El sistema inmune CRISPR/Cas: corte de DNA exógeno guiado por RNA.

Transcripción

1 El sistema inmune CRISPR/Cas: corte de DNA exógeno guiado por RNA. Resumen: el presente trabajo trata de realizar una revisión general de los avances realizados en la comprensión del mecanismo de defensa CRISPR/Cas presente en procariotas, procurando mantener un enfoque didáctico que pueda ser útil al resto de alumnos. Siguiendo la línea marcada por el articulo E. Sotheimer y L.A: Marraffini. Slicer for DNA. Nature 468, (2010), punto de partida de este trabajo, se prestará especial atención a las evidencias que apuntan al DNA exógeno (plásmidos y bateriófagos) como el objetivo de la respuesta inmune y su silenciamiento mediante corte guiado por RNAs de pequeño tamaño. 1-Introducción. 2- Disección del locus CRISPR. 3-Divergencia evolutiva del locus CRISPR. Clasificación de proteínas Cas. 4-Mecanismo de acción. 4.1-Adquisición de nuevos espaciadores. 4.2-Biogénesis de crrna. 4.3-Silenciamiento del DNA exógeno. 5-Tecnologías basadas en CRISPR/Cas. 6- Conclusiones y opinión del alumno. 7-Referencias 1-introducción: A lo largo de la historia natural, los procariotas (bacterias y arqueas) han tenido que hacer frente a la necesidad de mantener la integridad de su material genético frente a la invasión de elementos génicos externos. Esto es especialmente relevante en el caso de los bateriófagos, principal amenaza a la que deben resistir los procariotas. Basta con observar una placa de lisis para hacerse una clara idea de cuán eficaces son los fagos en su cometido. Esto ha llevado a los procariotas a desarrollar distintos mecanismos de defensa con los que protegerse de tal amenaza. Típicamente, entre estos mecanismos poder citar eliminaciones o modificaciones de receptores para evitar la adsorción del fago, mecanismos que evitan la inyección del material genético del fago en la célula y las muy conocidas enzimas de restricción, que cortan el DNA invasor en secuencias dianas específicas. A su vez, la aparición de estas defensas entre los procariontes, ha determinado en gran medida la evolución de los fagos, evolucionando para esquivar tales defensas, en lo que ha venido a ser una suerte de carrera armamentística entre ambas entidades. Actualmente, a estas defensas exhibidas por los procariotas debemos de añadir una más, el sistema inmune CRISPR/Cas. Esta nueva defensa, para agrado de los investigadores, presenta una serie de estimulantes características que han disparado su interés entre la comunidad científica. Quizás lo más novedoso de esta nueva defensa es su carácter altamente adaptativo; las células procariotas son capaces de incorporar a su DNA fragmentos de DNA exógeno con el fin de que estos sirvan de guía para evitar futuras invasiones, usando para ello un mecanismo que en gran parte recuerda a las rutas metabólicas propias del RNA de interferencia. Naturalmente, dicho mecanismo es heredable, extendiendo el beneficio de la inmunización a las células hijas. Aunque principalmente, se ha hecho mención a los fagos, también tenemos que tener en cuenta que este mismo sistema de defensa puede afectar en gran medida la transferencia horizontal de genes entre especies, estando demostrado su interacción negativa en al menos dos de las tres rutas de transferencia horizontal de genes: la conjugación y la transducción [2].

2 2- Disección del locus CRISPR: El primer contacto con el locus CRISPR data de 1987, por Ishino et al [1,2], cuando se localizó en E.coli una agrupación de repeticiones directas cortas separadas entre sí por otras secuencias, no repetidas, a las que se denominó espaciadores. Posteriormente, esta misma estructuración de secuencias fue identificada en otras bacterias y en arqueas. Finalmente, tras la recopilación de suficientes datos, Jasen et al (2002) y Mojica et al (2000) caracterizaron tal ordenación como un locus ampliamente distribuido entre los procariotas, al que le asignaron el acronimo CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) [1,2]. Paralelamente, la comparación de secuencias entre especies desvelo la existencia de dos nuevos elementos asociados. El primero de ellos fue una secuencia rica en A-T que precedía al locus CRISPR, etiquetada como secuencia líder. [2]. El segundo elemento fue un conjunto de genes codificantes para proteínas que se expresaban conjuntamente como un operón. Este conjunto de genes siempre se localizaba próximo al locus CRISPR, flanqueándolo en uno de sus extremos. Acertadamente, se identificó a este grupo de genes codificantes para proteínas como la maquinaria proteica relacionada con la función del locus CRISPR, y se les etiquetó como Cas (Crispr Associated genes) [1,2] (fig. 1). Repetición Espaciador Repetición Secuencia líder Operón Cas Figura 1- Estructura y organización del locus CRISPR y sus elementos relacionados: a) alternancia repetición-espaciador. b) agrupación de repeticiones y espaciadores precedida por la secuencia líder. c) distribucción del locus CRISPR y los genes Cas en E.coli. [tomado y traducido de F.V. Karginov y G:J. Hannon. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell, 2010 January 15; 37(1): 7. doi: /j.molcel ]

3 Sin embargo, a pesar de ser conocida la organización del locus CRISPR y sus elementos asociados, su función permaneció oculta, hasta que, mediante análisis computacional de secuencias, se verificó una concordancia entre algunos espaciadores con secuencias presentes en fagos o en plásmidos. Más aún, aquellas cepas que portaban dichos espaciadores mostraban resistencia o inmunidad, a los correspondientes fagos o plásmidos. Este descubrimiento fue el que puso sobre la pista a los investigadores, relacionando al locus CRISPR con un nuevo mecanismo de defensa [1,2]. Estos datos fueron al poco tiempo comprobados por experimentación, demostrando que las células usando los espaciadores como guía, según complementariedad de bases, eran capaces de abortar una infección o afectar a la estabilidad de plásmidos. Ahora bien, quedaban por delante numerosas preguntas: cómo habían conseguido los espaciadores la célula? Qué sistema permitía a los espaciadores guiar y silenciar a las entidades génicas invasoras? Y cuál era objetivo de su acción: el RNA, como en el caso del RNA de interferencia, o bien actuaba directamente a nivel de DNA? 3-Divergencia evolutiva del locus CRISPR. Clasificación de proteínas Cas: Antes de entrar más a fondo en los mecanismos que gobiernan la respuesta CRISPR/Cas resulta conveniente realizar un breve resumen de la variabilidad observada del locus CRISPR y de las proteínas Cas. Debido a que dicho sistema esta ampliamente difundido entre procariotas (cerca de un 40% de bacterias y prácticamente la totalidad de arqueas [1,2,3] ), es lógico pensar que existe una gran variabilidad entre los mecanismos presentes entre una especie y otra. Algo que condiciona en gran medida su estudio y obliga a ser cautos a la hora de generalizar conclusiones y resultados de experimentos. El locus CRISPR, debido a su propia naturaleza, presenta una altísima variabilidad. A causa de la procedencia exógena de los espaciadores adquiridos es lógico encontrar grandes diferencias en este locus, no solamente en la secuencias presentadas, sino además en la cantidad de espaciadores presentes, tanto si consideramos estas diferencias entre especies como entre las poblaciones de una misma especie. Este es un hecho que responde a la propia capacidad adaptativa de dicho locus. Pero además, podemos considerar otras diferencias significativas. Por ejemplo, la secuencia de las repeticiones difiere frecuentemente entre especies, como también puede diferir su longitud, algo que como se verá más adelante parece corresponderse con el subtipo Cas relacionado [2]. De igual modo, la longitud de las repeticiones y de los espaciadores presenta variación, con unas medias respectivas de 31 pb y de 36 pb [2]. En cuanto a las genes Cas, aunque se presentan mucho más conservados que el locus CRISPR, debido a la función esencial que desempeñan, también puede comprobarse una clara divergencia evolutiva. Actualmente pueden enumerarse unas 45 familias génicas relacionadas con el operón Cas [2]. Entre estas, cabe destacar seis que se presentan con una mayor frecuencia: Cas1-Cas6, agrupados en lo que se ha denominado Cas core. Esto no significa que siempre se puedan encontrar presentes, siendo únicamente Cas1 y Cas2 las que siempre hacen presencia [2]. Además, se ha realizado una clasificación de la asociaciones de familias génicas que pueden darse en el operón Cas dando lugar a ocho subtipos Cas, cuya nomenclatura hace referencia al primer organismo modelo en el que se encontró dicha asociación. Por ejemplo, el subtipo presente en E.coli tiene por nomenclatura Cse, mientras que el subtipo de Y.pestis es Csy (tabla 1). Además, es posible encontrar diferencias en los mecanismos exhibidos por distintos subtipos Cas. Cabe la pena destacar que existe una relación entre la secuencias de las repeticiones y los subtipos Cas relacionados [2], lo que puede ser interpretado como distintos modos de procesamiento.

4 Clasificación de los subtipos de proteínas Cas Subtipo Organismo asociado Genes core Genes específicos del subtipo Ecoli Escherichia coli Cas1-Cas3 Cse1-Cse4 y Cas5e Ypestis Yersinis pestis Cas1-Cas3 Csy1-Csy4 Nmeni Neisseria meningitidis Cas1-Cas2 Csn1 y Csn2 Dvulg Desulfovibrio vulgaris Cas1-Cas4 Csd1-Csd2 y Cas4d Tneap Thermotoga neapolitana Cas1-Cas4 y Cas6 Cst1-Cst2 y Cas5t Hman Haloarcula marismortui Cas1-Cas4 y Cas6 Csh1-Csh2 y Cas5h Apern Aeropyrum pernix Cas1-Cas6 Csa1-Csa5 Mtube Mycobacterium tuberculosis cas1-cas2 y Cas6 Csm1-Csm5 RAMP - Ninguno Crm1-Crm6 Tabla 1- Clasificación de los distintos subtipos Cas y las familias génicas asociados, se ha añadido también a la tabla el modulo RAMP. El gen Cas5 posee un extremo N-terminal conservado, pero el resto de la secuencia parece ser específica del subtipo Cas, de ahí su posición en la tabla. [Tomado de L.A. Marraffini y E.Sontheimer. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archea. Nat. Rev. Genet, 11(3), (2010).] Por último, aunque el número de loci CRISPR presentes en una especie es normalmente uno, pueden encontrarse casos que presenten más de una copia, e incluso puede darse el caso de que dichas copias no correspondan al mismo subtipo Cas. Este hecho puede estar relacionado con la posible transferencia horizontal del sistema CRISPR/Cas, basado en la evidencia de especies estrechamente emparentadas que presentan distintos subtipos Cas y otras especies lejanamente emparentadas que poseen el mismo subtipo Cas [1, 2]. 4-Mecanismo de acción: La respuesta CRISPR/Cas puede ser dividida en tres etapas claramente distinguibles, cada una de ellas con sus propios procesos asociados. Toda la respuesta depende de la acción de las proteínas Cas (conclusión que deriva de la posible transferencia horizontal del sistema CRISPR/Cas), no siendo necesarios aparentemente otros elementos. Estas etapas son: primero, la adquisición e integración de nuevos espaciadores al locus CRISPR que serán vitales para adaptación del sistema CRISPR/Cas; segundo, el conjunto repeticiónespaciador, una vez expresado, debe ser posteriormente procesado para adquirir finalmente su forma madura, el crrna, siendo esta la que, actuando conjuntamente con complejos formados por las proteínas Cas, confiera la específidad necesaria en la respuesta; y, por último, los mecanismos asociados al silenciamiento e inactivación del DNA ajeno a la célula, culminando así la respuesta inmune [3].

5 4.1-Adquisición de nuevos espaciadores: Salvo en el caso de que los espaciadores hayan sido adquiridos por herencia o por transferencia horizontal, estos han de ser incorporados a partir de contactos anteriores con el agente extraño a la célula. Es decir, poniendo como ejemplo un fago, debe haber existido una infección previa que haya sido abortada por algún otro de los sistemas defensivos de la célula. Una vez superada esta primera infección, los restos degradados del DNA vírico son susceptibles de ser incorporados al locus CRISPR como nuevos espaciadores, dotando así a la célula de una nueva resistencia frente a posteriores infecciones por el mismo fago[9]. Simplificando, las células procariotas con un locus CRISPR activo son capaces de generar memoria de infecciones pasadas. El mecanismo intrínseco a este proceso todavía nos es desconocido, al igual que muchos otros aspectos relacionados con el sistema CRISPR/Cas. Sin embargo, si podemos establecer una serie de matices de cómo funciona dicha integración. Cuando se realizaron análisis de secuencia comparando el locus CRISPR entre poblaciones de una misma especie se pudo comprobar que los espaciadores situados en el extremo alejado a la secuencia líder eran compartidos entre las poblaciones, mientras que los espaciadores localizados en la cercanía de la secuencia líder variaban entre las poblaciones. Esto se interpretó como la consecuencia de una incorporación polarizada [1,2]; los nuevos espaciadores se incorporarían en el extremo correspondiente a la secuencia líder alejándose de esta secuencia según se dan nuevas incorporaciones (fig. 2). Bajo esta perspectiva, la secuencia líder cumpliría un papel esencial señalizando el lugar de inserción de nuevos espaciadores. Esto pudo ser comprobado empíricamente, por ejemplo, la deleción de la secuencia líder imposibilita la aparición de nuevos espaciadores. Además, la selección de nuevas secuencias como espaciadores ha demostrado no ser al azar. Una secuencia, presente en un fago o plásmido, susceptible de ser incorporada es denominada proto-espaciador. Cuando se compararon las secuencias presentes en los espaciadores con sus respectivos proto-espaciadores, pudo detectarse la presencia de un motivo, de unos pocos nucleótidos, situado en las cercanías del protoespaciador [1,2,3]. La presencia de este motivo, PAM (Proto-spacer associated motif), determina qué secuencias del DNA foráneo serán incorporadas (fig. 2). Los motivos PAM no son incorporados como parte del espaciador, y su secuencia consenso,aunque invariable dentro de una misma especie, es suceptible a variar entre especies o subtipo Cas, así como su posición respecto al proto-espaciador, situándose bien 5 o 3 de él [1]. A partir de lo anteriormente mencionado, podemos decir que conocemos las secuencias de nucleótidos que señalizan a la maquinaria Cas los fragmentos de DNA foráneo candidatos a convertirse en espaciadores, los motivos Pam, y la posición concreta de inserción de los nuevos espaciadores en el locus CRISPR, la secuencia líder. Sin embargo, los detalles ulteriores a cómo es procesado el proto-espaciador y cómo se realiza su integración están aún por esclarecer, aunque se intuye que dichos fragmentos han de pasar unos pasos previos como pueden ser cortes para adecuar del tamaño del espaciador, así como la adicción de nuevas repeticiones flanqueantes. En lo relacionado a las proteínas Cas implicadas en este proceso, se puede hacer mención a Cas1 y Cas2 en E.coli, cuya mutación impide la incorporación de espaciadores al locus CRIPSR. [2] Sin embargo, en otros organismos parecen ser otras proteínas las implicadas. Por ejemplo, en S. thermophilus existe evidencia que apunta a la proteína Cas7 relacionada con el proceso [5]. Esto parece encuadrarse con las diferencias entre la secuencia de las repeticiones, secuencias líder y motivos PAM entre especies, posiblemente indicando la existencia de distintas proteínas relacionadas con el proceso. Hay que mencionar que se han podido observar deleciones en el locus CRISPR en condiciones de laboratorio, tal vez sugiriendo que la existencia de un mecanismo que regula la longitud del locus CRISPR [2].

6 Cepa 1 Cepa 2 Trabajo voluntario de genética molecular Cepa 3 Cepa 4 Proto-espaciador PAM Figura 2- A) El orden cronológico de incorporación de los espaciadores nos permite realizar estudios comparativos entre cepas de una misma especie. B) El proto-espaciador, en amarillo, flaqueado por el motivo PAM, en rojo. Dicho motivo, direccionaría a la maquinaria Cas relacionada en la identificación, procesado e incorporación del proto-espaciador como un nuevo espaciador. [tomado y traducido de F.V. Karginov y G:J. Hannon. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell, 2010 January 15; 37(1): 7. doi: /j.molcel ] 4.2-Biogénesis de crrna: Esta etapa abarca los pasos que median entre la transcripción del locus CRISPR y la generación de crrnas maduros. Toda la secuencia del locus CRISPR es transcrita como un solo RNA precursor. Este ha de ser posteriormente procesado mediante cortes que individualicen cada espaciador en una sola molécula de crrna. La transcripción del RNA precursor se da a partir de un promotor situado bien cercano a la secuencia líder o bien incluido en esta misma [1]. La estructura espacial de este RNA posibilita la existencia de horquillas debidas a la naturaleza parcialmente palindrómica de las repeticiones, pudiendo ser esta conformación relevante para su procesamiento [2] (fig. 3). En E.coli, se ha podido relacionar el procesamiento del RNA precursor con un complejo de proteínas formado por CasA-CasE [6]. Este complejo, llamado Cascade ( CRISPR-ASsociated Complex for Antiviral DEfense), procesa el RNA precursor realizando cortes en las repeticiones. Llama la atención, en experimentos in vitro, que la proteína CasE (o Cse3, dependiendo de la nomenclatura) es la única indispensable para que se dé la aparición de crrna maduro [6]. Como en los casos anteriores, existen evidencias en otros organismos que apuntan a otras proteínas como efectoras de este procesamiento (en la arquea P.furiosos la proteína Cas6 parece ser la encargada de realizar el corte [3]).Además de los cortes en las repeticiones, es posible que se dé una acción exonucleolítica que elimine algunos de los remanentes de la repetición [1,3,6]. Aún así parece relevante la permanencia de una etiqueta de 8 nucleótidos en el extremo 5 del crrna, cuya existencia parece ser importante para el reconocimiento del crrna por parte de la maquinaria proteica encargada en el silenciamiento del DNA exógeno o bien para evitar una respuesta autoinmune [2].

7 Procesamiento exonucleólitico. crrna maduro Figura 3- Procesamiento del RNA precursor hasta la obtención de crrna maduro. [tomado y traducido de F.V. Karginov y G:J. Hannon. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell, 2010 January 15; 37(1): 7. doi: /j.molcel ] Por último remarcar que la expresión del locus CRISPR y del operón Cas se da normalmente de manera constitutiva, aunque se ha podido comprobar en E.coli y T.Thermophilus indicios de un incremento de la expresión ante una infección [3]. 4.3-Silenciamiento del DNA exógeno: La última de las etapas de la respuesta CRISPR/Cas engloba la inactivación efectiva del DNA de procedencia externa. Hasta hace relativamente poco se desconocían varios de los aspectos más importantes de como se llevaba a cabo dicho silenciamiento. Este podía ser provocado bien silenciando el mrna, de una manera análoga a como acontece en las rutas del RNA de interferencia, o bien actuando de una manera más directa haciendo como objetivo de la respuesta al propio DNA. Según se iban recopilando observaciones en diversos experimentos, entre los que cabe destacar el experimento desarrollado por L.A. Marraffini et E.J. Sontheimer por su ingenio (caja 1 ), la hipótesis del DNA iba cobrando cada vez más fuerza. Otras evidencias que apoyan ésto son, por ejemplo, la existencia de espaciadores que complementan con regiones intergénicas o bien con la hebra molde; además, únicamente se ha comprobado correlación entre espaciadores y secuencias presentes en el virus de DNA o plásmidos, aunque, como son muy pocos los espaciadores de los que se conoce su procedencia (aproximadamente un 2%) es posible que nuevos datos aporten interesantes novedades [2]. Aún así, quedaba por ver como se llevaba a cabo dicha inactivación. Era el DNA cortado o bien la respuesta provocaba interferencias en la transcripción del DNA? En los recientes experimentos realizados por Garneau et al (2010) (caja 2), comentado por E. Sotheimer y L.A. Marrafini en el articulo Slicer for DNA, se pudo Caja 1 Mientras realizaban sus ensayos para ver cómo afectaba el sistema CRISPR/Cas a la transferencia de plásmidos entre células por conjugación, L.A. Marraffini y E.J. Sontheimer, pudieron encontrar una clara evidencia que apuntaba al DNA como el objetivo de la acción del sistema CRISPR/Cas. Disponían de plásmidos que portaban un proto-espaciador dentro de la secuencia del gen codificante para una endonucleasa necesaria para que se dé la donación, y de cepas de Staphylococcus epidermidis con un espaciador complementario a dicho proto-espaciador. Si el sistema CRISPR/Cas actuaba interfiriendo el mrna de la endonucleasa el resultado esperado sería que dicha cepa actuaría como un mal donador del plásmido. Sin embargo, sus datos indicaban que la cepa no sólo actuaba como un mal donador, sino que además resultaban ser un mal hospedador del plásmido. El sistema CRISPR/Cas parecía que hacia diana sobre el propio DNA plasmídico. Ambos investigadores, instigados por estos resultados, diseñaron un ingenioso experimento para obtener evidencias más concluyentes. Modificaron el plásmido, añadiendo un intrón tipo I dentro del gen de la endonucleasa, de tal manera que la secuencia del protoespaciador se veía interrumpida en el DNA. Al transcribirse el gen, con la escisión del intrón, el proto-espaciador sería reconstituido. En tales condiciones, la respuesta CRISPR/Cas era sorteada: las células hospedaban correctamente el plásmido y eran capaces de donarlo normalmente. Para que se diese la interferencia era indispensable que la secuencia del proto-espaciador se encontrase intacta en el DNA, siendo indiferente su presencia en el mrna. Este lucido experimento supuso una de las evidencias más claras para apoyar al DNA como el sustrato de la acción del sistema CRISPR/Cas. [4]

8 detectar cortes in vivo en el DNA de plásmidos y fagos. Esta nueva evidencia parece haber esclarecido el método empleado por la respuesta CRISPR/Cas, la inactivación sería llevada a cabo por corte actuando directamente sobre el DNA. Aún así, no se descarta que puedan existir otros mecanismos que difieran, como particular el caso del modulo RAMP (ver post scriptum). Según estos resultados, el crrna actuaría formando un complejo con determinadas proteínas Cas, guiando el corte por complementariedad de bases. En E.coli, por ejemplo, la proteína relacionada es Cas3, aunque no se descarta otras proteínas implicadas en el proceso en otros subtipos Cas u organismos (debemos recordar que Cas3 no esta ubicuamente representada en el operón Cas). El corte se daría dentro de la secuencia del protoespaciador, y,al menos en los experimentos realizados por Garneau et al, el corte sería de doble banda generando extremos romos. Otro aspecto de interés es la necesidad de que el proto-espaciador objetivo permanezca ubicado cerca del motivo PAM, un hecho que se ha interpretado como una medida preventiva que evitaría que la respuesta inmune actuase sobre el DNA propio (el crrna puede complementar con su mismo espaciador situado dentro del locus CRISPR). Esta exigencia, la presencia del motivo PAM cercano al proto-espaciador, parece ser uno de los mecanismos desarrollados por los fagos para lograr esquivar el sistema CRISPR/Cas, mediante recombinaciones homologas que logren separar al proto-espaciador del motivo PAM [2]. También se han realizado estudios modificando ligeramente la secuencia del proto-espaciador o el motivo PAM, demostrando que algunas mutaciones puntuales son más que suficientes para afectar la eficacia de reconocimiento del proto-espaciador por el crrna. En su articulo, el grupo formado por Garneau et al cita que pueda existir una cierta flexibilidad en el extremo 5 del crrna, mientras que mutaciones en las regiones intermedias o en el extremo 3 parecen ser más criticas en el reconocimiento. La alta especifidad que requiere la repuesta CRISPR/Cas también puede ser aprovechada por los fagos, haciendo uso de su alta frecuencia de mutación. Caja 2 Los recientes experimentos realizados por J.E. Garneau et al, presentados en un articulo durante 2010, fueron realizados en S.thermophilus. En ellos se utilizó un plámido que confería resistencia a cloranfenicol (cat), estudiándose tanto la estabilidad del plásmido como su capacidad de transferencia ante distintos espaciadores adquiridos, gracias a la detección de colonias resistentes o no a cloranfenicol. Las colonias sensibles a cloranfenicol indicarían células que habrían perdido el plásmido debido a la acción del sistema CRISPR/Cas. También se hizo observación de como mutaciones puntuales tanto en los espaciadores como en los motivos PAM podían afectar a la respuesta inmune. Se analizó el efecto de alelos amorfos para los locus Cas5 y Cas7. La cepa mutante para Cas5 no presentó colonias sensibles a cloranfenicol, siendo los plásmidos altamente estables, no aparecieron nuevos espaciadores entre estas colonias. De la cepa mutante para Cas7 si que llego a detectarse colonias sensibles a cloranfenicol, sin embargo no hubo adquisición de nuevos espaciadores. Los resultados obtenidos se ajustaban a lo observado por otros estudios, es decir, Cas5 estaría involucrado en etapa de silenciamiento de DNA mientras que Cas7 estaría asociado a la maquinaria de adquisición de nuevos espaciadores. La importancia de estos experimentos estriba en el hecho de que el grupo de investigación pudo llegar a detectar la presencia de formas lineales del plásmido que,normalmente, se perdían en pocas generaciones. Inmediatamente se intento asociar la presencia de las formas lineales del plásmido con mutantes para Cas5 y Cas7. Los mutantes Cas5 - solo presentaban la forma circular, en cambio, los mutantes Cas7 - presentaban ambas formas. Además, la secuenciación de los plásmidos lineales indicó que el corte del plásmido se situaba dentro de un proto-espaciador asociado a un motivo PAM. Con estos datos se interpretó que el sistema CRISPR/Cas actuaba realizando cortes romos dentro de la secuencia de los proto-espaciadores, provocando la aparición de formas lineales del plásmido y su posterior perdida. Estas mismas conclusiones fueron contrastadas con la secuenciación de DNA vírico de bacteriofagos, que previamente habían infectado bacterias de la misma especie que poseían resistencia a dichos fagos. El DNA vírico presentó también cortes dentro de los proto-espaciadores o en las cercanías de estos. La mutación en Cas5 hacia perder la resistencia ante el fago, reafirmando la implicación de dicha proteína en el proceso de corte del DNA. Mutantes en Cas7 seguían manteniendo la resistencia, como era de esperar, al estar relacionada la proteína Cas7 en la adquisición de espaciadores y no en el mecanismo de interferencia. Estos experimentos demuestran claramente que el sistema CRISPR/Cas, en S.Termophylus, actúa realizando cortes en el DNA tanto de plásmidos como de fagos. [5]

9 Quedan muchos aspectos relevantes en torno a este tema por ser esclarecidos. La cuestión de como el sistema CRISPR/Cas es capaz de diferenciar entre DNA propio de DNA ajeno esta todavía en el aire, algunos autores apuntan a un papel relevante de los motivos PAM, otros adjudican dicho papel a la etiqueta de 8 nucleótidos presente en el extremo 5 del crrna. También queda el hecho que solamente han sido estudiados unos pocos organismos. En S.Termophylus queda demostrado el mecanismo de corte sobre DNA; tanto en E.coli y S.epidermitis el mecanismo parece seguir el mismo curso de acción, pero hay que ser precavido a la hora de extrapolar estos resultados a todos los posibles sistemas CRISPR/Cas existentes. 5.-Tecnologías basadas en CRISPR/Cas: Al mismo tiempo que se iba descubriendo las características de este curioso mecanismo defensivo de los procariotas, los investigadores han ido especulando sobre las potenciales tecnologías basadas en él. Actualmente, la peculiar forma de incorporación de los espaciadores, situándose los más nuevos cercanos a la secuencia líder y los más viejos en el extremo más alejado, nos permite usar el locus CRISPR como una valiosa herramienta para el estudio comparativo entre poblaciones de una misma especie ( spacer oligotyping o spoligotyping ), usado, por ejemplo, para identificar cepas de M.Tuberculosis [2] Este mismo método puede ser de gran valía en estudios relacionados con ecología microbiana o incluso metagenómica, al poder establecer una relación entre un procariota (espaciador) y los fagos que la parasitan (proto-espaciadores) [1]. Otra aplicación relevante, de uso actual, es la manipulación del locus CRISPR con el fin de procurar resistencia ante determinados fagos a bacterias de importante interés biotecnología, o bien para evitar la propagación de plásmidos que confieran resistencia a antibióticos [2,5]. Por último, se especula si los mecanismos de corte específicos guiados por RNA a DNA (CRISPR/Cas), o de RNA a RNA (modulo RAMP), podrían ser utilizados como herramienta de uso común en biologia molecular y en ingeneria genética. Existen esperanzas en que este uso sea posible, pero todavía quedan por conocer más detalles inherentes al mecanismos. Quizá, esto sea una de las razones por las que la principal línea de trabajo actual se centra en la caracterización y discernimiento de los mecanismos de acción de las proteínas Cas. 6- Conclusiones y opinión del alumno. Es llamativo que unos organismo unicelulares tan sencillos, evolutivamente hablando, sean capaces de desarrollar una respuesta inmune tan compleja como la aquí comentada. La capacidad de los fagos a la hora de mutar sus genomas, superior a la que pueden poseer la bacterias o las arqueas, supone un grave aprieto a estas últimas. El desarrollo de un sistema capaz de otorgar una inmunización de una manera tan directa, mediante la incorporación de fragmentos de DNA vírico, debió suponer una grandísima ventaja para los procariotas, siendo sin duda una de las principales defensas que poseen estos organismos para hacer frente a la agresión por parte de los fagos. También impresiona el hecho que dicha inmunización sea capaz de transmitirse vía herencia. No pasa por alto, como comentan algunos autores [1], que esta capacidad de adaptación se ajusta perfectamente al paradigma lamarckiano. También llama la atención, dejando de lado los organismos, la capacidad del RNA de poseer un papel defensivo. El descubrimiento del RNA de interferencia supuso un cambio drástico en la concepción de la regulación génica. De igual manera, las investigaciones realizadas sobre RNA implicados en procesos defensivos, como es este caso, pueden poner en relevancia como por necesidad evolutiva el RNA adquirió un rol defensivo de vital importancia en muchos organismos. El caso de crrna no es único, pues en muchos artículos se hace mención a su parecido con otros RNA pequeños que también actúan con funciones parecidas Entre estos RNA pueden mencionarse los pirnas en el control de elementos génicos transponibles (que pueden ser considerados como endoparásitos en el genoma de los organismos); pequeños RNA presentes en plantas relacionados con el control de transposones y respuestas antivirales; y el sirna presente en invertebrados [1].

10 Como consideración final, me ha llamado mucho la atención el papel del motivo PAM tanto en la adquisición de espaciadores como en la inactivación del DNA. Es punto común que parece estar presente en ambas etapas, e imagino la existencia de una proteína Cas cuya función sea el reconocimiento de esta corta secuencia de pares de bases, y a su vez podría actuar como proteína reclutadora para el resto de proteínas necesarias. Esto supondría que la respuesta esta mediada por un sistema de doble positivo, primero sería necesario el reconocimiento del motivo PAM y, posteriormente, si la secuencia del proto-espaciador es complementaria al crrna se pondría en marcha la maquinaria encargada de realizar el corte. De igual manera, la adquisición de nuevos espaciadores tendría como paso previo el reconocimiento de una secuencia PAM, y a posteriori, se irían incorporando el resto de la maquinaria encargada del procesado del protoespaciador para dar lugar al espaciador. Un punto que me ha dejado con dudas es cómo, al igual que la maquinaria encargada de realizar el corte debe ser capaz de distinguir entre el DNA propio del ajeno, la maquinaria asociada a la incorporación de nuevos espaciadores es capaz de distinguir el DNA de origen extracelular. Imagino que tal vez la maquinaria sólo es capaz de actuar sobre DNA parcialmente degradado, o bien es capaz de reconocer modificaciones presentes en el DNA de la célula. P.S.: Se puede añadir un elemento más relacionado con el locus CRISPR, denominado modulo RAMP (Repeat Associated Mysteriuos Proteins). La asociación de dicho modulo con CRISPR se da en algunas especies, siendo por lo general más frecuente esta en arqueas [2, 8], pero puede estar ausente. En caso de estar presente, se encontra siempre asociado a uno de los subtipos Cas. En cuanto su posible función, se ha comprobado, al menos en P.furiosus, in vitro, que las proteínas RAMP, actuando conjuntamente con las proteínas Cas, pueden hacer uso de crrna para realizar cortes específicos en RNA [2]. En el presente trabajo no se discutirá sobre el módulo RAMP, por quedar un tanto alejado a la línea general del trabajo, sin embago, merece ser mencionado. Para más información sobre el tema se puede consultar el siguiente articulo: C:R: Hale et al. RNA-guided RNA cleavage by CRISPR RNA-Cas protein complex. Cell; (2009)139,

11 7-Referencias: Las principales referencias usadas en este trabajo, y muy aconsejables como fuentes que abarcan todos los aspectos relativos al sistema CRISPR/Cas, fueron: 1- Karginov, F.V. and Hannon, G. J. (2010). The CRIPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell, 37: 7-?. 2-Marraffini, L.A. and Sontheimer, E.J. (2010) CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet, 3: Terns, M.P. and Terns, R.M. (2011). CRISPR-based adaptative immune systems. Current Opinion in Microbiology, 14: Otras fuentes consultadas pero con un carácter más concreto acerca de uno o varios aspectos del sistema CRISPR/Cas fueron: 4-Marraffini, L.A. and Sontheimer, E.J. (2010) CRISPR interference limits horizontal gene transfer in Staphylococci by targeting DNA. Science, 322: Garneau, J.E. ; Dupuis,M.E.; Villion, M. ; Romero, D.A. ; Barrangou, R. ; Boyaval, P. ; Fremaux, C. ; Horvath, P. ; Madagan, A.H. and Moineau, S. (2010). The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature, 468: Brouns, S.J.J. ; Jore, M.M. ; Lundgren, M. ; Westra, E.R. ; Slijkhuis, R.J.H. ; Snijders, A.P.L. ; Dickman, M.J. ;Makarova, K.S. ; Koonin, E.V. and Van der Oost, J. (2008). Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science, 321: Barrangou, R. ; Fremaux, C. ; Deveau, H. ; Richards, M. ; Boyaval, P. ; Moineau, S. ; Romero, D.A. and Philippe Horvath, P. (2007). CRISPR provides acquired resistence against viruses in prokaryotes. Science, 315: Hale, C.R. ; Zhao, P. ; Olson, S ; Duff, M.O. ; Graveley, B.R. ; Wells, L. ; Terns, R.M. and Terns, M.P. (2009). RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex. Cell, 139: Marraffini, L.A. and Sontheimer, E.J. (2010). Slicer for DNA. Nature, vol 468: