y especie, se forme una colonia (clona), que sea visible a simple vista. Los métodos más usados son: a) método de la estría cruzada y b) el método del vaciado en placa. El método de la estría cruzada, es un método cualitativo que permite trabajar un gran número de muestras en corto tiempo y consiste en tomar una muestra con un asa previamente esterilizada y colocarla sobre una superficie del medio de cultivo sólido que se encuentra en una caja de Petri, Posteriormente se trazan una serie de estrías pegadas al borde de la caja, esterilizando el asa al final de cada serie. El método de vaciado en placa, es un método cuantitativo, ya que además de aislar a los microorganismos, en un cultivo puro (formado por un solo género y especie), nos permite contar el número de organismos presentes en esa muestra. Esto es posible ya que a partir de una muestra perfectamente medida se realizan una serie de diluciones, lo que nos da la oportunidad de conocer la cantidad exacta de muestra en cada tubo de dilución, si después de sembrar la muestra en nuestro medio conocemos el número de colonias que crecieron, podemos multiplicar este por la inversa de la dilución y por la inversa de la alícuota que sembramos, dándonos como resultado el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por unidad de volumen o masa de la muestra original. Para el trabajo con ambos procedimientos se requiere procesar las muestras bajo condiciones de esterilidad con objeto de no incorporar microorganismos de otra fuente extraña a la que estamos analizando. 2. Objetivos. 14

16 El alumno adquirirá las habilidades para el aislamiento de microorganismos utilizando ambos procedimientos. El alumno conocerá la utilidad de estas técnicas en el estudio de los microorganismos El alumno se habituará a trabajar con los microorganismos bajo sistemas controlados de esterilidad. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. Suelo 5 pipetas de 1 ml estériles Frasco de dilución de 90 ml con agua destilada estéril 5 tubos de 16 x 150 mm con 9 ml de agua destilada estéril 6 tubos de 16 x 150 mm c/tapón de rosca con agar nutritivo, inclinados Agua destilada Capsulas de porcelana Pinzas (de disección por ejemplo) Mechero Horno o incubadora Balanza granataria Espátulas Asa bacteriológica Varilla acodada Alcohol Tween 80 Metanol Succionador para pipetas Cajas Petri con agar nutritivo con ciclohexamida Cajas Petri con medio de cultivo para hongos y levaduras (Saboraud) Cajas Petri con medio Czapeck 4. Procedimiento Método de las diluciones 1. Pesar 10 g de suelo y colocarlos en condiciones de esterilidad en una botella de dilución conteniendo 90 ml de agua destilada estéril,.agregar 1 gota de Tween 80. Agite perfectamente y deje reposar algunos minutos. 2. Por medio de una pipeta de vidrio o micropipeta (automática), tomar 1 ml del sobrenadante de la botella de dilución, teniendo cuidado de no arrastrar sedimento y vaciar en condiciones de esterilidad a un tubo de ensaye con 9 ml de agua destilada estéril. Agitar perfectamente para homogenizar la muestra (figura 1). 3. A partir del tubo anterior, tomar 1 ml y vaciarlo a otro tubo de ensaye con 9 ml de agua destilada estéril, agitar perfectamente. 15

17 4. Repita el punto tres, tomando siempre1 ml del último tubo inoculado y vacíelo a un tubo nuevo con 9 ml de agua destilada estéri (figura 1). 5. Al terminar la serie de tubos, tomar de los tres últimos tubos 0.1 ml y colocarlo en el centro de tres cajas de Petri perfectamente marcadas para su identificación. 6. Tomar una varilla acodada esterilizarla flameando con alcohol, y una vez fría, distribuir la muestra sobre toda la superficie de la caja, girando ésta y moviendo la varilla en un sentido. 7. Colocar las cajas en una canastilla e incubarlas a C durante 24 h. Figura 1.- Procedimiento para preparación de diluciones seriadas. Método de estría cruzada. 1. A partir del frasco de dilución en que se realizó la primera dilución del experimento anterior, tomar una asada y colocarla en una porción de la caja, trazando una serie de estrías que cubran aproximadamente 1 cm a partir de la orilla de la caja. 2. Flamear el asa, dejar enfriar y trazar una nueva serie de estrías a partir de un extremo de las anteriores. 3. Repetir el paso anterior durante dos series de estrías. 4. Trazar la última serie de estrías abriendo esta hacia el centro de la caja. (Anotar diagrama explicado por el maestro). 16

18 5. Incubar a C durante h. 6. Repetir los pasos anteriores para las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7 Transcurrido el tiempo de incubación para las cajas utilizadas en ambos métodos, haga sus observaciones de morfología colonial auxiliándose de la figura que el maestro mostrará a los alumnos. Determine las UFC/g de suelo seco de la muestra original de la siguiente forma: 1. Pesar una capsula de porcelana, registre el peso. 2. Pesar aproximadamente 10 g de suelo en la capsula de porcelana, registre el peso. 3. Colóquelos en el horno a 105 C por 48 hrs. Una vez concluido el tiempo de secado enfríelo, péselo y registre el peso. Calcular el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de suelo seco UFC/g = 1/dilución X Número de colonias X 1/alícuota Peso del suelo seco Determinación del peso del suelo seco Peso del suelo seco = (peso del suelo en capsula de porcelana) (% humedad / 100) + 1) Determinación del % de humedad del suelo % Humedad= ( suelo en capsula ) - (suelo seco en capsula) X 100 ( suelo seco en capsula - peso de la capsula) Cálculo de UFC/g de suelo Dilución Número de colonias Alícuota UFC/g * 17

19 5. Discusión y Conclusiones. 1. En un cuadro presente la morfología colonial de tres colonias que haya seleccionado con apoyo del maestro. 2. Desde el punto de vista práctico, qué ventajas y desventajas encontró al utilizar los dos métodos de aislamiento? 3. Qué características generales tienen las colonias bacterianas que las distinguen de los hongos? 4. Porqué reportamos los resultados como UFC/mL ó g en la determinación cuantitativa de microorganismos en lugar de usar el término células/ml ó g. Morfología colonial Condiciones de cultivo Medio de cultivo Temp. De incubación Tiempo de incubación Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3 Características Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3 Tamaño Color Forma Borde Elevación Luz reflejada Luz transmitida Superficie Aspecto Consistencia Pigmento difusible 6. Bibliografía. Alexander, S. K., Strete, D Microbiology. A Photographic Atlas for the Laboratory. Ed. Benjamin Cummings. Claus. G. W Understanding Microbes. A Laboratory Textbook for Microbiology. Ed. W. H. Freeman and Company, Nex York. U.S.A. Merck. Manual de Medios de Cultivo. 18

20 PRÁCTICA 4 TINCIONES Y MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA DE COLONIAS DE SUELO 1. Introducción. Los microorganismos permiten fácilmente el paso de luz a través de sus cuerpos, lo que los hace transparentes a la vista, a menos que contengan pigmentos que permitan su observación en el microscopio. Es por ello que debemos teñir a los microorganismos con compuestos que se fijen a sus estructuras y les confieran color, estos compuestos son los colorantes. Un colorante es un compuesto orgánico que tiene grupos cromóforos y auxocromos unidos a anillos bencénicos, conformando lo que se conoce como un cromógeno. Los grupos cromóforos son radicales que le confieren la propiedad de color a los anillos bencénicos. El auxocromo es un radical que imparte al compuesto la propiedad de disociación electrolítica, permitiendo con esto la fijación del compuesto a diferentes materiales. Para la tinción de las bacterias se pueden utilizar tinciones simples, diferenciales y selectivas. Las primeras son aquellas en las cuales se utiliza un solo colorante y éste tiñe todo el protoplasma de la célula, observándose ésta de un solo color uniforme. Las tinciones diferenciales son aquellas en las cuales se utilizan dos colorantes y generalmente un mordente (compuesto que permite fijar el colorante a un material) que permiten establecer dos grupos de bacterias, uno que acepta el primer colorante y otro que acepta el segundo colorante, lo que le da un valor en la clasificación celular (ejemplo: Tinción de Gram y Tinción de Ziehl Neelsen). Las tinciones selectivas utilizan también dos colorantes, pero uno de ellos tiene afinidad por ciertas estructuras de la célula, lo que permite su observación (ejemplo Tinción de esporas, de flagelos, de cápsula, de DNA, etc). Cuando teñimos una bacteria requerimos hacer un frotis, es decir requerimos colocar una pequeñísima muestra de una colonia bacteriana o una pequeña gota de un cultivo líquido, sobre un portaobjetos, extenderla, dejarla secar y fijarla. En este punto podemos teñir a nuestra bacteria y hacer la observación al microscopio para conocer la morfología que pueden tener los diferentes organismos. Debido al tamaño de las bacterias, todas las observaciones se realizan al microscopio con el objetivo de inmersión. 2. Objetivos. El alumno aplicará sus conocimientos adquiridos en cursos anteriores para elaborar frotis que permitan una observación correcta de algunos de los microorganismos del suelo aislados en las prácticas 1 y 2. 19

21 El alumno practicará una tinción simple y una tinción diferencial. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. Tubos con medio inclinado conteniendo tres cepas de la práctica número 2 ó tubos con caldo nutritivo inoculados con 3 de las diferentes cepas encontradas en la misma práctica. 1 Equipo de la técnica de Gram. (cristal violeta. lugol, solución alcohol-acetona y safranina). Verde de malaquita Microscopio Puentes de coloración Aceite de inmersión 4. Procedimiento. Preparación del frotis. 1. Con el asa previamente esterilizada, tomar una pequeña muestra del crecimiento bacteriano que se ha desarrollado sobre la superficie del agar en los tubos inclinados, o una asada del crecimiento bacteriano del caldo nutritivo. 2. Colocarla sobre una pequeña gota de agua o solución salina (estériles) que se ha colocado en el centro de un portaobjetos limpio y desengrasado. Con ayuda del asa distribuya hasta ocupar una superficie de 1 cm Dejar secar al aire y posteriormente fijar a la flama del mechero, pasando rápidamente la laminilla sobre la flama y midiendo la temperatura con el dorso de la mano. Repetir este procedimiento 3 veces. Tinción simple. 2. Tomar una laminilla de cada cepa y colocarla sobre un puente de coloración. 3. Cubrir el frotis con una cantidad generosa de verde de malaquita 4. Dejar actuar un minuto, lavar con agua corriente, sacudir y dejar secar al aire. 5. Observar con objetivo de inmersión, siguiendo las instrucciones del profesor. Tinción diferencial (Tinción de Gram). 1. Tomar una laminilla fijada de cada una de las cepas y colocarla cobre el puente de coloración. 2. Cubrir el frotis con cristal violeta y dejar actuar durante un minuto. Al término de éste, escurra la muestra y lave con agua de la llave. 20

22 3. Cubra con la solución de lugol y deje actuar durante un minuto. Al término de éste escurra el exceso. 4. Inclinando su portaobjetos, agregar el alcohol acetona y dejar escurrir hasta que no se observa desprendimiento de colorante. Generalmente el tiempo es de 15 segundos, pero este puede variar dependiendo del groso del frotis. 5. Lavar con agua de la llave y aplicar la safranina, dejándola actuar seg. 6. Lavar con agua de la llave, escurrir bien y dejar secar al aire. 7. Observar con objetivo de inmersión. 5. Discusión y Conclusiones. Informe. 1. Haga un esquema de sus observaciones al microscopio, de los frotis teñidos con una coloración simple, indicando al pie de cada uno tipo de organismos. 2. Haga un esquema de sus observaciones al microscopio de los frotis teñidos por la técnica de Gram, indicando al pie de cada uno tipo de organismo, agrupación que presente y tipo de Gram. 3. Discuta sus resultados y obtenga las conclusiones correspondientes. Cuestionario. 1. Describa la razón de las diferentes agrupaciones que presentan las bacterias. 2. Qué teoría existe para explicar la diferente reacción que presentan los microorganismos en la técnica de Gram? 3. Describa tres técnicas de coloración diferenciales que se apliquen en microorganismos. 6. Bibliografía. Alexander, S. K., Strete, D Microbiology. A Photographic Atlas for the Laboratory. Ed. Benjamin Cummings. Davis, B. D., Dulbecco, R Tratado de Microbiología. 2da. Edición. Ed. Salvat Editores. España. 21

23 PRÁCTICA 5 PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS DE SUELO 1. Introducción. Las tinciones simples, diferenciales y estructurales, aún cuando se combinen con observación de las características de la colonia y cultivo de las misma, no son suficientes para la identificación de una bacteria aislada. Los resultados de las tinciones y de los cultivos deben combinarse con resultados de pruebas bioquímicas. Las pruebas bioquímicas evalúan las propiedades metabólicas de un microorganismo aislado, las cuales son únicas para cada especie. La combinación de pruebas bioquímicas puede utilizarse para determinar el patrón bioquímico del microorganismo aislado. Esto hace posible la identificación del mismo utilizando un esquema de identificación. La identificación de un microorganismo es especialmente importante en el área clínica debido a que, al conocer la identidad del patógeno se puede determinar la susceptibilidad a algún antibiótico, lo cual es esencial para determinar un tratamiento médico efectivo. Existen tres métodos de identificación: a) método convencional; b) sistemas multiprueba y c) métodos automatizados. 2. Objetivos. El alumno aplicará los conocimientos adquiridos en cursos anteriores para la identificación de microorganismos aislados en las prácticas 1 y 2 mediante pruebas bioquímicas. El alumno utilizará el método convencional de pruebas bioquímicas desde la inoculación hasta la identificación, utilizando esquemas de identificación. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. Tubos (según el número de colonias a identificar) con medios de cultivo con los siguientes medios de cultivo para pruebas bioquímicas: TSI LIA KIA CITRATO UREA SIM VOGES PROSKAUER 22

24 MIO FENIL ALANINA Solución acuosa de cloruro férrico al 10% Solución alcohólica al 5% de α naftol Solución de Hidróxido de potasio al 40% Reactivo de Kovac s Solución de rojo de fenol Reactivo para prueba de oxidasa Peróxido de hidrógeno Asa circular Asa recta Gradilla Mechero Bunsen 1 trozo de papel filtro Cultivo de bacterias (fresco, es decir de entre 18 y 24 horas de incubación) Portaobjetos Incubadora a 37 C. 4. Procedimiento. 1. Colocar en una gradilla un juego de pruebas bioquímicas por cada colonia que se desee identificar, iniciando la serie con el tubo conteniendo el medio de citrato. 2. Tomar parte de una colonia aislada con el asa circular del microorganismo que se desee identificar y estriar en el pico de flauta del tubo conteniendo el medio de cultivo de citrato (no puncionar). 3. Tomar una porción de la misma colonia con una asa recta y puncionar el medio de cultivo hasta una profundidad máxima de ¾ y posteriormente estriar el pico de flauta en las pruebas de TSI, LIA, KIA (Kligler), Fenil alanina y Urea. 4. Tomar una porción de la misma colonia con una asa recta y puncionar el medio de cultivo hasta una profundidad máxima de ¾ en las pruebas de SIM Y MIO. 5. Tomar una porción de la misma colonia con una asa recta o circular e inocular el caldo de cultivo de la prueba de Voges Proskauer. 6. Incubar a 35 C durante 24 hr. 7. Tomar una porción de la misma colonia y extenderla sobre un portaobjetos. Agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno y observar. 8. Con un hisopo estéril tomar una porción de la misma colonia y extenderla sobre un trozo de papel filtro previamente humedecido con el reactivo para la prueba de la oxidasa y observar. 9. Después de lo incubación realizar las siguientes pruebas: 23

25 a) Adicionar al tubo con medio SIM 5 gotas del reactivo de Kovac s para determinar la producción de indol. Observar y registrar si hubo cambios o no. b) Del caldo de cultivo Voges Proskauer tomar la mitad en un tubo de ensaye para la determinación correspondiente, y el resto volver a incubar a 35 C por 24 hr más. En la porción separada (aprox. 1.5 ml) agregar 3 gotas del reactivo de la solución de α naftol al 5% y 1 gota de solución de KOH al 40%. Espere de 10 a 15 minutos para permitir el desarrollo del color. Registre las observaciones. c) Adicionar al tubo con medio de fenil alanina 4 ó 5 gotas de solución de cloruro férrico. Observar y registrar observaciones. c) Pasado el tiempo de la segunda incubación de la porción de caldo VP, agregar 3 gotas del indicador rojo de metilo. Agitar suavemente para permitir que se disperse el indicador y se lleve a cabo el desarrollo del color. Observar y registrar observaciones. 5. Discusión y Conclusiones. Informe. 1. Haga una tabla con los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas que llevó a cabo en cada uno de los microorganismos que seleccionó para la identificación. PRUEBA BIOQUÍMICA TSI CARACTERÍSTI CAS COLONIA 1 CARACTERÍSTI CAS COLONIA 2 CARACTERÍSTIC AS COLONIA 3 LIA KIA FENIL ALANINA UREA SIM 24

26 MIO VOGES PROSKAUER CITRATO INDOL ROJO METILO DE CATALASA OXIDASA NOTA: Especificar de donde proviene el cultivo de bacterias que utilizó para llevar a cabo sus pruebas bioquímicas (suelo, agua, etc) y anotar si hubo producción de gas y/o ácido sulfhídrico. Puede modificar la tabla agregando o quitando filas y columnas según se adapte a su reporte. 2. Utilizando esquemas de identificación, determine que microorganismo presenta las reacciones descritas para cada una de las colonias que seleccionó para su identificación. Cuestionario. 1. Describa la razón de utilizar una sola colonia en una serie de pruebas bioquímicas. 2. Haga una tabla comparativa de cómo se observa la reacción negativa y la positiva para cada una de las pruebas bioquímicas que llevó a cabo. 3. Cuál es la razón por la que el citrato fue la primer tubo en inocularse? 6. Bibliografía. Alexander, S. K., Strete, D Microbiology. A Photographic Atlas for the Laboratory. Ed. Benjamin Cummings. Davis, B. D., Dulbecco, R Tratado de Microbiología. 2da. Edición. Ed. Salvat Editores. España. Mac Faddin, J.F Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Editorial Médica Panamericana, S.A. 25

27 PRÁCTICA 6 DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES EN AGUA POR EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE 1. Introducción Reconociendo que la necesidad de consumo de agua potable es esencial, el control de su calidad bacteriológica, desde el punto de vista sanitario, constituye un hecho de vital importancia, debido a que un número importante de enfermedades son transmitidas a través del agua que ha sido contaminada con materia fecal. Lo que en casos extremos puede originar brotes epidémicos. Aún el agua que se observa clara puede estar contaminada con microorganismos enteropatógenos que normalmente habitan en el intestino del hombre y de otros animales de sangre caliente. Estos enteropatógenos incluyen principalmente a las bacterias de los géneros Salmonella, Shigella y Vibrio, protozoarios como Entamoeba hystolítica o virus como el de la hepatitis o el de la poliomielitis. Todos ellos pueden ingresar al agua cuando ésta entra en contacto con la materia fecal. De esta manera, parecería que la búsqueda de estos microorganismos constituiría la medida más acertada para decidir si el agua es apta o no para el consumo humano. Sin embargo, no es práctico determinar directamente a los microorganismos enteropatógenos debido a que su detección es tardada, laboriosa y a veces poco confiable. Por otro lado, los enteropatógenos en cuestión, aparecen solo ocasionalmente en cantidades suficientes para ser detectados, aún en las heces de individuos enfermos, por lo que se corre el riesgo de consumir un agua contaminada solo por el hecho de no haber hallado ningún enteropatógeno reconocido en las muestras analizadas. De este modo es necesario enfocar el problema desde otro punto de vista. Si los organismos enteropatógenos residen en el intestino, bastará con demostrar que el agua está contaminada con materia fecal para determinar que la fuente de abastecimiento puede ser transportadora de enfermedades intestinales. Con esta base, sin demostrar necesariamente la presencia directa de organismos enteropatógenos, se puede hacer un análisis microbiológico para poner de manifiesto algunos microorganismos que constituyen un indicador de contaminación fecal. Las cualidades ideales de un microorganismo indicador de este tipo de contaminación son: Presencia constante en materia fecal Exclusividad en la materia fecal Abundancia en la materia fecal Incapacidad de reproducción en el agua Supervivencia semejante a la de los organismos enteropatógenos 26

28 Facilidad para demostrarse en el laboratorio En la bacteriología del agua, los organismos del grupo coliforme se definen como: bacterias aerobias o facultativamente anaerobios, Gram negativas, no esporuladas que fermentan la lactosa con producción de gas dentro de las 48 hr de incubación a 35 C. Esta última propiedad, dado que no es común entre las bacterias, es el punto clave que se utiliza para la identificación de éste grupo microbiano. En este grupo se incluye a la Escherichia coli considerada como el principal indicador de contaminación fecal, así como a la Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter. Cuya fuente no se limita a un origen fecal y que comúnmente son encontrados en muestras de suelo, plantas y granos. Algunas normas oficiales para agua y alimentos sólo enumeran a los coliformes fecales, es decir, aquellos organismos coliformes que son capaces de producir gas a partir de la fermentación de la lactosa, cuando se incuban durante 24 a 48 horas a una temperatura de 44.5 ± 0.2 C. agua: Existen dos pruebas oficiales para la determinación de coliformes en muestras de Norma Mexicana de Análisis NMX-AA Calidad del Agua. Determinación del Número más Probable (NMP) de Coliformes Totales, Coliformes Fecales (termotolerantes) y Escherichia coli presuntiva. Este método microbiológico contempla tres fases: a) Prueba presuntiva b) Prueba confirmativa c) Prueba completa En las aguas altamente contaminadas o que de hecho se sabe que han estado en contacto con materia fecal, solamente se efectúa la prueba presuntiva; no obstante, el análisis debe llevarse a cabo hasta la fase confirmativa cuando se trata de agua destinada a beberse o usarse en albercas para natación. La prueba completa queda solo indicada para resolver problemas específicos (epidemiológicos, para diagnosticar el origen de la contaminación, etc.) En las tres fases del método se emplean medios de cultivo a base de lactosa para observar la producción de ácido y de gas. En la fase confirmativa se emplean medios selectivos con inhibidores de otros grupos microbianos ajenos a los coliformes. Además, en la fase completa se pueden emplear medios y pruebas para la identificación de los microorganismos coliformes detectados. El número de organismos coliformes en agua se calcula estadísticamente utilizando como referencia la tabla que se anexa al final de esta práctica. Los resultados son reportados como Número Más Probable de Organismos Coliformes 27

29 (Totales ó Fecales)/100 ml de agua. El método no es exacto, sólo da la probable densidad de los organismos coliformes totales o fecales en la muestra. Norma Mexicana de Análisis NMX-AA Calidad del Agua. Detección y Enumeración de Organismos Coliformes Termotolerantes y Escherichia coli presuntiva. Método de Filtración de Membrana. Este método es recomendado en los casos en los que se sabe que el grado de contaminación por organismos coliformes debe ser bajo o nulo (aguas purificadas, aguas destiladas, aguas desionizadas, aguas inyectables, etc.), por lo que se requieren grandes volúmenes de muestra para confirmar de manera segura la ausencia de ellos. En este caso, la muestra (que debe ser de por lo menos de 100 ml) se hace pasar por una membrana (un filtro especial comúnmente hecho a base de nitrato de celulosa o de acetato de celulosa) con una abertura de poro de 0.45 µm. Los microorganismos son retenidos en la membrana la cual se coloca en los medios de cultivo adecuados y se incuba a las temperaturas y tiempos especificados. Se cuentan las colonias fermentadoras de lactosa desarrolladas en la membrana y se calcula el número de coliformes en la muestra original. Este método es más rápido que el Método del Número Más Probable (NMP), pero tiene la desventaja que no puede ser usado en muestras de agua con alto contenido de partículas en suspensión porque se obstruyen los poros de la membrana. Recientemente se ha desarrollado un método simple y rápido para la detección de coliformes fecales que puede combinarse con la determinación por el Método del Número Más Probable. El método utiliza un medio de cultivo que contiene como sustrato los reactivos o-nitrofenil α-d galactopiranósido (ONPG) y 4-metilumbelifenil α- D glucurónido (MUG). La muestra de agua se incuba en el medio de cultivo conteniendo los reactivos (colilert) durante 24 h. Los coliformes presentes producen la enzima β-galactosidasa, la cual actúa sobre el ONPG desarrollando un color amarillo. Escherichia coli además posee una enzima constitutiva, la β-glucuronidasa que actúa sobre el MUG, y forma un compuesto fluorescente de color azul que se puede poner de manifiesto haciendo incidir radiación ultravioleta sobre el sistema. 2. Objetivos. El alumno determinará la presencia de los organismos coliformes en agua por el Método del Número Más Probable. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. 28

30 1 pipeta serológica de 10 ml estéril (por muestra, blanco o control) 2 pipeta serológica de 1 ml estéril (por muestra, blanco o control) 1 pinzas (de disección) estériles Frasco de dilución estéril aforado a 100 ml (conteniendo 0.3 ml de solución de tiosulfato de sodio al 3%) Asa bacteriológica Horno de incubación a 37 C Horno de incubación a 44.5 C Autoclave 9 tubos de ensaye 16 x 150 mm (por muestra, blanco o control) 9 campanas Durham (por muestra, blanco o control Gradilla Mechero Caldo lactosado concentración doble Caldo lactosado concentración sencilla Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa (VBBL) Cajas Petri con medio de agar Eosina Azul de Metileno (EMB) (según resultados de la práctica) 100 ml de agua potable (colectada en un frasco estéril (que contenga 0.3 ml de solución de tiosulfato de sodio al 3%) 100 ml de agua contaminada con materia fecal 100 ml de agua estéril Agua destilada Succionador para pipetas 4. Procedimiento Método Número Más Probable. a) Prueba Presuntiva 3. Inocular con 10 ml de la muestra tres tubos con caldo lactosado de doble concentración. 4. Inocular con 1mL de la muestra tres tubos con caldo lactosado de concentración sencilla. 5. Inocular con 0.1 ml de la muestra tres tubos con caldo lactosado de concentración sencilla. 6. Incubar todos los tubos a 37 C durante 48 h. 7. Transcurrido el tiempo de incubación, observar si hubo producción de ácido y/o gas. La producción de gas se detecta por su acumulación en la campana de Durham. La ausencia de gas en los tubos hace negativa la prueba, aún cuando haya producción de ácido o se observe un crecimiento evidente. 29

31 b) Prueba Confirmativa. 1. A partir de uno de los tubos positivos de la prueba presuntiva, inocular con dos asadas un tubo con caldo VBBL y con otras dos asadas otro tubo con caldo EC. Anote a que tubo y a que alícuota corresponde la resiembra. 2. Realizar la misma operación anterior con cada uno de los tubos positivos provenientes de la prueba. 3. Incubar los tubos con caldo VBBL a 37 C durante 48 h (Coliformes Totales). 4. Incubar los tubos con caldo EC a 44.5 ± 0.2 C durante 48 h (Coliformes Termotolerantes o Fecales). 5. Al término del tiempo de incubación, observar la producción de gas en los tubos. Registre el número de tubos positivos en la siguiente tabla: PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TOTALES Alícuota (ml) Tubos positivos PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES FECALES Alícuota (ml) Tubos positivos NOTA: El número de tubos positivos para cada una de las alícuotas en la prueba confirmativa confirma lo que se conoce como el número característico, y que será el que se interpole, para efectos de esta práctica, en la tabla 1, y así calcular del Número Más Probable. Por ejemplo, si en la prueba confirmativa usted obtiene los siguientes resultados: PRUEBA CONFIRMATIVA Alícuota (ml) Tubos positivos

32 Significa que su número característico será Al interpolar en la tabla 1 este número característico le dará un total de 15. Entonces usted reportará 15 NMP de organismos coliformes (totales o fecales, según sea el caso)/100 ml. TABLA 1 Determinación de microorganismos por el método del Número Más Probable cuando se utilizan alícuotas de 10, 1.0 y 0.1 ml por triplicado. 10 ml 1 ml 0.1 ml NMP/100 NMP/ ml 1 ml 0.1 ml ml ml c) Prueba Completa. 31

33 1. Resembrar en una placa de agar EMB por estría cruzada, cada uno de los tubos de VBBL que haya dado positivo en la prueba. 2. Incubar todas las placas a 37 C durante h. 3. Al término del tiempo de incubación observar la aparición de colonias con centro oscuro y/o brillo metálico en las placas de EMB. Siempre que sea posible, el análisis bacteriológico debe iniciarse inmediatamente después del muestreo, y preferentemente, antes de una hora. Cuando las condiciones no lo permiten y sea necesario retardar el análisis de las muestras, éstas deberán guardarse a una temperatura igual o menor a los 10 C, hasta que sean examinadas. Se recomienda que el tiempo de almacenamiento no exceda de las 30 h para muestras de agua potable y de 6 horas para otros tipos de agua. 5. Discusión y Conclusiones. 8. Mencionar los inhibidores selectivos que contienen los medios de cultivo VBBL y EMB. 9. Qué entiende por microorganismos indicadores? 10. Cuál es la diferencia entre un coliforme total y un coliforme fecal? 11. Mencione algunos microorganismos que pudieran ser útiles como indicadores de otras formas de contaminación, diferente a la fecal (en diferentes ambientes). 12. En qué casos se utiliza al Clostridium perfringens como microorganismo indicador de contaminación fecal? INFORME 1. Reporte los resultados del Método del Número Más Probable en las siguientes tablas: EQUIPO NÚMERO CARACTERÍSTICO NMP ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES/100 ml EQUIPO NÚMERO CARACTERÍSTICO NMP ORGANISMOS COLIFORMES 32