Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay" RESUMEN

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1 Rev Cubana Farm 1998;32(2): Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay" VALIDACIÓN DE TÉCNICAS ANALÍTICAS UTILIZADAS EN EL CONTROL DE LA CALIDAD Miriam Díaz de Armas, 1 Idania Hernández Oramas, 2 Marcia Martínez de Santelices Cuervo, 3 Ma. Victoria Licea Tornés, 4 Lidaila Gómez Bañobre, 5 Gloria Louro González, 6 Yelina Morera Fernández 7 y Esther González Hernández 8 RESUMEN Se seleccionó una metodología y se elaboró un procedimiento normativo operacional para la validación de métodos analíticos, utilizados en la evaluación de las producciones actuales para los requerimientos de calidad. Se comprobó la utilidad de dicho procedimiento mediante la validación de los métodos volumétricos y espectrofotométricos que intervienen en el control de la calidad del juego de reactivos para determinación de hemoglobina en sangre. Se demostró mediante el diseño experimental y los procedimientos estadísticos empledos que dichos métodos son lineales (r 2 >0,98), exactos (F exp. < F tab. y. < t tab. ), precisos (CV 3 %) y específicos (respuesta no significativa), por lo cual son confiables para ser utilizados en la comprobación de las especificaciones de calidad del juego de reactivos. Descriptores DeCS: JUEGO DE REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO; HEMOGLOBINA/ análisis; CONTROL DE CALIDAD. La validación de un método analítico es el proceso por el cual queda establecido por estudios experimentales que la capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación analítica deseada. 1 Ésta se fundamenta en la determinación de diversos parámetros que se aplican de acuerdo con la categoría a la que pertenezcan. 2 Para el desarrollo de un nuevo producto es necesario la utilización de métodos analíticos que permitan cuantificar el producto en forma de materia prima o como principio activo de la formulación con un alto grado de confiabilidad. 3 En la actualidad los laboratorios de control de la calidad de la Industria Médico-Farmacéutica no sólo se ocupan de analizar si un producto cumple o no con sus requisitos de calidad mediante la utiliza- 1 Master en Ciencias. Licenciada en Farmacia. Investigadora Agregada. 2 Licenciada en Farmacia. Aspirante a Investigadora. 3 Licenciada en Química. Investigadora Agregrada. 4 Licenciada en Química. Aspirante a Investigadora. 5 Licenciada en Matemática. 6 Técnica en Productos Biológicos. 7 Técnica en Química Industrial. 8 Técnica en Metrología. 106

2 ción de métodos analíticos establecidos para cada uno de ellos, sino también se esfuerzan para validar cada método analítico utilizado en el control de la calidad de sus productos. Basado en este criterio el laboratorio de control químico inició la validación de sus métodos analíticos con la que interviene en el control de la calidad de un juego de reactivos que se encuentra en fase de desarrollo, y posteriormente será sometido a un estudio de estabilidad. En este trabajo se muestran los resultados obtenidos en la validación de las técnicas utilizadas en el control de la calidad del juego de reactivos para la determinación de hemoglobina en sangre, compuesto por reactivo 1 (solución de cianuro de potasio 1g/100 ml) y reactivo 2 (tabletas de ferricianuro de potasio 200 mg/tab), 4 así como los resultados de la validación del método de análisis de la cianometaglobulina utilizado en el ensayo funcional del juego de reactivos. 5 MÉTODOS 1. Requisitos previos a la validación. Para garantizar la confiabilidad de los resultados se aseguró el cumplimiento de los requisitos siguientes: 6 - Calificación del personal en el uso de los métodos a validar. - Calibración de los instrumentos de medición y las medidas de capacidad de vidrio utilizado. - Utilización de reactivos apropiados y soluciones de trabajo valoradas. - Observación de las medidas de seguridad. 2. Selección de los parámetros apropiados de acuerdo con la clasificación del método analítico y el tipo de validación a realizar: Para validar las técnicas analíticas utilizadas para la evaluación de la concentración del principio activo en la solución de cianuro de potasio 1 % y en las tabletas de ferricianuro de potasio, 4 y de la técnica utilizada para el análisis de la cianometahemoglobina en el ensayo funcional del juego de reactivos, 5 se escogieron los parámetros adecuados según los criterios de validación que aparecen reportados en el Procedimiento Normativo Operacional de la Empresa de Productos Biológicos " Carlos J Finlay". Validación de métodos volumétricos Los métodos de valoración del cianuro de potasio y el ferricianuro de potasio, fueron validados mediante la evaluación de los parámetros siguientes: - Linealidad: Se prepararon 6 soluciones de concentraciones entre 70 y 120 %, incluyendo el 100 %. Las concentraciones fueron las siguientes: cianuro de potasio (7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0; 12,0 mg/ml); ferricianuro de potasio (4,6; 5,3; 6,0; 6,6; 7,3; 8,0 mg/ml). Se realizaron 3 réplicas de cada una. Se determinó la recta de regresión lineal, así como los coeficientes r y r 2. Para el test de linealidad se consideró el coeficiente de variación para el factor de respuesta f (CV f ), la desviación estándar relativa de la pendiente (Sb rel ) y la t de Students práctica (Tp) y la F de Fisher práctica (F p ) para p= 0,01. - Precisión (repetibilidad, reproducibilidad y robustez) - Repetibilidad y reproducibilidad: Se evaluaron las muestras durante 10 d. La concentración teórica del cianuro de potasio fue de 1,0 mg/ml y la del ferricianuro de potasio 6,6 mg/ml. Se realizaron 4 réplicas por la mañana y 4 réplicas por la tarde, y se analizaron estadísticamente los resultados obteni

3 - dos en el día y entre días. Se determinó el coeficiente de variación (CV) y se aplicó la prueba Anova de clasificación simple. Robustez: Se analizó mediante un diseño factorial 2 3, según la tabla de Yourden y Steiner, 6 considerando las variables: reactivo recién preparado, reactivo con días de preparado, temperaturas de trabajo diferentes (4 C y temperatura ambiente) y 2 analistas; se realizó cada determinación por triplicado. - Exactitud: Para el método del ferricianuro de potasio se realizó un ensayo de recuperación, analizando 3 muestras de concentraciones diferentes (5,3; 6,6 y 8,0 mg/ml) por triplicado, preparadas a partir de un placebo. Se halló la varianza, la G de Cochran y la t de Studenerimental para p = 0,05 en el ensayo de recuperación. Para el método del cianuro de potasio se preparó un patrón de analito al 100 % de concentración (1g/100 ml) y una solución placebo a la cual se añadió la cantidad necesaria de analito para obtener la concentración al 100 %; ambas soluciones se valoraron utilizando el mismo método analítico. Se determinó la F de Fisher y la t de Student para p = 0,05. - Especificidad: Considerando el factor degradante, previamente seleccionado, se evaluaron conjuntamente una solución de producto degradado y una solución patrón al 100 % de concentración, utilizando el mismo método analítico. Validación de un método espectrofotométrico El método de la cianometahemoglobina utilizado en el ensayo funcional del juego de reactivos para determinación de hemoglobina en sangre, se validó de acuerdo con los criterios establecidos según bibliografía consultada. 7 Los parámetros son los siguientes: - Linealidad: Se evaluó la linealidad del sistema instrumental al estudiar 6 soluciones por triplicado en un rango de concentraciones de 20 a 200 % (4,2; 8,5; 12,6; 16,8; 18,2; 21,0 g/dl). Se comprobó estadísticamente ésta y se evaluó la linealidad del método al analizar 6 soluciones por triplicado en un rango de concentraciones de 80 a 120 % (6,2; 8,2; 10,2; 12,6; 16,4; 18,2 g/dl). Se determinó la recta de regresión lineal y se calcularon los coeficientes de r y r 2. Para el test de linealidad se hallaron el coeficiente de variación (CV f ) para el factor de respuesta f; la desviación estándar relativa de la pendiente (Sb rel ) y la F de Fisher práctica (F p ) para p = 0,05. - Precisión (repetibilidad, reproducibilidad y robustez). - Repetibilidad y reproducibilidad: Se consideraron muestras de concentraciones altas (18,0 g/dl), medias (12,0 g/dl) y bajas (4,8 g/ dl) de hemolizados de producción nacional y se estudiaron por el método propuesto durante 10 d, mañana y tarde, realizando 4 repeticiones en cada sesión. Se determinó el coeficiente de variación (CV) y se aplicó la prueba Anova de clasificación simple. - Robustez: Se analizó mediante un diseño factorial 2 3 según la tabla de Yourden y Steiner, 6 considerando las variables: 2 tiempos de incubación de la reacción (15 y 40 min), 2 temperaturas de trabajo (temperatura ambiente y 37 C) y 2 analistas; se realizó cada determinación por triplicado. - Exactitud: Se comparó el juego de reactivos diseñado con un juego de reactivos de la firma comercial Wiener, en un total de 100 muestras de pacientes en paralelo y por duplicado. Los resultados obtenidos por ambos métodos se compararon mediante un análisis de regresión lineal. 108

4 - Sensibilidad: Los límites de detección y cuantificación se calcularon teóricamente utilizando el valor de la ordenada en el origen obtenida para la recta de calibración en el ensayo de linealidad. Los límites calculados se comprobaron experimentalmente mediante el análisis repetitivo de 10 muestras de 2 soluciones preparadas a las concentraciones obtenidas y los resultados fueron evaluados por un Anova de clasificación simple. RESULTADOS En la tabla 1 se presentan los resultados obtenidos en la validación de 2 métodos volumétricos. Como se puede observar en esta tabla, las técnicas analíticas empleadas en la cuantificación de los principios activos cianuro de potasio y ferricianuro de potasio, cumplen con los rangos de aceptación de acuerdo con el estudio estadístico realizado para los parámetros estudiados (linealidad, precisión, exactitud y especificidad), en las concentraciones seleccionadas y las condiciones de trabajo establecidas. En la tabla 2 se observan los valores obtenidos para el ensayo funcional del juego de reactivos desarrollado, considerando para su evaluación los parámetros de linealidad, precisión a concentraciones bajas, medias y altas del analito (como se recomienda en la bibliografía consultada); además de exactitud y sensibilidad del método, los cuales se encuentran dentro de los rangos de aceptación establecidos. TABLA 1. Resultados de la validación de métodos volumétricos Procesamiento Valoración del Valoración del ferri- Criterios de Parámetro estadístico cianuro de potasio cianuro de potasio aceptación 109 Linealidad. Coeficientes de r 2 = 0,9989 r 2 = 0,9925 r 2 ³,98 correlación y r = 0,9994 r = 0,9962 r 0,99 determinación. Test de linealidad CV f = 0,63 % CV f = 1,89 % Sb rel = 0,84 % Sb rel = 1,98 % CV f 5 % Sb rel 2 % = 118,50 = 46,05 ³ t (16; 0,01) =2,92 F exp = 14092,62 F exp = 2120,78 F exp ³ F (1; 16; 0,01) = 8,53 FA exp = 2,64 FA exp = 4,17 FA exp ³FA (4; 12; 0,01) =5,41. Test de proporcionalidad a = -0,15 a = -0,18 a» 0 IC (a) = (-0,32; 0,10) IC (a) = (-0,17; 0,29) IC (a) incluye el 0 = 1,95 Precisión. Coeficientes de CV repet =0,40 % = 1,27 CV Repet = 0,28 % < t (16; 0,05) = 2,12 CV Repet. Repetibilidad y variación CV Reprod = 1,83 % CV Reprod = 1,60 % CV Reprod Reproducibilidad CV Reprod < 2 CV Repet. Test de Anova Diferencias no sig- Diferencias no sig- Diferencias no sigde clasificación nificativas nificativas nificativas simple F exp =1,43 F exp = 1,31 F exp < F (9; 70; 0,01) = 2,82. Robustez. Factorización Diferencias no sig- Diferencias no signi- Diferencias no significativas para ficativas para nificativas cada factor cada factor Exactitud. Test de Fisher F exp = 1,35 F exp < F (9; 9; 0,05) = 3,18. Test de Student = 0,51 < t (18; 0,05) = 2,10. Test de Cochran G exp = 0,30 G exp < G (3; 3; 0,05) = 0,87. Test de Student = 0,13 < t (8; 0,05) = 2,30 Especificidad - No significativa No hay respuesta Respuesta no significativa 109

5 TABLA 2. Resultados de la validación del método espectrofotométrico Parámetro Procesamiento estadístico Resultados Criterios de aceptación Sistema instrumental Método r 2 ³ 0,98 Linealidad Coeficientes de r 2 = 0,9990 r 2 =0,9997 r³ 0,99 correlación y r = 0,9995 r = 0,9998 determinación Test de linea- CV f = 0,61 % CV f = 0,45 % CV f 5 % lidad Sb rel = 0,25 % Sb rel = 0,41 % Sb rel 2 % = 399,86 = 242,64 ³ t (16; 0,01) = 2,92 F exp = ,55 F exp = 58876,97 F exp ³ F (1;16; 0,01) = 8,53 FA exp = 3,68 FA exp = 4,98 FA exp FA (4;12; 0,01) = 5,41 Test de propor- - a = 0,15 a» 0 cionalidad IC (a) = (-0,20; 0,50) IC (a) incluye el 0 = 0,009 < t (16; 0,05) = 2,12 Precisión C onc. bajas Conc. medias Conc. Altas Repetibilidad y Coeficientes de CV Repet = 0,43 % 0,16 % 0,14 % CV Repet Reproducibilidad variación CV Reprod = 0,11 % 0,22 % 0,02 % CV Reprod CV Reprod < 2 CV Repet Test de Anova Diferencias no significativas Diferencias no significativas de clasificación F exp = 0,31 1,21 0,68 F exp < F (9; 70; 0,01) = 2,82 simple Robustez Factorización Diferencias no significativas Diferencias no significativas para cada factor Exactitud Análisis de re- r 2 = 0,9960 r 2 >0, 98 gresión lineal F exp = 8856,66 F exp > F (1;98;0,01) = 6,85 IC (b) = (0,96; 1,01) IC (b) incluye el 1 IC (a) = (-0,09; 0,43) IC (a) incluye el 0 b = 0,9859 b» 1 Sensibilidad Coeficiente de a = 0,15 3 a variación b = 2,88 LD = b LD = 0,16 g/dl CV = 0,52 % CV LC = 0,52 g/dl CV = 0,62 % 10 a LC = b DISCUSIÓN Al evaluar estadísticamente la linealidad de los métodos analíticos validados y del sistema instrumental para el método espectrofotométrico, se obtuvieron coeficientes de correlación (r) y de determinación (r 2 ) que demuestran que existe regresión entre las variables concentraciones y las respuestas medidas. Para confirmar que dicha regresión era lineal se aplicaron diferentes test de linealidad, considerando el análisis de la 110 varianza (FA exp ) el tests más riguroso que corroboró la linealidad de los métodos y del sistema instrumental. De igual forma se comprobó que se cumple la condición de proporcionalidad y el error sistemático de cada método es despreciable. Por otra parte, el estudio de precisión mostró una buena repetibilidad y reproducibilidad de los resultados de acuerdo con los criterios de aceptación, mientras que los factores estudiados para cada método en el ensayo de robustez no influyeron significativamente en los

6 resultados, por lo cual podemos considerar que dichos métodos son precisos. Para evaluar la exactitud se aplicaron diferentes procedimientos experimentales y estadísticos que responden a las características propias del método analítico validado. En el caso del método de valoración del ferricianuro de potasio se comprobó que el rango de concentraciones estudiado no influye en la variabilidad de los resultados, ya que se cumplió con el criterio del test de Cochran (G exp ), además no se obtuvieron diferencias significativas entre la recuperación media y el 100 % al aplicar el test de Student ( ), confirmando la buena exactitud del método. Se determinó igualmente que el método de valoración del cianuro de potasio es exacto, ya que no existen diferencias significativas entre los resultados, ni por su varianza (test de Fisher) ni por la diferencia de medias (test de Student); mientras que para el método de determinación de la cianometahemoglobina se obtuvo un 98 % de equivalencia con el método de referencia de la firma comercial Wiener y una recta de regresión lineal: y=0,9859 x + 0,1754, que garantiza la exactitud del método. Además, se comprobó que ambos métodos volumétricos son específicos, ya que los productos de degradación en un caso no interfieren en la valoración, mientras que en el otro la respuesta es insignificante. Los límites de detección (LD) y cuantificación (LC) calculados para el método de determinación de la cianometahemoglobina, fueron corroborados experimentalmente. El método es sensible, ya que no se encontraron diferencias significativas entre los resultados obtenidos para cada límite y los coeficientes de variación para cada uno de ellos fueron menores que el coeficiente de variación permitido para el método. Todos los resultados obtenidos en la validación de los métodos volumétricos y espectrofotométrico permiten asegurar que son confiables, ya que cumplen los criterios de validación reportados por Castro y otros en 1989 y por Aguilar y otros en Además ambos métodos pueden ser utilizados tanto en el control de la calidad como en el estudio del juego de reactivos para determinación de hemoglobina en sangre. De esta manera se comprobó experimentalmente la utilidad del procedimiento establecido para la validación de métodos analíticos; y queda abierto el camino a la validación de todos los métodos analíticos en el control de la calidad. AGRADECIMIENTOS Agradecemos a la licenciada Yaimí Farias Domínguez por su desinteresada colaboración y sus sabios consejos en la interpretación estadística de los resultados. SUMMARY A methodology was selected and a normative operative procedure was prepared for the validation of analytical methods used in the evaluation of the present productions for quality requirements. The usefulness of this procedure was proved by the validation of the volumetric and spectrophotometric methods taking part in the quality control of the reagent kits for determining haemoglobin in blood. It was demostrated by the experimental design and the statistical procedures used that such methods are lineal (r 2 > 0.98), exact (F exp < F tab and T exp < t tab ), precise (CV ) and specific (no significative response). Therefore, they are reliable and may be used in the checking of the quality specifications of the reagent kits. Subject headings: REAGENT KITS, DIAGNOSTIC; HEMOGLOBINS/analysis; QUALITY CONTROL

7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Aguilar G, Alcántara A, Chárvel A, García JL, Garzón A, Guerrero ME, et al. Validación de métodos analíticos. Comité de Elaboración de Guías Oficiales de Validación de la Dirección General de Control de Insumos para la Salud, SSA. Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biológicos. México AC, United States Pharmacopoeial Convention. USP XXII. United States Pharmacopoeia. 22 ed. Easton: Mark Printing; 1990:1225, Rampazoo P. Standardisation and Validation of Analytical Methods in the Pharmaceutical Industry. II Farmaco 1990;45: Analar. Standards for Laboratory Chemicals. 6 ed. London: Analar Standards LTD; 1967:390-1, Beal PJ, Cook LP, Lovric VA. Hemoglobin. Pathology 1974;6: Castro M, Gascón S, Pujol M, Sans JM, Vicente L. Validación de métodos analíticos. Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria. Monografía AEFI. Sección Catalana. Comisión de Normas de Buena Fabricación y Control de la Calidad. Edición Hewlett Packard, Calpena AC, Escribano E, Fernández C. Validación de los métodos analíticos. Farm Clin 1991;7(9): Recibido: 24 de noviembre de Aprobado: 31 de enero de Lic. Miriam Díaz de Armas. Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay". Infanta No. 1162, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana, Cuba. 112