TOLERVIT-MS: INDUCCIÓN DE TOLERANCIA EN ESCLEROSIS MÚLTIPLE CON CÉLULAS DENDRÍTICAS TRATADAS CON VITAMINA D3 Y CARGADAS CON PÉPTIDOS DE LA MIELINA

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1 TOLERVIT-MS: INDUCCIÓN DE TOLERANCIA EN ESCLEROSIS MÚLTIPLE CON CÉLULAS DENDRÍTICAS TRATADAS CON VITAMINA D3 Y CARGADAS CON PÉPTIDOS DE LA MIELINA Investigadora principal: Dra. Eva Martínez Cáceres LIRAD, Banc de Sang i Teixits De l HUGTiP Duración: 3 años 1

2 1. Resumen La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica inflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central (SNC), que se produce por el ataque del sistema inmunitario a la mielina que recubre los nervios, induciendo desmielinización y daño neuronal. Las lesiones inflamatorias y desmielinizantes se acumulan en el SNC y acaban provocando una discapacidad lenta y progresiva en la mayoría de los casos. El 70% de los pacientes con EM sufren dolor crónico, que varía de moderado a intenso. En adultos jóvenes la EM es la causa más frecuente de discapacidad de origen no traumático. No existe un tratamiento curativo para la EM. Disponemos de tratamientos que modifican la evolución natural de la EM remitente recurrente (EMRR), que son inmunomoduladores no antígenos específicos o inmunosupresores. El objetivo de esas terapias es disminuir la frecuencia de los brotes pero no está claro que consigan reducir la progresión a largo plazo de la enfermedad. Estos tratamientos tienen efectos adversos, un coste elevado y no son tan efectivos como sería deseable en un alto porcentaje de pacientes. Solo un tratamiento etiológico capaz de interferir con el desarrollo de la inflamación y de la desmielinización podrá evitar la aparición de síntomas clínicos, incluido el dolor, e inducir una mejora significativa en los pacientes. El avance en el conocimiento de los mecanismos de inmunorregulación ha facilitado el desarrollo de terapias inductoras de tolerancia inmunológica frente a antígenos propios para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. En este contexto, la utilización de células dendríticas tolerogénicas cargadas con péptidos de la mielina se postula como una alternativa prometedora para el tratamiento de la EM. El objetivo es inducir tolerancia inmunológica a la mielina y evitar así el ataque autoinmune al SNC preservando el resto del sistema inmunitario. Nos planteamos los siguientes objetivos concretos: 2

3 OBJETIVOS: Objetivo 1: Diseño y desarrollo del producto celular tolerogénico (células dendríticas tolerogénicas o DCtol cargadas con un grupo de péptidos de la mielina) a partir de monocitos de sangre periférica de los pacientes. Objetivo 2: Desarrollo de un método in vitro para la selección de pacientes candidatos al tratamiento y seguimiento de los mismos. Objetivo 3: Diseño y realización de un ensayo clínico fase I/IIa, longitudinal y prospectivo para obtener resultados de seguridad y una primera prueba de concepto de esta terapia. Objetivo 4: Análisis del dolor en pacientes con EM. La ayuda MTV3 07/2410 nos ha permitido poder realizar los estudios preclínicos para el desarrollo de esta terapia celular autóloga basada en la utilización de células dendríticas tolerogénicas (DCtol) cargadas con un grupo seleccionado de péptidos de la mielina y sentar las bases para la realización de un ensayo clínico fase I/IIa basado en la administración de estas células en un grupo seleccionado de pacientes con EMRR. 2. Resultados 1) Diseño y desarrollo del producto celular tolerogénico: 1.1. Selección de los péptidos: Para poder definir una terapia antígenos específica es importante comprobar la reactividad de los linfocitos de los pacientes a diferentes autoantígenos. Se realizó una revisión bibliográfica sobre los autoantígenos candidatos en EM, publicada en Grau-López et al., Se seleccionó un grupo de siete péptidos de la mielina como candidatos, péptidos no restringidos por HLA y capaces de ser reconocidos por linfocitos T de pacientes con EM con elevada avidez (descritos por Roland Martin, 3

4 investigador de este proyecto, en Bielekova et al., 2004) Generación del producto celular La obtención del producto se subdivide en dos partes: (1) generación de las DC a partir de monocitos de sangre periférica y (2) maduración de las DC generadas. La obtención de monocitos del grupo de control se realizó a partir de muestras de capas de leucocitos procedentes del banco de sangre, y las de los pacientes fueron obtenidas a partir de muestras de sangre periférica (estudios a pequeña escala) o leucoféresis (estudios a escala clínica). No se observaron diferencias en la eficiencia de diferenciación de DC entre muestras de pacientes o controles. La separación de los monocitos se realizó por elutriación o por columnas magnéticas. Se hizo un estudio comparativo de diferentes agentes inductores de maduración de las DC: cóctel de citoquinas o CC (conteniendo TNF-a, IL-1b y prostaglandina E2), el agonista de TLR-4 MPLA (monophosphoryl lipid A) de grado clínico, y la combinación de ambos (CC+MPLA). Las (CC)-DCtol mostraron el mayor potencial de supresión de proliferación de linfocitos T in vitro. Además, sólo estas células mostraron estabilidad funcional, ya que no indujeron un incremento de la proliferación de los linfocitos T tras estimulación con LPS, concluyendo que el mejor estímulo de maduración para la obtención de células tolerogénicas era el cóctel de citoquinas, resultados publicados en Raïch-Regué et al., 2012 a Elección del agente tolerogénico: Como agente tolerogénico para las DC, en primera instancia se planteó la utilización de VIP (péptido intestinal vasoactivo), dado que se había demostrado su efectividad en el modelo animal de EM (encefalitis autoinmune experimental o EAE). Sin embargo, estudios con células humanas no dieron los resultados esperados, por lo que analizamos otros agentes tolerogénicos (dexametasona, rapamicina y vitamina D3) todos ellos de grado clínico. Se comparó el efecto de cada uno de ellos sobre la viabilidad, la eficiencia de diferenciación, el fenotipo (medido por la expresión de CD83, CD86, HLA-DR), la secreción de citoquinas (IL-10, IL12p70, IL-23) y la estabilidad del fenotipo tolerogénico de las DC tras 4

5 ulterior estimulación con LPS. Se analizó también la capacidad de las diferentes DCtol de estimular linfocitos T y el fenotipo de los mismos, seleccionándose, a partir de ellos, la vitamina D3 (VitD3) como agente tolerogénico para la obtención de nuestro producto celular. Estos resultados se publicaron en Naranjo-Gómez et al., A partir de este trabajo, estamos realizando un análisis del perfil transcriptómico de las DCtol generadas con diferentes agentes tolerogénicos (rapamicina, dexametasona, VitD3) comparado con DC maduras y DC inmaduras, con el fin de poder definir biomarcadores de tolerogenicidad Análisis de la funcionalidad y efecto in vitro de las DCtol-VitD3 cargadas con péptidos de la mielina sobre los linfocitos T de los pacientes. A continuación analizamos la producción de citoquinas por las DCtol-VitD3 tanto de pacientes con EM como de controles. Se observó que producen niveles de IL-10 más elevados y niveles inferiores de IL-12p70 que las DC maduras, sugiriendo un perfil antiinflamatorio de estas células. Del mismo modo, en cultivos alogénicos se demostró una capacidad disminuida de las DCtol de inducir proliferación en comparación con las DC maduras. Los sobrenadantes de estos cocultivos presentaban niveles significativamente más bajos de TNF-a, IL-6 e IFN-g que aquellos con DC maduras. Estos resultados fueron similares en pacientes y controles, descartando una menor funcionalidad de las DCtol de los pacientes con EM. Por medio de ensayos de competición peptídica demostramos que los péptidos de la mielina se unen a las moléculas HLA de clase II de las células dendríticas. Se realizaron estudios funcionales de inhibición de la proliferación de cultivos celulares enriquecidos en linfocitos T específicos frente al grupo de péptidos de la mielina en muestras de pacientes con EM, observando una disminución de la proliferación de aquellos linfocitos T cultivados con DCtol+péptidos (figura 1A) junto a una importante reducción de citoquinas proinflamatorias (IL-17, IFN-g e IL-6) en el sobrenadante, comparado con aquellos cultivados con DC maduras+péptidos. Se recuperaron estos linfocitos T y tras 72 horas en reposo se reestimularon con PBMC autólogas irradiadas+péptidos, observándose una hiporespuesta de aquellos linfocitos que habían estado previamente en contacto con DCtol+péptidos (figura 1B). 5

6 Figura 1. DCtol cargadas con péptidos de la mielina inducen hiporrespuesta de células T autólogas de pacientes con EM. (A) El gráfico muestra la media+sd (de 21 réplicas) de la proliferación específica a los péptidos de la mielina de tres pacientes con EMRR. Células T específicas generadas por estimulación secuencial con los péptidos fueron cocultivadas con DC maduras sin péptidos (DCmad), con péptidos (DCmad+p) o con células tolerogénicas+péptidos (DCtol+p), a ratio 1:20 durante seis días. Se determinó la proliferación por incorporación de (3H)-timidina (cpm) las últimas 16 horas. (B) Las células T (LT) de los cultivos descritos en A, tras 72 horas de reposo se reestimularon (ratio 1:10) con PBMC autólogas irradiadas cargadas con la mezcla de péptidos. La proliferación se determinó a las 72 horas por incorporación de (3H)-timidina. Las barras representan la media+sd de tres réplicas de cada uno de los pacientes (**p<0.005, Wilcoxon test). Demostramos además que esta hiporrespuesta era antígeno específica, ya que los linfocitos T de los pacientes que habían estado cultivados con DCtol+péptidos no eran capaces de responder a los mismos, pero sí que eran capaces de responder a un antígeno no relacionado como el citomegalovirus (CMV). Estos resultados se han publicado en Raïch-Regué et al., 2012 b. Los resultados obtenidos son muy prometedores y apoyan la posible utilidad del tratamiento con DCtol-VitD3 cargadas con péptidos de la mielina para inducir tolerancia antígeno específica en los pacientes con EM. A partir de estos resultados se ha llevado a cabo el desarrollo del producto celular a escala clínica y en condiciones GMP en las instalaciones de la 6

7 División de Terapias Avanzadas (Xcelia) del Banc de Sang i Teixits así como las validaciones necesarias y redacción del dossier preclínico para conseguir la aprobación de esta terapia celular por la Agencia Española del Medicamento (AEMPS) próximamente. 2) Desarrollo de un método in vitro para la selección de pacientes candidatos al tratamiento y seguimiento de los mismos Analizamos la reactividad de los linfocitos de sangre periférica de un grupo de pacientes con EM (n=42) al grupo de péptidos de la mielina seleccionados. Observamos que un 74% de los pacientes presentaba reactividad al grupo de péptidos seleccionados anteriormente, frente a un 40 % de pacientes con otras enfermedades neurológicas (OND) (n=15) y un 30% de control sin EM (CS) (n=40) que no la presentaban. Además, esta reactividad se mantenía a lo largo de 12 meses de seguimiento. Estos resultados fueron publicados en Grau-López et al., 2011 a. Figura 2. Porcentaje de individuos que proliferan frente a los péptidos de la mielina en concentraciones 2 µm y 10 µm. EM: esclerosis múltiple; OND: Otras enfermedades neurológicas; CS: controles sanos La reactividad de los linfocitos T de los pacientes frente a los péptidos de la mielina (proliferación antígeno específica, medida por la incorporación de (3H)-timidina) ha mostrado ser una prueba in vitro de gran utilidad para la 7

8 selección de los pacientes para el ensayo clínico y seguimiento de los mismos. Durante este seguimiento, además, se analizarán otros parámetros hematológicos, bioquímicos e inmunológicos como el porcentaje de linfocitos Th17 de sangre periférica, análisis de otras subpoblaciones T, B (Teniente-Serra et al., 2011) y valoración del perfil de citoquinas. 3) Diseño del ensayo clínico Los alentadores resultados obtenidos nos han llevado a realizar el diseño de un ensayo clínico abierto, longitudinal, prospectivo, cruzado y unicéntrico fase I/IIa para establecer la seguridad y como prueba de concepto del tratamiento con DCtol-VitD3 cargadas con péptidos de la mielina en un grupo seleccionado de 12 pacientes con EM remitente recurrente. El tamaño de la muestra se inspira en estudios anteriores del NIH (EEUU) realizados por el grupo del Dr. Roland Martin (colaborador del proyecto) y se basa en la historia natural de una cohorte de 70 pacientes estudiados con resonancia magnética (RM) mensual durante 10 años. Este diseño ha sido utilizado con éxito en muchos ensayos clínicos en el NIH. Criterios de inclusión: EMRR definida por los criterios de McDonald (Ann Neurol 2001); edad: de 18a 51 años; Expanded Disability Status Scale (EDSS) entre 1-5,5; dos o más lesiones captantes de gadolinio en RM basal; respuesta proliferativa T frente a uno o más péptidos seleccionados de la mielina; pacientes sin tratamiento inmunomodulador o que no hayan respondido a él; consentimiento informado por escrito. Criterios de exclusión: formas progresivas; edad: menor de 18 o mayor de 51 años; pacientes en brote; pacientes que hayan recibido tratamiento inmunomodulador en los tres meses previos; pacientes que hayan recibido quimioterapia o terapia inmunosupresora en cualquier momento de su enfermedad. Seguimiento: Se realizará seguimiento clínico, radiológico (RM) e inmunológico durante los cuatro meses previos a la inclusión y seis meses tras el tratamiento. 8

9 4) Análisis del dolor en pacientes con EM Paralelamente al trabajo experimental, y con el objetivo de poder valorar en un futuro el efecto de la utilización de la terapia celular sobre las manifestaciones clínicas de los pacientes, realizamos un análisis del dolor en nuestra cohorte de pacientes con EM. Se incluyeron 134 pacientes. El 55% de ellos (n=74) presentaron dolor. Mayoritariamente era un dolor neuropático, urente, en las extremidades y percibido como grave. De ellos, el 38% recibió analgesia. Los pacientes con dolor presentaban mayor discapacidad, mayor número de brotes, mayor tiempo de evolución, predominio de formas progresivas, depresión y mayor presencia de lesiones en la RM medular (tabla 1A). En el análisis multivariante, las lesiones en RM medular y la discapacidad se asociaron de forma independiente con el dolor (tabla 1B). Estos resultados confirman que el dolor en la EM es frecuente y percibido como grave. También se asocia con la presencia de lesiones en la RM medular y con mayor discapacidad. Estos resultados se publicaron en Grau López et al., 2011 b. A Dolor No dolor Discapacidad (EDSS) 4,5 [3-6] 1,5 [1-2] p<0,001 Número de brotes 7,13±3,40 3,50±2,90 p<0,001 Tiempo de evolución (meses) 14,6±7,8 8,43±5,9 p<0,001 Formas progresivas 86,7% 13,3% p<0,001 Depresión 91,9% 8,1% p<0,001 Lesiones en RM medular 84,3% 15,7% p<0,001 9

10 B OR Lesiones en RM medular 3,5 [1,5-24,5] p=0,010 Discapacidad 1,7 [1,1-2,7] p=0,014 Tabla 1. Características clínicas de los pacientes con dolor respecto a los que no lo padecieron (A). Análisis multivariante de la asociación de las lesiones en la RM y la discapacidad con el dolor (B) 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Los resultados del proyecto TOLERVIT-MS, su importancia y posibles aplicaciones se pueden resumir en los siguientes puntos: a) Implicaciones clínicas El proyecto TOLERVIT-MS ha generado resultados prometedores que apoyan la utilización de la terapia celular antígeno específica con DCtol en enfermedades autoinmunitarias como la EM. a.1. Con esta ayuda se ha podido desarrollar un producto celular tolerogénico antígeno específico y hemos sentado las bases para su posterior utilización en la clínica. a.2. Se ha puesto a punto un método in vitro para la selección de pacientes y su seguimiento una vez se les administra el tratamiento. a.3. Se ha realizado el diseño de un ensayo clínico fase I/IIa para determinar la seguridad y prueba de concepto de esta terapia. a.4. Hemos establecido una colaboración con grupos de investigación en Cataluña, constituyendo un Consorcio (Plataforma d Investigació Bioclínica en Teràpia Cel lular per a Malalties Desmielinitzants) constituido por investigadores del Parc Científic de Barcelona (PCB), el Hospital Germans Trias i Pujol (HUGTP), Xcelia-BST, el Laboratorio Inmunología (LIRAD)-BST y la Fundación GAEM (Grupo de Afectados de Esclerosis Múltiple), así como 10

11 existe relación con otros grupos europeos que están desarrollando terapias celulares tolerogénicas para otras enfermedades autoinmunitarias como con Sanquin, (Amsterdam, Países Bajos) y la Universidad de Newcastle (Reino Unido) con el fin de establecer sinergias y buscar financiación para poder llevar a la clínica estas terapias. b) Implicaciones en investigación básica b.1. A partir de los resultados de este proyecto hemos comenzado a desarrollar nuevas líneas de investigación, en dos modelos animales de EM (EAE), remitente recurrente y crónico no remitente, con el objetivo de poder conocer mejor el mecanismo de acción de este tratamiento, definir las pautas, dosis y vías de administración más adecuadas y establecer la posible utilidad de esta terapia en pacientes con otras formas clínicas de EM. b.2. Se ha realizado un estudio transcriptómico de las DCtol generadas con diferentes fármacos tolerogénicos (rapamicina, cexametasona, VitD3), con el objetivo de, una vez analizado, poder definir biomarcadores de tolerogenicidad, que puedan servir en un futuro como control de calidad en la fabricación de un producto celular tolerogénico. c) Formación Con esta ayuda hemos contribuido a la formación de investigadores: se han completado dos tesis doctorales y tres trabajos del máster interuniversitario en Inmunología (UAB/UB).. d) Difusión de los resultados Hemos contribuido a la difusión del conocimiento sobre el tema mediante artículos publicados en revistas internacionales indexadas (ver apartado 4), 11

12 seminarios, presentaciones orales en congresos internacionales y presentaciones tipo póster en congresos nacionales e internacionales. Hemos participado en diferentes actos de divulgación: Fira La Pedrera, organizada por el PCB (2009); Volem Saber, organizado por la Fundación GAEM (Cosmocaixa, 2010, 2011), así como también hemos hecho entrevistas divulgativas en prensa, radio y televisión catalanas. 4. Publicaciones Grau-López L, Raïch D, Ramo-Tello C, Naranjo-Gómez M, Dàvalos A, Pujol- Borrell R, Borràs FE*, Martínez-Cáceres E*. Myelin peptides in multiple sclerosis. Autoimmun Rev. 2009; 8: Review. FI: 6,556 Grau-López L, Raïch D, Ramo-Tello C, Naranjo-Gómez M, Dávalos A, Pujol- Borrell, R, Borràs FE*, Martínez-Cáceres E*. Specific T-cell proliferation to myelin peptides in RR-MS. Eur J Neurol. 2011; 18 : FI: 3,765 Grau-López L, Sierra S, Martínez-Cáceres E, Ramo-Tello C. Analysis of the pain in multiple sclerosis patients. Neurologia. 2011; 26: FI: 0,596 Naranjo-Gómez M, Raïch-Regué D, Oñate C, Grau-López L, Ramo-Tello C, Pujol-Borrell R, Martínez-Cáceres E*, Borràs FE*. Comparative study of clinical grade human tolerogenic dendritic cells. J Translac Med 2011; 9: 89. FI: 3,51 Raïch-Regué D, Naranjo-Gómez M, Grau-López L, Ramo C, Pujol-Borrell C, Martínez-Cáceres E*, Borràs FE* 12

13 Differential effects of Monophosphoryl lipid A and Cytokine cocktail as maturation stimuli of Immunogenic and Tolerogenic Dendritic Cells for Immunotherapy. Vaccine. 2012; 30: FI: 3,572 Raïch-Regué D, Grau-López L, Naranjo-Gómez M, Ramo-Tello C, Pujol- Borrell R, Martínez-Cáceres E*, Borràs FE* Tolerogenic dendritic cells from multiple sclerosis patients induce autoreactive T cell hyporesponsiveness. Eur J Immunol. 2012; 42: FI: 4,94 Grau-López L, Granada ML, Raïch-Regué D, Naranjo-Gómez M, Borràs FE, Martínez-Cáceres E, Ramo-Tello C Regulatory role of vitamin D in T-cell reactivity against myelin peptides in relapsing-remitting multiple sclerosis patients. BMC Neurology (article original, en revisió). FI: 2,8 Teniente-Serra A, Grau-López L, Martínez-Arconada MJ, Fernández- Sanmartín MA, Ramo-Tello C, Pujol-Borrell R, Martínez-Cáceres E Characterization of recent thymic emigrants (RTEs), transitional B and Th17 cells in multiple sclerosis. 6th European Workshop on Immune-Mediated Inflammatory Diseases. Nice, France J Transl Med. 2011; 9(Suppl 2):O2. FI: 3,51 * shared senior co-authorship 13