MANUAL PARA LA PRODUCCIÓN DE HONGOS COMESTIBLES (SHIITAKE)

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1 PROYECTO CONAMA-FPA RM Utilización de desechos de podas del arbolado urbano como sustrato para la. MANUAL PARA LA PRODUCCIÓN DE HONGOS COMESTIBLES (SHIITAKE) Autores: Ricardo Silva S., Consuelo Fritz F., Juan Cubillos A., Matías Díaz C. Santiago, 2010

2 Tabla de contenidos 2 1 Tabla de contenidos Pág 1 Tabla de contenidos Introducción Biología de los hongos comestibles Antecedentes Estructura morfo-anatómica de los hongos Basidiomicetes Reproducción de los hongos Basidiomicetes Ciclo de vida natural Reproducción con fines económicos o científicos Nutrición Hongos comestibles Requerimientos físico-químicos Taxonomía de los hongos comestibles Caracterización del hongo comestible Lentinus edodes (Shiitake) Técnicas de cultivo Tipos de sustrato Sustratos naturales Sustratos artificiales Producción de hongos comestibles Obtención de la semilla Selección y preparación del sustrato Siembra o inoculación del sustrato Colonización o incubación del sustrato Inducción de la fructificación Fructificación Cosecha y envasado Enfermedades y plagas Mirada empresarial: mercado e inversión Mercado Inversión Equipamiento Costos de inversión en invernadero del proyecto Fuentes de financiamiento Bibliografía Glosario... 38

3 Introducción 3 2 Introducción Este curso corresponde a una de las actividades comprometidas en el proyecto CONAMA-FPA RM La información general del proyecto se indica en el Cuadro 1 Cuadro 1. Información general del proyecto. Utilización de desechos de podas del arbolado urbano como sustrato Nombre del proyecto para la producción de hongos comestibles (Shiitake) en la comuna de La Pintana Organismo ejecutor Facultad de Ciencias Forestales y de la Conservación de la Naturaleza, Universidad de Chile Organismo asociado DIGA (Dirección de Gestión Ambiental, La Pintana) Financiamiento CONAMA-FPA Período de ejecución Mayo a Diciembre de 2010 Problemas ambientales a solucionar. Producto de las intervenciones de mantenimiento del arbolado urbano y recolección de residuos dispuestos ilegalmente en la vía pública, en la DIGA se extraen en promedio 200 m 3 /mes de biomasa vegetal arbórea. Gracias a sus programas de reciclaje, cerca del 60% son reutilizados, sin embargo, un 40% del total extraído no se utiliza, debiendo ser dispuesto en reducidas canchas de acopio, las cuales no darán abasto en un futuro cercano. Éstos deberán ser trasladados a un relleno sanitario, lo que conlleva un costo económico y un potencial aumento de las emisiones por la utilización de transporte y maquinaria. La acumulación de esta biomasa, tanto en la DIGA como en la vía pública, genera contaminación (visual, aire, agua y suelo), proliferación de vectores (roedores, perros, gatos e insectos), con los subyacentes riesgos a la salud, pérdida de funcionalidad del espacio, devaluación del entorno y estigmatización de la población. Objetivos específicos del proyecto. Disminuir la biomasa disponible en la DIGA, a través de su utilización como sustrato para la producción de Shiitake. Sensibilizar a la población sobre los problemas y riesgos asociados a la mala disposición de residuos sólidos, e incentivar la reutilización de residuos lignocelulósicos como sustrato para la producción de hongos comestibles. Generar y difundir un modelo productivo sostenible que sea replicado por los sectores más vulnerables y cooperativas agrícolas de la comuna, potenciando de esta forma el emprendimiento local en el sector agro-forestal.

4 Introducción 4 Situación de los hongos comestibles y del Shiitake. El cultivo de hongos comestibles ha significado fuente de alimentos, desarrollo agrícola y formación de agroindustrias en muchos lugares del mundo. En países asiáticos, estas producciones son manejadas por pequeños agricultores mediante el reciclaje de sus residuos vegetales y aprovechando la alta demanda de mano de obra que requiere esta actividad. Chile se ha perfilado como uno de los mayores exportadores mundiales de hongos silvestres, sólo superado por China, Rusia y Polonia. Esta actividad entrega retornos superiores a los 50 millones de dólares cada año, siendo, sin lugar a dudas, la actividad más importante relacionada con la explotación, procesamiento y comercialización de Productos Forestales No Madereros (PFNM) en Chile. Se estima que en esta actividad participan directamente unas 40 mil personas entre las provincias de Valparaíso y Magallanes, las que se dedican directamente a la recolección y/o procesamiento, y más de 35 empresas exportadoras concentradas entre la VII y X Región del país. Incluso existen localidades que sólo se dedican a esta actividad durante el otoño e invierno, como por ejemplo la comuna de Empedrado (VII Región), que es considerada la capital de la recolección de hongos silvestres de Sudamérica (Cisterna, 2003). El hongo Shiitake (Lentinus edodes (Berk) Sing.), pertenece a la familia Tricholomataceae y es originario de Asia, donde Japón y China concentran la mayor producción silvestre de esta seta. Se comercializa para consumo humano de las siguientes formas: hongo fresco, deshidratado, conservas, paté, yogurt, vino, galletas y té, por mencionar algunas (Cisterna, 2003). La producción de Shiitake ha experimentado varias etapas en el mercado local, pasando de una sobreproducción en los años , a una demanda insatisfecha durante los años 2006 y La mayor demanda está orientada al producto fresco y deshidratado, ya que el desarrollo de productos con mayor valor agregado es aún muy incipiente, aunque con perspectivas en el mercado Europeo.

5 Biología de los hongos comestibles 5 3 Biología de los hongos comestibles 3.1 Antecedentes Los hongos son definidos como macrofungos con un cuerpo fructífero distintivo que puede ser tanto epigeo como hipógeo (Mushworld, 2005). Constituyen un grupo diverso de organismos unicelulares o pluricelulares que se alimentan mediante la absorción directa de nutrientes. Los alimentos se disuelven mediante enzimas que secretan los hongos; después se absorben a través de la fina pared de la célula y se distribuyen por difusión simple en el protoplasma. Los hongos, junto con las bacterias heterótrofas y un reducido grupo de otros organismos, constituyen los descomponedores de la biósfera, y su actividad es esencial para el continuo funcionamiento de la naturaleza. La descomposición libera dióxido de carbono (CO 2 ) y aporta compuestos nitrogenados y otros minerales al suelo, en donde ellos pueden ser nuevamente utilizados por las plantas y eventualmente por los animales. Los hongos, equipados con un poderoso arsenal de enzimas que degradan los compuestos orgánicos, muchas veces constituyen organismos dañinos para el hombre. Atacan madera, ropa, pintura, plumas, pelos, y de hecho casi cualquier sustancia. Pueden crecer sobre pan, vegetales, carne y otros productos. Algunos producen toxinas altamente venenosas. Por otra parte, muchos hongos son valiosos desde el punto de vista comercial, por ejemplo las levaduras, que son utilizadas para producir sustancias como el etanol y el dióxido de carbono. Otros son de interés como fuentes de antibióticos, incluyendo la penicilina, además de sus potenciales usos como fuente de proteínas. Cabe señalar su importancia en la asociación que presentan con otros organismos, por ejemplo las asociaciones existentes entre los hongos y las raíces de las plantas (micorrizas), las que juegan un rol fundamental en la nutrición y distribución de muchas especies vegetales. Por otro lado, están los hongos patógenos, quienes constituyen la principal causa de las enfermedades de las plantas. Cerca de especies de hongos atacan cultivos comerciales, como también a la mayoría de las especies silvestres. Han sido descritas aproximadamente especies de hongos, y se estima que más de aún esperan ser descubiertas. Los hongos no tienen una directa conexión evolutiva con las plantas y aparentemente derivaron de un grupo distinto de células eucariontes. Los hongos figuraban en las antiguas clasificaciones como una división del reino Plantas (Plantae). Se pensaba que eran plantas carentes de tallos y de hojas que, en el trascurso de su transformación en organismos capaces de absorber su alimento, habían perdido la clorofila, y con ello, su capacidad para realizar la fotosíntesis. Sin embargo, actualmente se le considera un grupo completamente separado que evolucionó a partir de microorganismos flagelados sin pigmentos. Existen numerosas diferencias entre plantas y hongos, tanto a nivel macroscópico como celular. Los hongos carecen de clorofila y de tejidos vasculares especializados. Son organismos eucarióticos y su nutrición es heterótrofa, es decir, no pueden sintetizar su propio alimento como las plantas (autótrofas). Al microscopio aparecen diversas diferencias a escala celular entre hongos y plantas, como por ejemplo la presencia en los hongos de una membrana celular compuesta de quitina (en los vegetales está principalmente compuesta de celulosa, no de quitina que es propia de las células animales), la utilización de glucógeno en vez de almidón como sustancia de reserva (también aquí se parecen más a los animales que a las plantas), o la existencia de varios núcleos de distintas polaridades en su ciclo reproductivo (esta característica los separa definitivamente tanto de las plantas como de los animales).

6 Biología de los hongos comestibles 6 Aunque existe una importante discrepancia en la clasificación de este reino, generalmente se le clasifica en tres órdenes: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota. Estos dos últimos son considerados hongos superiores, mientras que el primero agrupa a los hongos inferiores. La clasificación se basa en las diferencias en sus estructuras reproductivas. Los Zygomycota poseen zygoesporas como esporas de reproducción sexual (cigotos con una gruesa pared celular y sin asociación a un oogonio); los Ascomycota producen ascoesporas, dentro de una estructura especial denominada ascos, mientras que los Basiomycota producen basidioesporas en un basidio. En el Cuadro 2 se entrega una clasificación más detallada del reino Fungi. Cuadro 2. Clasificación del reino Fungi. Subdivisión Estructura reproductiva Especies Ascomicota Ascoesporas, Ascos (estructuras reproductores en forma de saco) Desde levaduras a hongos de sombrero grandes, digüeñes. Zigomicota Zigoesporas Mohos del pan, fruta, etc, hongos micorrizicos y descomponedores de suelo Basidiomicota Basidioesporas, basidio Hongos superiores, setas y hongos en forma de repisa. Shiitake. Chitridiomicota Oosporas y zoosporas Hongos primitivos, chitridios (mohos acuáticos) Deuteromicota Hongos de reproducción asexual Oídios, conidios En atención a que la subdivisión basidiomicete agrupa a la mayor parte de los hongos comestibles, incluido el Shiitake, en los párrafos siguientes se caracterizará a este grupo. 3.2 Estructura morfo-anatómica de los hongos Basidiomicetes. En general, la estructura típica de los hongos basidiomicetes es la presentada en la Figura 1, aunque no todas están siempre presentes, sino que dependen de la especie de hongo comestible. El conjunto de estas estructuras se denomina carpóforo, cuerpo fructífero o seta. Figura 1. Estructura típica de un hongo basidiomicete.

7 Biología de los hongos comestibles 7 Himenio Es la parte normalmente situada bajo el sombrero, que puede tomar distintas formas: láminas, tubos, aguijones, pliegues y poros, y cuya función principal es crear, desarrollar, almacenar y dispersar las esporas que generaran un nuevo ciclo en la formación de una nueva seta. Su color es de importancia fundamental al depositarse sobre él las esporas maduras, que en grandes aglomerados, son las responsables de proporcionar los distintos colores, por los que posteriormente podrán ser clasificadas las setas de manera macroscópica. Láminas. Cuando el himenio está formado por láminas, estas proporcionan una gran superficie bajo el sombrero que permite desarrollar y liberar enormes cantidades de esporas. Es muy importante su disposición con respecto al pie a la hora de intentar clasificar una seta. Así tenemos disposición adnada, libre, distante, escotada, decurrente, etc, de acuerdo a cómo están adheridas a la superficie del pie. Otra de las características importantes de las láminas, es la separación que se puede dar entre ellas. Se pueden diferenciar fundamentalmente por estar muy apretadas, separadas o muy separadas, anastomosadas (cuando tienden a interconectarse entre ellas), o incluso bifurcadas, en forma de hoz, conforme se aproximan a los bordes del sombrero. Los bordes inferiores de las láminas también sirven como carácter morfológico diferenciador, y pueden ser lisos, aserrados, ventrudos, sinuosos, redondeados, agudos, finos, gruesos, etc. Las láminas pueden ser todas iguales o tener otros tipos de láminas intercaladas entre ellas. En este caso, sus tamaños son diferentes y reciben el nombre de laminillas (más pequeñas que las láminas), y lamélulas cuando su desarrollo es incipiente y aparentan un amago de láminas. Por supuesto, estas características tienden a proporcionar mayor información en el reconocimiento visual de las setas y permiten contar con un nuevo criterio diferenciador entre las especies o géneros. Los poros y los tubos. Los poros son las partes o extremidades abiertas de los tubos que constituyen el himenio de los Boletos y las Poliporáceas (setas sin láminas). Normalmente, los tubos están situados bajo el sombrero y forman paquetes cilíndricos dentro de los cuales están las esporas. Los tubos y los poros pueden tomar diferentes colores. El empaquetado de los tubos genera una superficie porosa en forma esponjosa, donde la coloración de los poros en esta masa es una característica fundamental al clasificar este tipo de setas. La presión sobre los mismos puede generar cambios en la tonalidad de los poros y supone una información adicional muy valiosa para diferenciar especies y géneros de este tipo de setas. También, tanto el tamaño de los poros como la geometría de los mismos, que puede ser poligonal, alargada, circular e incluso con aspecto laminar entrelazado, es un carácter muy importante para su clasificación. En el caso de los tubos su coloración también es un carácter importante junto con la profundidad de los mismos, si bien este carácter puede variar en función de la madurez de la seta. Los pliegues y aguijones. Estos himenios están presentes en mucho menor número que en el caso de láminas y poros, aunque, este tipo de himenios tiene la función principal de aumentar el área superficial del cuerpo fructífero, y permiten una identificación fácil de las setas. Píleo o sombrero Situado sobre el pie, ejerce la función de protección en la formación y desarrollo de las esporas. Una característica importante que permite diferenciar a las setas por el sombrero es que puede tomar diferentes aspectos, formas y colores. Algunas de las formas son: convexa, deprimida, cónica,

8 Biología de los hongos comestibles 8 mamelonada, cilíndrica, infundibiliforme, hemisférica, extendida, embudada, etc. Cuando se estudia el sombrero es importante tener en cuenta, además, la cutícula, el margen o borde y la carne. La cutícula ejerce la función de proteger la superficie del sombrero. Su principal característica es el color, que es proporcionado por las distintas pigmentaciones que puede adquirir, si bien estas pueden variar en función de las condiciones climatológicas y del grado de crecimiento de la seta. La ornamentación de la cutícula puede tomar formas significativas, donde las más comunes suelen ser de tipo lisa, cuarteada, fibrilosa, escamosa, mechosa, con placas, flocosa, glabra, etc, cubriendo total o parcialmente la superficie. El margen o borde toma diferentes formas, lo que a su vez permite diferenciar las setas por esta importante característica. Puede ser estriado, liso, festoneado, acanalado, apendiculado, lobulado u ondulado, enrollado, lanoso, con restos de cortina y con restos de anillo. Los aspectos antes mencionados pueden cambiar durante el desarrollo de la seta. La carne va a proporcionar a los especímenes aspectos carnoso y frágil, y su corte, al tener contacto con el aire o por ataque de reactivos específicos, permitirá observar posibles variaciones en su color, lo que servirá como criterio de identificación significativo. Estípite o pie Actúa como sujeción del himenio y del sombrero, aunque hay setas que pueden no tener pie o estar el mismo atrofiado; en este caso se dice que tienen aspecto sésil. Son numerosas las diferentes formas que puede adquirir el pie: delgado, atenuado, cilíndrico, grueso, en forma de mazo, sinuoso, radicante, bulboso, hinchado, etc. Su color y tamaño también sirven como criterio diferenciador junto con el aspecto de su superficie, el que puede ser liso, estriado, punteado, leonado, venoso, escamoso, escrobiculado, reticulado, etc, y si se parte o no fácilmente, si está hueco o macizo, etc. Volva La volva es un fragmento en forma de membrana procedente del velo general que envuelve la base del pie en algunas setas. Es característico en los géneros Amanita y Volvaria, y en ocasiones puede desaparecer cuando la seta está madura o puede pasar desapercibida, ya que normalmente está enterrada. Su forma puede ser clave para clasificar especies dentro del género. La forma de la volva puede ser abierta, circuncisa, saciforme, friable, membranosa, etc. Anillo o cortina El anillo es un resto de membrana que procede de la rotura del velo parcial interno que tienen algunas de las setas, que al crecer se deposita en la parte superior del pie generando esta forma anular. Puede tomar diversas formas: aplicado, ascendente, descendente, en rueda, doble, estriado, cortiniforme, etc. La cortina está formada por una masa de fibrillas muy finas que dan lugar a una especie de velo que recubre y protege al himenio. Durante la fase de crecimiento de la seta es fácil de apreciar, tiende a desprenderse y puede desaparecer rápidamente o quedar depositado parcialmente sobre el propio pie. Es una característica del género Cortinarius que le da el nombre.

9 Biología de los hongos comestibles Reproducción de los hongos Basidiomicetes Ciclo de vida natural Los hongos se reproducen sobre todo por medio de esporas, las cuales se dispersan en un estado latente, que se interrumpe sólo cuando se hallan condiciones favorables para su germinación. Cuando estas condiciones se dan, la espora germina, surgiendo de ella una primera hifa. Las hifas crecen por alargamiento de las puntas y también por ramificación. La proliferación de hifas resultante de este crecimiento se llama micelio. Cuando el micelio se desarrolla puede llegar a formar grandes cuerpos fructíferos o carpóforos. El micelio puede clasificarse según su función en micelio vegetativo, si se encarga de la nutrición, y en micelio reproductivo, si su función es la de formar órganos de reproducción y multiplicación. En los hongos parásitos el micelio puede crecer en la superficie del huésped (micelio exógeno), o bien dentro del huésped (micelio endógeno). Por ejemplo, los oidios se caracterizan por presentar un micelio exógeno, que puede visualizarse sobre el huésped como una delgada capa algodonosa o aterciopelada generalmente de color blanco. En este caso, el micelio, tanto vegetativo como el reproductivo, crece en la superficie y sólo pequeñas prolongaciones hifales penetran en el huésped, extrayendo de éste las sustancias alimenticias necesarias para el crecimiento y reproducción del hongo. Tales prolongaciones se conocen como haustorios. Las esporas de los hongos se producen en esporangios, ya sea asexualmente o como resultado de un proceso de reproducción sexual. Cuando estos esporangios han madurado sueltan las esporas en un número tan grande que puede llegar a ser de miles de millones, de las cuales solo unas pocas llegaran a desarrollarse. En este último caso la producción de esporas es precedida por la meiosis de las células, de la cual se originan las esporas mismas. Las esporas producidas a continuación de la meiosis se denominan meiosporas. Como la misma especie del hongo es capaz de reproducirse tanto asexual como sexualmente, las meiosporas tienen una capacidad de resistencia que les permite sobrevivir en las condiciones más adversas, mientras que las esporas producidas asexualmente cumplen sobre todo con el objetivo de propagar el hongo con la máxima rapidez y con la mayor extensión posible. Las esporas, que se esparcen a través del aire, del agua o de los excrementos que evacuan los animales que las han comido (lugar extremadamente propicio para desarrollar un micelio), pueden permanecer inactivas durante varios años, hasta que encuentran el momento propicio para germinar. Cuando llega este momento, lo harán formando el micelio. Las setas solamente se reproducen cuando las condiciones de temperatura y humedad son las ideales. En la Figura 2 se presenta un esquema de la estructura típica de un basidiomicete con un detalle de los basidios.

10 Biología de los hongos comestibles 10 Figura 2. Esquema representativo de la estructura de un Basidiomicete. En la Figura 3 se muestran las etapas de crecimiento de un basidiomicete. Figura 3. Etapas de crecimiento de un basidiomicete.

11 Biología de los hongos comestibles Reproducción con fines económicos o científicos El cultivo de los hongos se llama micocultura, y se practica por su interés económico o científico. Para asegurar la conservación, desarrollo y utilización de los hongos en condiciones de laboratorio, se deben utilizar medios de cultivo apropiados. Los medios de cultivo corresponden a un conjunto de sustancias que garantizan a un microorganismo los nutrientes necesarios para su conservación, crecimiento y desarrollo. Contienen una base mineral (Ca, Mg, etc), fuente de carbono, de nitrógeno y los requerimientos físico-químicos adecuados dependiendo del tipo de microorganismo a desarrollar. En el Cuadro 3 se muestra una clasificación de los medios de cultivo según tres criterios. Cuadro 3. Clasificación de los medios de cultivo. Según su utilización Según su composición Según estado físico Medios para aislamiento; Medios para crecimiento; Medios de identificación; Medios de mantenimiento de cepas Medios naturales; Medios semi-sintéticos; Medios sintéticos (sustancias químicas puras.) Sólidos (agar > 1,5%, aislamiento, purificación y visualización de colonias); Semisólidos; Líquidos (caldos, no contienen agar, tienen una fuente de carbono, nitrógeno y sales minerales, se utilizan en obtención de enzimas y propagación de inóculos) 3.4 Nutrición Los hongos, organismos heterótrofos, dependen de materia orgánica elaborada para poder sobrevivir. Esta materia orgánica la pueden obtener de tres formas, distinguiéndose tres grupos principales: 1. Hongos Parásitos: se alojan sobre algún ser vivo que los hospede, viviendo a expensas de éste sin ofrecerle ningún beneficio a cambio. Los hongos parásitos pueden producir daños de muy diversa consideración, desde pasar inadvertidos por completo para el huésped hasta causarle enfermedades graves o incluso la muerte. Pueden parasitar plantas, animales (incluido el hombre), o incluso a otros hongos. Entre estos encontramos a los hongos fitopatógenos, que causan enfermedades a plantas cultivadas, y los hongos dermatógenos, que causan enfermedades en la piel humana, entre otros subgrupos. Dentro de los primeros encontramos a las Royas, Tizones, Botrytis, los Dihueñes (Cyttaria spp.), y entre los segundos se incluye a Trichophyton y Candida, entre muchos otros (Cisterna, 2003). 2. Hongos Simbiontes: viven en simbiosis con alguna especie vegetal (normalmente árboles), obteniendo ambos un beneficio mutuo. Entre éstos encontramos a los micobiontes, que forman parte de los Líquenes, y a las Micorrizas, las que viven rodeando las partes más finas de las raíces de los árboles, envolviéndolas y alimentándose de sustancias que éstas segregan llamadas exudados radiculares. Estos exudados radiculares aportan al hongo los glúcidos que necesita para vivir. 3. Hongos Saprófitos (o saprobios): viven sobre materia orgánica en descomposición, es decir sobre materia muerta (restos orgánicos de la descomposición de plantas y animales que contiene el suelo, partes muertas de la madera de un árbol, excrementos de animales). Este grupo es muy importante en los ciclos de la mayoría de los macroelementos y sustancias indispensables para la

12 Biología de los hongos comestibles 12 vida. Entre ellos encontramos a todos los hongos que degradan el complejo lignocelulósico que forma parte de la pared de los vegetales. Básicamente existen dos subgrupos de hongos saprófitos: los Degradadores Primarios, que corresponde a los hongos colonizadores y que inician el proceso de degradación, y los Degradadores Secundarios, que sólo pueden acceder a sustancias orgánicas más simples y que han sido pre-degradadas por los Degradadores Primarios (Cisterna, 2003). 3.5 Hongos comestibles Cómo saber si un hongo es comestible? No existe una regla general para separar los hongos comestibles de aquellos que no lo son, sólo algunos mitos referentes a tratamientos adecuados para saber si un hongo se puede comer, sin embargo, nada de esto es cierto. Las diferencias entre los hongos comestibles y los venenosos se encuentran muy bien marcadas y son fáciles de detectar, lo único que se requiere es consultar a una persona especializada y con experiencia. Generalmente, los conocimientos se transmiten de ancianos a jóvenes en las zonas rurales. En el medio rural, una persona, al colectar un hongo, le observa todas las características de forma, color, olor y sabor, de manera que pueda reconocer si se trata de un hongo comestible o no (García, 2003). De los tres grandes grupos explicados anteriormente, sólo los últimos (saprófitos) y algunas micorrizas pueden ser cultivados bajo ambiente controlado, ya que al ser independientes de otros seres vivos sólo basta desarrollar un sustrato lignocelulósico determinado y entregar las condiciones de temperatura, ventilación, humedad y luz adecuadas para lograr que estos hongos crezcan y fructifiquen. Si es un Degradador Primario se puede utilizar como sustrato varios tipos de desechos agroforestales frescos, como pajas de cereales o aserrines y virutas. Si se trata de un Degradador Secundario, el sustrato pueden ser los mismos tipos de desechos anteriormente indicados, pero con un proceso de compostaje previo. Entre los hongos cultivados que pertenecen al grupo de los Degradadores Primarios encontramos al Hongo Ostra (Pleurotus ostreatus) y al Shiitake (Lentinus edodes), entre muchos otros. A todos estos hongos se les conoce con el nombre de Hongos Exóticos y abarcan cerca de 60 especies diferentes. Dentro de los hongos cultivados que pertenecen al grupo de los Degradadores Secundarios encontramos al Champiñon Común o de Paris (Agaricus bisporus), y, en general, a todas las especies del género Agaricus, muy comunes en los supermercados. También encontramos al Coprinus comatus, especie muy apetecida por su agradable sabor. Todos estos hongos se cultivan sobre compost preparado en base a pajas de cereales y estiércol de caballo o gallina. Los hongos saprófitos que se cultivan se caracterizan por producir uno o más tipos diferentes de degradación del sustrato natural o artificial donde crecen. Esta degradación la producen gracias a una batería particular de enzimas. Dependiendo de las enzimas involucradas en el proceso de pudrición, estos hongos pueden ser Lignívoros, si degradan la Lignina a través de enzimas llamadas genéricamente Ligninasas, ocasionando una pudrición del tipo Blanca, o pueden ser Celulolíticos, si degradan Celulosa con la ayuda de un conjunto de enzimas conocidas como Celulasas, ocasionando una pudrición del tipo Café Requerimientos físico-químicos Un factor importante para asegurar el crecimiento y desarrollo de los hongos es la provisión de un medio ambiente adecuado para su crecimiento, tanto vegetativo como reproductivo. Al no tener piel, los hongos son fácilmente afectados por las condiciones de crecimiento, por lo tanto, puede decirse

13 Biología de los hongos comestibles 13 que el éxito o fracaso del cultivo depende del control de las condiciones de crecimiento por parte del fungicultor. Los factores ambientales que afectan el cultivo incluyen la temperatura, humedad, ph, luminosidad, oxígeno y ventilación. Para asegurar el crecimiento y desarrollo de los hongos es necesario considerar las siguientes variables y sus rangos óptimos: Temperatura: son organismos mesófilos (10 a 40 C), con una temperatura óptima de crecimiento entre 20 y 30 C. El micelio puede sobrevivir entre 4 y 40 C, dependiendo de la especie. Humedad: la humedad adecuada para su desarrollo se encuentra entre 30% y 80%. ph: en contraste con las bacterias, los hongos prefieren un medio ácido para su crecimiento, en un rango de ph de 4 a 7, siendo el óptimo un ph entre 5,5 y 6. Luminosidad: durante la etapa de colonización del sustrato se debe trabajar bajo completa oscuridad, sin embargo, durante la fructificación es necesario alternar los períodos de luz y oscuridad. Oxígeno: como la mayoría de los hongos son organismos aerobios, su respiración se produce cuando existe presencia de oxígeno. Ventilación o aireación: siendo organismos aerobios, los hongos necesitan de aire fresco durante su crecimiento, pero requieren más ventilación durante la etapa de fructificación Taxonomía de los hongos comestibles De acuerdo con los criterios taxonómicos tradicionales, donde las características son muy variables, los determinantes para la identificación de un hongo son: 1. El color: Existen hongos de coloración roja, rosácea, café, blancas, etc. Es una característica de suma importancia para la identificación de hongos, ya que es un auxiliar para diferenciar especies. 2. El píleo o sombrero: Puede encontrarse gran variedad de formas como: de embudo, campanudo, plano, convexo, cilíndrico, giboso, etc. También existen variaciones sobre los márgenes, que pueden ser dentados, enrollados, levantados etc. La textura de píleo puede presentar sensación de humedad, ser mucilaginoso, aceitoso, sedoso, puede tener escamas, vellosidades, estrías, pueden ser brillantes u ornamentados (cavidades, grietas, arrugas, espinas, etc.). 3. El estípite o pie: Algunos hongos pueden o no tener estípite. Cuando lo tienen puede estar ubicado justo abajo del centro del píleo, de manera lateral o excéntrica, y puede presentar rizoides. La forma y la textura del estípite varia, pudiendo ser bulboso, redondo, torcido, rígido, liso, quebradizo, leñoso, flexible, correoso, etc. 4. La presencia y forma de la volva, en la base del estípite, o de un anillo en la parte superior del mismo, depende de la especie. 5. Las estructuras que forman el himenio. Las láminas varían en su forma, tamaño, densidad y su unión con el estípite. La presencia de dientes y poros es variable en las diferentes especies.

14 Biología de los hongos comestibles El olor y sabor del hongo: Estas características son de importancia secundaria, sin embargo, ayudan a la confirmación de algunas especies; el olor puede ser de hongo, imperceptible, nauseabundo, a madera, a harina, etc. 3.6 Caracterización del hongo comestible Lentinus edodes (Shiitake) El nombre Shiitake es tomado del idioma Japonés, siendo Shii un tipo de árbol donde crece naturalmente y take que significa hongo. También se le conoce como hongo negro del bosque y Shiang-gu (del chino, hongo con fragancia). Este hongo se caracteriza por crecer en troncos, por no tener anillo ni volva y por su consistencia subcarnosa; es de color café pardusco o color cuero (García, 2003). Crece de forma silvestre sobre residuos de lignina y celulosa, como la que contienen la madera y sus derivados, y distintos tipos de bagazo, como el de caña de azúcar, y residuos agrícolas. El píleo o sombrero mide entre 5 y 20 cm de ancho, es convexo o casi plano con una superficie seca y fibrosa apresada, cutícula rompiéndose en escamas de diversos tamaños y formas, textura blanda de color claro y pardo rojizo oscuro. Tonalidad clara o parda cerca de la cutícula, firme, correosa carnosa en estado adulto y suave en especímenes inmaduros; sabor agrio, olor ligero pero no característico. Láminas blancas o pálidas tornándose pardo rojizas y algunas veces manchadas por la edad; a veces con un tono avellanado y moderadamente anchas, bordes detalladamente cerrados a dentados (García, 2003) El estípite o pie mide de 3 a 5 cm de largo y de 8 a 13 mm de grosor, casi igual o ensanchado hacia abajo, sólido y correoso, de superficie delgada envainada por un velo delgado, que termina en la zona apical conforme la cortina se rompe; cortina hialina o pardusca (García, 2003). Las esporas miden 5,5 a 6,5 por 3 a 3,5 mm, de forma subcilíndricas no amiloides, lisas de pared delgada. Basidios tetrasporados, pleurocistidios ninguno, trama laminar entre tejidos y no claramente distintas del contexto, conexiones en grapa presentes (García, 2003). La fructificación natural de este hongo ocurre generalmente durante todo el año si las condiciones climáticas son favorables, pero de preferencia suele ocurrir en los meses de otoño y primavera. Sin embargo, si el cultivo se realiza en invernadero con condiciones controladas, la fructificación puede ocurrir en cualquier época del año. Propiedades y valor nutricional. Desde tiempos remotos los hongos han sido tratados como un tipo especial de alimento. Los griegos creían que proporcionaban fuerza en las batallas, los faraones los apreciaban como una delicadeza, los romanos y los aztecas los consideraban como el alimento de los dioses y los chinos los apreciaban como un alimento saludable. El consumo de Shiitake tiene efectos benéficos para el ser humano. Algunas de las propiedades medicinales de este hongo comestible son: Anti-cáncer: Este tipo de hongo posee lentinan, que es un agente anti-cancer. Anti oxidante: posee vitaminas A, E, C, y selenio. Anti-infecciones: Shiitake estimula la producción en el organismo de interferón, el cual tiene efectos anti-virus.

15 Biología de los hongos comestibles 15 Hormona del crecimiento: limita algunos de los factores que causan envejecimiento en el ser humano. Reducción del colesterol: Esto es gracias a la eritadenina y también a la parte fibrosa de hongos que tienen quitina, sus propiedades son aumentadas por la lentinan. Reducción de presión arterial. Prevención de la trombosis: Investigadores de Bangkok y Hawaii han demostrado experimentalmente que Shiitake previene la trombosis en las arterias coronarias. Disminución de la viscosidad de la sangre. Bajo nivel de azúcar en la sangre: Los niveles bajos de hidratos de carbono y la lisina previenen la formación de azúcar en la sangre El Shiitake es bajo en calorías, alto en proteínas, hierro, fibra, minerales y vitaminas. Contiene vitaminas B1, B2, B6, B12 y D2, con altas cantidades de riboflavina y niacina. Definitivamente un alimento excelente con propiedades medicinales. El consumo de este hongo es una buena forma de prevenir las enfermedades y de tener buena salud, se cree que puede aumentar la longevidad y que posee propiedades afrodisiacas. En el Cuadro 4 se describen los compuestos que presenta el hongo Shiitake y su acción benéfica sobre la salud humana. Cuadro 4. Composición del hongo Shiitake. Compuesto Lentinan Eritadenina Interferon Ergosterol Formación de prostaglandina Anti-oxidantes Aminoácidos Descripción Es un extracto de azúcar y ha sido usado experimentalmente en seres humanos y en animales con resultados anti-cancerígenos: cáncer intestinal, cáncer de estómago, cáncer de ovarios etc. Entre los efectos contra el cáncer de la lentinan hay que destacar la estimulación de la producción de linfocitos y el control de células muertas en las infecciones cancerosas. Extraída en 1971, reduce la tasa de colesterol en las personas; también se ha experimentado en animales con resultados positivos. Los experimentos realizados muestran un disminución entre el 5% y un 10% de la tasa de colesterol después comer Shiitake. Esta es una sustancia química que hace a las células inmunes a infecciones víricas mostrando que las setas Shiitake contienen el inductor de interferon, Interferon Gamma, el cual es usado para tratamientos contra el cáncer y como anti vírico, anti-inflamatorio para el tratamiento de la hepatitis B y C. Convertido en vitamina D cuando se expone a los rayos ultravioletas sólo se encuentran en los hongos Shiitake secas. La vitamina D es necesaria para la absorción de calcio y fósforo y con efectos positivos en el tratamiento del cáncer de colon. El ácido linoleico que esta presente de los hongos Shiitake es transformado en el cuerpo en diferentes tipos de prostaglandina. Estas fueron extraídas del semen y sé penso que eran excretadas por la próstata, pero ahora se sabe que son producidas por muchos tejidos del cuerpo. La prostaglandina E1 es empleada para provocar erecciones en los hombres, por inyección intromuscular. Lentinan estimula la producción de linfocitos T, de los que se ha demostrado que estimula la producción de prostaglandina. Investigaciones húngaras han demostrado que una de las enzimas, que contienen los hongos Shiitake, Superoxido Dismutasa, decrementa la peroxidacion de lipidos. Este es un factor importante en la prevención de la enfermedades y cáncer de arteria coronaria y es una de las teorías de la causas de la longevidad La glutamina es el aminoácido de más alta concentración en los Shiitake. Las concentraciones de glutamina muscular decrecen en un 50% después de una operación, de forma que su reemplazo se puede prevenir. La arguinina es otro aminoácido presente en los Shiitake, ésta estimula los linfocitos T y además previene la pérdida de nitrógeno tras una operación. La inflamación provoca un aumento de las necesidades corporales de glicina, serina, metionina y cisteina. Todas estos son aminoácidos que se encuentran en las setas Shiitake.

16 Biología de los hongos comestibles 16 Zinc Se describió un síndrome caracterizado por niveles bajos de zinc en plasma y la incapacidad de los órganos genitales para madurar en la pubertad. Investigaciones en Finlandia han demostrado que la adición de zinc aumenta los niveles de testosterona en plasma y la cantidad de esperma. También se ha demostrado, que los pacientes de sexo masculino en diálisis con problemas de uretra, mejoran su vida sexual cuando se añade zinc al fluido de la dialisis. El zinc está presente en estos hongos. Enzimas Se ha descrito una lista de 37 enzimas que se encuentran en estos hongos, existiendo hasta cerca de 50 enzimas localizadas en los hongos Shiitake. Estas incluyen celulosa, enzimas digestivos y asparaginasa. Esta última es utilizada en el tratamiento de algunas leucemias infantiles. El rápido crecimiento del hongo Shiitake, la cual dobla el tamaño durante la noche es evidencia de la gran cantidad de actividad enzimática que da lugar. Quitina El 80% de la fibra en Shiitake consiste en la quitina. Se ha demostrado en Japón que reduce el nivel de colesterol en sangre en seres humanos. Fuente: García, 2003.

17 Técnicas de cultivo Técnicas de cultivo. 4.1 Tipos de sustrato El hongo Shiitake, y en general cualquier hongo comestible, se puede cultivar básicamente sobre dos tipos de sustrato: naturales y artificiales Sustratos naturales Estos sustratos corresponden principalmente a troncos y ramas en los que el hongo es inoculado directamente, sin realizarse ningún tipo de tratamiento de esterilización. Esto se puede realizar sin problemas porque durante la incubación y fructificación el cultivo se realiza manteniendo la corteza de los propios troncos, la que constituye una barrera física y química muy efectiva contra la invasión de hongos contaminantes. A pesar de lo anterior, muchos troncos se contaminan por los cortes (en la superficie transversal), sin embargo, estas contaminaciones se consideran tolerables en el cultivo, siendo posibles de controlar con el uso de desinfectantes adecuados, como el agua oxigenada Sustratos artificiales Son, por lo general, una mezcla de distintas sustancias orgánicas e inorgánicas sobre una matriz de material lignocelulósico, que en conjunto o por separado tienen un alto valor nutritivo para un gran número de microorganismos y que, además, son sustancias relativamente simples a las cuales estos microorganismos pueden acceder sin dificultad. Si estos sustratos son inoculados directamente sin que sean sometidos a un tratamiento térmico previo (esterilización), lo más probable es que los microorganismos que se encuentran naturalmente en ellos, terminen invadiendo la totalidad del sustrato de cultivo a una velocidad de crecimiento mayor que el hongo que se intenta cultivar. Muchos fungicultores incautos han tratado de cultivar Pleurotus ostreatus inoculando paja de trigo humedecida y sólo han conseguido una increíble producción de trigo, malezas y una no menos sorprendente colección de mohos. Por esto, se hace indispensable someter al sustrato a un tratamiento físico o químico que elimine o disminuya la carga de microorganismos contaminantes. Este tratamiento, junto con el pool de nutrientes que posee la mezcla, convierten al sustrato en una matriz altamente selecta para el crecimiento del hongo comestible que es inoculado o sembrado en este sustrato. En términos generales, el sustrato artificial tiene una cierta relación Carbono:Nitrógeno (C:N), ph, humedad, grado de compactación, granulometría, etc, que permiten el rápido crecimiento vegetativo y reproductivo del hongo que es inoculado sobre o dentro de él y, estas propiedades más las condiciones ambientales, determinan finalmente el éxito del cultivo. Existen dos tipos de tratamientos térmicos, cada uno con ventajas y desventajas, los que son detallados más adelante. 4.2 Producción de hongos comestibles Para la producción de hongos comestibles, y en particular de Shiitake, es necesario desarrollar una serie de etapas, las que se detallan en el Cuadro 5.

18 Técnicas de cultivo. 18 Cuadro 5. Diagrama de producción de hongos comestibles. Obtención de semilla en laboratorio Selección y preparación del sustrato Inoculación Colonización Inducción Fructificación Cosecha y almacenamiento Dado que la obtención de la semilla requiere de instalaciones y condiciones relativamente complejas, esta actividad debe desarrollarse en unidades independientes que no forman parte de la unidad productora propiamente tal, siendo lo más usual adquirirla a terceros. Para el resto del proceso productivo de hongos comestibles es indispensable contar con las instalaciones adecuadas a tales efectos, siendo usual la construcción de un invernadero que posea tres zonas bien definidas: una para realizar la inoculación del sustrato, otra para la etapa de incubación o colonización y una tercera para la etapa de fructificación. En lo posible estas tres áreas deben estar aisladas unas de otras, aunque deben estar interconectadas de modo de permitir el tránsito de una a otra sólo en los casos necesarios Obtención de la semilla Se denomina semilla a la forma en que el micelio del hongo es inoculado en un sistema productivo, es decir, la semilla es el vehículo de transporte del micelio desde el medio de cultivo in vitro hasta el sustrato definitivo donde crecerá el hongo. Para la preparación de la semilla, se utilizan granos de cereal, siendo los más comúnmente empleados el trigo y sorgo, y también avena y centeno. Otra opción es usar tarugos de madera.

19 Técnicas de cultivo. 19 La secuencia para la producción masiva de semilla utilizada en el proyecto está representada en el Cuadro 6. Cuadro 6. Esquema de producción de semilla Selección de granos de cereales Preparación de tarugos de madera Lavado y remojo Envasado en frascos Cepa madre Esterilización Enfriado Multiplicación en medio de cultivo Inoculación Incubación Almacenaje Selección de granos de cereales y preparación de tarugos La selección de granos consiste en elegir aquellos que se encuentren limpios, de buena calidad, sin residuos de productos químicos o contaminados con otros hongos o insectos. Es preferible utilizar granos que provengan de siembras libres de aplicaciones de fungicidas, ya que sus residuos pueden inhibir el crecimiento del hongo. Durante el desarrollo de este proyecto se utilizaron granos de trigo y tarugos de madera. En el caso de los tarugos se recomienda emplear madera de la misma especie que la que se usará como sustrato. El tamaño del tarugo utilizado en el proyecto fue de 8-10 mm de diámetro y 2,5 cm de largo, aunque pueden utilizarse otras dimensiones. Lavado y remojo En la etapa de lavado y remojo de los granos se eliminan el polvo y otras impurezas por flotación. Esto se logra remojándolos en abundante agua y quitando las impurezas que quedan en la superficie, el procedimiento se repite las veces que sea necesario hasta que no se observen impurezas. Para el caso

20 Técnicas de cultivo. 20 de los tarugos, éstos no se lavan pero sí deben ser remojados de manera de lograr una hidratación que luego permitirá el crecimiento del hongo. Envasado en frascos Tanto los granos como los tarugos, son dispuestos en frascos de vidrio resistentes a altas temperaturas y la tapa es reemplazada por una hecha de algodón y papel, lo que permite el intercambio gaseoso y además es una barrera frente a los contaminantes externos. Esterilización La esterilización de la semilla se realiza en autoclaves a una temperatura de 121 C durante 20 a 30 minutos. Es importante destacar que esta etapa sólo debe realizarse en dichos equipos, ya que con esterilizaciones a menores temperaturas, como en ollas a presión (115 C aprox.), se corre el riesgo de que los granos o tarugos mantengan una población de microorganismos que, aunque en baja presencia, puedan colonizar rápidamente los granos o competir posteriormente con el hongo, haciendo fracasar el cultivo (France, 2000). Enfriado Concluida la esterilización, los frascos son enfriados a temperatura ambiente dejándolos dentro del equipo de esterilización o llevándolos a la sala de inoculación. Inoculación El proceso de inoculación o siembra debe hacerse, de preferencia, bajo una campana de flujo laminar desinfectada y ubicada en una sala cerrada y limpia (sala de inoculación). Otra opción, aunque más rústica, consiste en trabajar sobre una superficie desinfectada con cloro o alcohol y ayudado por mecheros. El éxito de estas opciones depende de la asepsia con que trabaje el fungicultor. La inoculación consiste en extraer desde una placa Petri un trozo del micelio del hongo (cepa madre), el cual se incubó a 25 C bajo total oscuridad (Figura 4), para luego ser introducido en los frascos esterilizados y enfriados. Figura 4. Placa Petri con el hongo in vitro.

21 Técnicas de cultivo. 21 Incubación Los frascos ya inoculados son depositados en una cámara de crecimiento a temperatura constante de 25 C, hasta que los granos o tarugos estén completamente colonizados por el hongo. Almacenaje Concluido el período de incubación, los frascos con la semilla son almacenados en un refrigerador a 5 C hasta su utilización. En la Figura 5 se observan los tipos de semilla utilizados en este proyecto. En A el hongo creció sobre tarugos de madera, mientras que en B, sobre granos de trigo. Figura 5. Tipos de semilla. En tarugos de madera (A), y en granos de trigo (B). A B Si no se dispone de un lugar apropiado para la producción de la semilla, se recomienda adquirirla a empresas dedicadas a su producción. A continuación se mencionan algunas de ellas presentes en el país: Setas del huerto, Micotec, Probical, Hongos del sur, Rayen Lemu, Agroland, Agro de Beeche, entre otras Selección y preparación del sustrato Como sustrato se puede emplear una gran variedad de residuos lignocelulósicos, entre ellos pajas de cereales y residuos agroindustriales (desechos de maíz, hojas, etc), como también subproductos de la industria maderera (aserrín, viruta) y madera sólida. En este último caso, se debe evitar especies resinosas o de alta durabilidad natural, pues pueden generar un producto de gusto fuerte y desagradable, o dificultar el crecimiento del hongo. La selección del sustrato de cultivo dependerá, principalmente, de las exigencias nutricionales del hongo, de su disponibilidad tanto temporal como geográfica y también de la tecnología que se utilice para acondicionarlo (Cisternas, 2003). El cultivo de hongos comestibles como el Shiitake es una excelente alternativa para utilizar residuos de la elaboración de productos agrícolas o madereros, permitiendo aliviar los problemas de

22 Técnicas de cultivo. 22 contaminación por depósito o quema de éstos. Además, este tipo de producción se puede realizar en recintos relativamente pequeños y adaptando bodegas en desuso, contribuyendo a la diversificación de la producción y permitiendo el aporte de una fuente de alimento y medicinal a la dieta de las personas. A continuación se describen los métodos empleados para preparar el sustrato sobre el cual crecerá el hongo comestible Bloques o bolsas Los métodos modernos de cultivo de Shiitake usan como sustrato virutas y aserrín de maderas, más un suplemento rico en nitrógeno, como el afrecho de trigo, arroz, avena, cebada, soya, etc. En nuestro país se han logrado cultivos en mezclas de virutas de robles, raulí, coihue y tepa. Otra especie interesante de utilizar es el eucalipto, con el cual también se producen hongos de buena calidad y se evita el tener que usar árboles nativos. En el caso del pino es posible utilizar su viruta, pero hasta cierta proporción y complementada con otras maderas, de modo de evitar el traspaso de olores y sabores a resina hacia los hongos. En otros países se utilizan residuos de la elaboración de productos agrícolas, tales como cascaras de café, tortas de oleaginosas, melaza, corontas de choclo, etc. Es común, además, el uso de pajas de cereales mezcladas con yeso o cal, sobre todo en fungicultores que recién se inician en el tema. En general, se puede establecer que no existe una receta única y que el fungicultor debe experimentar la producción con los recursos disponibles y que resulten más económicos. Para permitir que el hongo invada el sustrato en forma homogénea es indispensable que este tenga una densidad determinada, que no impida el intercambio gaseoso entre éste y el medio ambiente inmediato. Para lograr esto, las pajas de cereales deben ser picadas hasta lograr trozos de entre 4 y 10 cm. Luego deben ser remojadas durante 24 a 48 hrs para permitir su hidratación, alcanzando una humedad total cercana al 70%. Tiempos de remojo menores al indicado no permiten una buena hidratación debido a la resistencia natural que tienen las pajas de cereales a absorber agua (gruesa cutícula); tampoco es recomendable tiempos mayores, ya que comienza a contaminarse con mohos (Cisternas, 2003). Una práctica habitual es dejar las pajas sumergidas en estanques de agua, o colocarlas en recipientes de gran tamaño donde se les adiciona agua con la ayuda de un aspersor o simplemente con una manguera flexible. Todos los desechos agroforestales tienen una gran carga de agentes contaminantes, especialmente bacterias y hongos inferiores, lo que se debe a que estos organismos comienzan a colonizar estos sustratos para degradarlos y volver sus componentes al medio ambiente. Por lo tanto, es indispensable que los sustratos sean tratados (esterilizados o pasteurizados) previamente para eliminar estos microorganismos. Sin tratamiento lo único que se consigue es obtener una gran cantidad de gramíneas creciendo sobre un sustrato extremadamente contaminado con mohos, bacterias y larvas de insectos. Cuando se trata de pajas de cereales, existen varios tratamientos que aseguran la eliminación total o parcial de estos agentes contaminantes. A continuación se hará una breve descripción de los más utilizados en Chile. Esterilización: Con este tipo de procedimientos se obtiene lo que se llama una "desinfección total", ya que los sustratos de cultivo se someten a temperaturas cercanas a los 120 C durante 30 minutos como mínimo, siendo recomendable usar 45 minutos. Para lograr esto, se utiliza una presión de vapor

23 Técnicas de cultivo. 23 de 15 psi al interior de autoclaves, actividad que debe ser desarrollada por personal entrenado. La gran ventaja de este sistema de tratamiento térmico es que se eliminan casi por completo todos los microorganismos que pueda tener el sustrato de cultivo, disminuyendo considerablemente los riesgos de contaminación y las pérdidas de sustrato durante la etapa de incubación. Pasteurización en agua: la paja picada sin humedecer se coloca al interior de tambores que contengan agua a 80 C y se mantiene sumergida en ella durante una hora. Para asegurarse de mantener la temperatura constante se debe contar con un termómetro confiable y con una fuente de calor que permita aumentar o disminuir su intensidad. Este método evita la pérdida de nutrientes que se produce cuando se utiliza agua hirviendo (esterilización), sin embargo, no elimina por completo las esporas de hongos competidores. Pasteurización en vapor: Es un conjunto de procedimientos en los cuales los sustratos de cultivo son sometidos a temperaturas inferiores a los 100 C y a presiones de vapor nunca superiores a la presión atmosférica. El mejor ejemplo de este tipo de procedimientos es el que se realiza durante la Fase II del compostaje para la obtención de sustratos en el cultivo del Champiñón de París (Agaricus spp.). Durante algunos días el sustrato semifermentado es colocado al interior de túneles donde paulatinamente sube la temperatura, eliminando gran cantidad de agentes contaminantes y permitiendo que aparezca una rica microflora termófila que transforma a este sustrato en un medio de crecimiento específico para el Champiñón de París (dicho esto en forma muy resumida). Durante la Pasteurización se eliminan los agentes contaminantes, pero permanecen poblaciones activas de otros microorganismos que producen antagonismos con agentes patógenos y contribuyen a enriquecer nutritivamente los sustratos de cultivo. En los últimos 8 años se han desarrollado en Chile varios tipos de Túneles de Pasteurización con inyección de Vapor, con el fin de procesar sustratos para el cultivo del Hongo Ostra y Shiitake, los que han resultado ser más económicos y fáciles de utilizar que los equipos para esterilizar (autoclaves). Sin embargo, estos requieren de tiempos mayores de uso, por lo que el fungicultor debe construir varios de ellos para que estos procedimientos no constituyan "cuellos de botella" en el cultivo (Cisternas, 2003). Este sistema disminuye considerablemente la carga de agentes que pueden causar contaminaciones, sin embargo, sólo se recomienda para sustratos con baja suplementación, es decir, que tienen una proporción baja de aditivos orgánicos e inorgánicos nitrogenados y polisacáridos o azúcares simples. Para sustratos con alta suplementación es recomendable esterilizar los sustratos en Autoclaves. Troncos Los troncos o trozas deben estar a un contenido de humedad de entre 50% y 80%, por lo que, una vez recolectados, lo ideal es que sean incorporados inmediatamente al proceso. Con esto se logra que la madera llegue a esta etapa con un contenido de humedad apropiado, evitándose pérdidas de humedad excesiva, dado los tiempos de exposición y manejo entre la corta y la preparación de los troncos. En el caso de no ser posible utilizar troncos frescos, ellos deberán ser hidratados sumergiéndolos en agua por un período mínimo de 72 horas, después de lo cual es necesario chequear el contenido de humedad hasta llegar al rango previamente indicado. En este punto es relevante el trabajo de las personas involucradas en la recolección, selección y preparación de los troncos. Se debe tener especial cuidado con el contenido de humedad de las trozas de acuerdo a lo indicado previamente, como también en los siguientes aspectos:

24 Técnicas de cultivo. 24 Forma de los troncos: se deben seleccionar en lo posible aquellos troncos que presenten forma cilíndrica. Tamaño de los troncos: se utilizarán aquellos troncos que presenten un diámetro aproximado de entre 10 y 15 cm y un largo de 100 cm. Estado sanitario: los troncos no deben presentar pérdida importante de corteza, ni tampoco grietas o rajaduras en su superficie. Se deben dejar de lado aquellas trozas que muestren evidencias de ataque por hongos, insectos u otros patógenos, tanto en su superficie como en su interior. Una vez seleccionadas y preparadas las trozas, éstas debe ser perforadas tanto en sentido longitudinal como perimetral, empleándose para ello un taladro. Las perforaciones longitudinales deberán estar separadas entre sí unos 10 cm, extendiéndose por todo el largo de la troza y a 5 cm de los extremos. Por su parte, las perforaciones perimetrales estarán separadas por una distancia de 6 cm medida como arco de circunferencia (Figura 6). Los orificios tendrán una profundidad de 2,5 cm y un diámetro de 10 mm, y deben quedar libres de cualquier residuo para evitar futuras contaminaciones. Figura 6. Matriz de perforaciones Siembra o inoculación del sustrato La etapa de inoculación se realiza en una sala ubicada al interior del invernadero, que ha sido diseñada para mantener las mejores condiciones asépticas posibles. Concordante con esto, previo a cada inoculación se deben limpiar con cloro, desinfectante en aerosol u otro, las superficies y el piso, asegurando un ambiente de trabajo aséptico. Durante todo el proceso de inoculación o siembra se debe trabajar con las máximas precauciones de asepsia, evitando el tránsito innecesarios de utensilios y personas, trabajando con guantes de látex, mascarilla y desinfectando superficies cada vez que sea necesario.

25 Técnicas de cultivo. 25 Siembra en bloques Para proceder a la siembra, la paja ya pasteurizada se deja enfriar de preferencia volteándola para que escape el vapor de agua atrapado, de lo contrario se condensará en ella y habrá problemas por exceso de humedad. Para ser sembrada, el contenido de humedad de la paja debe estar entre 70% y 80%. En la práctica el contenido de humedad se determina tomando un puñado de ella y apretándola moderadamente, si caen gotas de agua o es notoria la humedad que queda en la mano, la paja tiene exceso de agua, en cuyo caso se debe esperar a que escurra removiéndola. No es recomendable sembrar con niveles de humedad mayores que los indicados, porque el hongo necesita para su desarrollo de ciertos espacios porosos, lo que permite que el intercambio de gases sea el óptimo para su crecimiento, tanto de CO 2 como de oxígeno, evitando así la aparición de organismos que pueden vivir sin oxígeno y que ocasionan pudrición del sustrato. Una práctica habitual es adicionar a la paja, antes de la siembra, una cantidad de entre 1% y 2% de carbonato de calcio (cal) o sulfato de calcio (yeso) en base al peso húmedo, con el fin de aumentar parcialmente el ph a valores de entre 6 y 6,5. Eventualmente, se pueden agregar en este momento bajas concentraciones de fungicidas específicos, para evitar la contaminación con mohos durante la incubación. Para sembrar, la paja debe estar a una temperatura óptima de 20 a 25 C (cuando todavía está tibia). Con temperaturas mayores el micelio muere, mientras que con temperaturas demasiado bajas se retrasa el crecimiento. Una vez que la paja ha sido esterilizada o pasteurizada, ésta es mezclada con la semilla del hongo (inóculo) en una proporción de entre 3% y 5% del peso húmedo de la paja. Una vez que la paja toma la humedad y la temperatura óptimas se procede a formar el bloque, para lo cual, en bolsas de polietileno de alta densidad, se coloca una capa de sustrato de 10 cm de alto seguido de una capa de semilla (lo que alcance a tomar la mano esparciéndolo sobre la paja), y así sucesivamente, hasta alcanzar la altura deseada, luego de lo cual la bolsa es cerrada y compactada, etiquetándola con la fecha de siembra y colocándola en el área de incubación. Siembra en troncos En el caso de utilizar semilla en forma de granos de trigo, ésta es introducida en las perforaciones ocupando todo el volumen de ellas. Luego son selladas con parafina sólida (u otro material inerte), previamente derretida a baño maría, con el fin de impedir la entrada de microorganismos que causen contaminaciones (Figura 7). Se debe evitar dejar restos de semilla en el borde externo de las perforaciones y, en general, en la superficie del tronco, pues son potenciales focos de contaminación. Cuando se utilizan tarugos de madera como semilla, éstos se introducen en las perforaciones con la ayuda de un martillo, debiendo su tamaño coincidir con el de la perforación. Luego, éstas deben ser selladas con parafina.

26 Técnicas de cultivo. 26 Figura 7. Inoculación o siembra en troncos Colonización o incubación del sustrato El objetivo de la etapa de incubación o colonización es proporcionar al hongo las condiciones para que invada el sustrato lo más rápido posible. El sustrato, ya sea en forma de bloques o troncos, es llevado a la sala de incubación del invernadero, la que cumple el rol de cámara de cultivo, permitiendo el desarrollo del hongo al interior de él. Para ello deben permanecer en esta zona bajo las siguientes condiciones: Temperatura: el óptimo desarrollo de los hongos comestibles se logra a una temperatura de entre 24 y 28 C. Temperaturas menores provocan un retardo en el crecimiento, mientras que temperaturas mayores pueden ocasionar la muerte del micelio. Humedad: si el cultivo se realiza en bloques o bolsas plásticas, la humedad ambiental no es tan importante, ya que la bolsa mantiene la humedad requerida. Por el contrario, el cultivo en troncos requiere de un rango de humedad relativa de entre 70 y 80% para el adecuado desarrollo del micelio. Ventilación: durante esta etapa puede ser mínima, ya que la mayoría de los hongos comestibles toleran altas concentraciones de CO 2. Es importante realizar perforaciones a las bolsas al 2 o 3 día después de haber sido sembradas para permitir cierta aireación. Esta perforación debe ser realizada con una aguja gruesa previamente desinfectada y, de preferencia, haber sido flameada para evitar contaminaciones. La compactación del sustrato al interior de la bolsa tiene directa incidencia con la aireación, ya que si está muy compactado el intercambio gaseoso es muy deficiente produciéndose al centro una fermentación anaeróbica que elevará la temperatura del sustrato. Por el contrario, al existir poca compactación quedarán muchas zonas con aire, disminuyendo los rendimientos del

27 Técnicas de cultivo. 27 cultivo. Ya sea si el cultivo se realiza en bloques o en troncos, es necesario rotar o mover el sustrato de lugar, permitiendo una correcta aireación y, en el caso de las bolsas, permitir el drenaje del exceso de agua. Luminosidad: durante la colonización el hongo no necesita luz, sino una completa oscuridad. La sala de incubación debe estar cubierta con una malla sombreadora, lo cual evita la entrada de insectos y permite ahorrar energía. Dependiendo de la cantidad de inóculo y del sustrato utilizado, la incubación o colonización puede demorar de 1 a 4 meses, y su término se nota por el completo cubrimiento del sustrato en el caso de utilizar bloques. Para el hongo Shiitake cultivado en troncos, se ha considerado un período de incubación aproximado de tres meses. Es importante señalar que durante el período de colonización los troncos deben permanecer apilados, para lo cual deben formarse castillos, de preferencia, en hileras de 5 a 10 troncos (homogéneos en diámetro), perpendiculares entre sí, con el objetivo de facilitar el flujo de aire entre ellos y mantener su humedad. Se debe evitar el contacto directo con el suelo. La disposición final de los troncos se muestra en la Figura 8. Figura 8. Apilado de los troncos durante la colonización. Existen otras formas de apilar los troncos en la etapa de colonización, las que deben ser evaluadas por los fungicultores en función de la disponibilidad de espacio. Al interior del invernadero, las condiciones de temperatura son mantenidas utilizando un calefactor eléctrico, al cual se le incorpora un termostato fijado en 25 C. Una red de tuberías con aspersores inyectará agua al ambiente de modo de mantener la humedad relativa cercana al 80%, evitando la pérdida de humedad del sustrato. Se debe evitar el tránsito innecesario al interior del invernadero manteniendo siempre las puertas cerradas, y evitar la presencia de insectos y de hierbas. Además, previo a la colonización se debe aplicar algún fungicida y herbicida al piso de la sala, asegurando un ambiente de trabajo limpio. Durante todo el proceso de colonización se debe trabajar con las máximas precauciones de asepsia, utilizando guantes de látex, mascarilla y en lo posible desinfectar el ambiente cada vez que sea necesario.

28 Técnicas de cultivo. 28 Durante toda esta etapa, y en especial en la primera semana, se deben inspeccionar las bolsas o troncos diariamente con el fin de comprobar un desarrollo del micelio libre de contaminación. En los troncos es común la aparición de mohos en las superficies; si el área afectada es pequeña se debe limpiar con algún desinfectante convencional como el agua oxigenada, pero si las contaminaciones abarcan un área importante, los troncos deben ser desechados de manera de evitar la proliferación de agentes contaminantes, tal como se describió anteriormente. Si en las bolsas se observan indicios de contaminación, éstas deben ser desechadas inmediatamente Inducción de la fructificación En esta etapa se induce la formación de carpóforos o cuerpos fructíferos. Para ello se entregan estímulos al hongo, tales como cambios bruscos de luz, temperatura y aireación, lo que desencadena un proceso irreversible de inducción de primordios que posteriormente formarán los carpóforos (France, 2000). Para realizar esta etapa se debe contar en el invernadero con una sala exclusivamente destinada a la inducción, ya que las condiciones de crecimiento son distintas a las utilizadas en la etapa de colonización. Inducción a los bloques o bolsas: se debe producir un shock térmico bajando la temperatura a niveles de entre 7 y 10 C y se deben hacer perforaciones mayores a las bolsas o quitar la bolsa, de manera de permitir el desarrollo de los carpóforos. Una técnica utilizada es sacar las bolsas del área de colonización dejándolas al aire libre por toda una noche. Inducción a los troncos: en este caso el shock térmico (golpe de frío) que induce el desarrollo de los carpóforos se realiza sumergiendo los troncos en agua fría (ver Figura 9). Las condiciones apropiadas son: Tiempo de inducción: 24 a 48 hrs. Temperatura: 5 a 10 C Para realizar la inducción a los troncos, se utiliza un recipiente (estanque, piscina o similar) lleno de agua potable y que sea fácil de limpiar, ya que una vez terminada la inducción se elimina el agua de éste y se desinfecta para una posterior utilización. Durante el período de inducción, los troncos deben permanecer totalmente sumergidos en el agua. Los métodos de inducción presentados no son los únicos, sin embargo, son comúnmente empleados por los fungicultores debido a su bajo costo y consumo energético.

29 Técnicas de cultivo. 29 Figura 9. Inducción a los troncos mediante inmersión en agua. Transcurrido este período de tiempo, el sustrato (troncos o bloques), es llevado a la zona del invernadero destinada a la etapa de fructificación Fructificación. En bloques o bolsas: durante el período de fructificación, es recomendable utilizar un sistema que permita colgar las bolsas para el desarrollo óptimo de los carpóforos. En troncos: una vez finalizado el período de inducción, los troncos son llevados a la sala de fructificación. En esta etapa, son ordenados de forma vertical con una inclinación aproximada de 50, tal como se muestra en la Figura 10. Se debe evitar el contacto con el suelo. Figura 10. Posición de los troncos en etapa de fructificación.

30 Técnicas de cultivo. 30 Las condiciones ambientales en las cuales se desarrolla la etapa de fructificación son muy similares para ambos tipos de cultivo (bloques o troncos) y son las siguientes: Temperatura: entre 18 y 25 C. Humedad relativa del ambiente: entre 80% y 90%. Aireación: es necesario que las concentraciones de CO 2 sean bajas. Esto se logra manteniendo una ventilación constante con aire externo filtrado. En el caso del uso de bolsas, si éstas no se quitaron en la etapa de colonización se deben hacer perforaciones mayores, o ser retiradas. Luminosidad: es recomendable emplear un fotoperíodo inicial de 10 horas de luz y 14 de oscuridad. Una vez que han aparecido los primeros primordios se debe aumentar el período de luz a 12 horas. Se debe evitar la exposición directa al sol. La presencia de primordios puede ocurrir al 3 día luego de la inducción en el caso del cultivo en bloques, mientras que en los troncos lo usual es que se evidencien a la semana siguiente de la inducción. Si se observa que los pies de los carpóforos son excesivamente largos es un indicio de que la ventilación o la luz son insuficientes Cosecha y envasado. Si las condiciones ambientales se mantienen constantes en la etapa de fructificación los primeros carpóforos se cosechan alrededor de los 14 días post-inducción, tiempo equivalente para el cultivo en bloques o en troncos. Los criterios de cosecha van a depender del destino de la producción. En general, los carpóforos más pequeños son apropiados para coctelería y los más grandes para procesamiento (France, 2003). La cosecha se realiza empleando un cuchillo previamente desinfectado. El corte se realiza lo más próximo posible a la superficie del sustrato. Desde un punto de vista comercial, las setas de Shiitake óptimas para ser cosechadas son aquellas que presentan un sombrero con una abertura de aproximadamente una pulgada (2,5 cm), antes de que se extienda por completo su borde, como se muestra en la Figura 11.

31 Técnicas de cultivo. 31 Figura 11. Tamaño y forma de las setas a cosechar. Las setas son envasadas en bandejas de poliestireno, cada una con aproximadamente 100 gramos (medida comercial), las que son selladas con plástico adherente y luego etiquetadas. Las bandejas deben ser inmediatamente refrigeradas (7 C), evitándose con ello la deshidratación de las setas. Se debe tener cuidado de desinfectar los utensilios de cosecha y evitar una excesiva manipulación de las setas. En imprescindible el uso de guantes y mascarillas y el material de embalaje debe almacenarse en un lugar limpio. Inducción de una nueva oleada: en el caso del cultivo en troncos, finalizada la cosecha éstos son llevados nuevamente al área de colonización donde deben permanecer por un período aproximado de tres semanas, aunque este tiempo depende del tamaño de la seta que se desee obtener en la nueva cosecha. Tiempos menores generarán carpóforos de menor tamaño y viceversa. Cumplido el período en colonización, se procede a una nueva inducción y cosecha de acuerdo a lo indicado previamente. En el caso de los cultivos realizados en bloques o bolsas, una vez finalizada la cosecha, las bolsas son llevadas al área de colonización por un período aproximado de 1 semana y nuevamente inducidas, mediante un shock térmico, a la fructificación. 4.3 Enfermedades y plagas El Shiitake es un hongo relativamente resistente a las plagas si es inoculado adecuadamente. Las consideraciones principales para evitar las plagas son mantener una correcta densidad de inoculación, prevenir que los troncos se resequen y evitar el contacto con el suelo. Un adecuado espaciamiento de los puntos de inoculación y un eficiente sistema de llenado y sellado es esencial para que el micelio colonice óptimamente el tronco. Si las perforaciones o puntos de inoculación están demasiado distanciadas, o si la inoculación se retrasa, existe una alta probabilidad de que otros hongos se establezcan, inhibiendo o disminuyendo el crecimiento de Shiitake en el tronco, con el consiguiente efecto sobre la productividad. Eventualmente, pueden llegar a producirse en un mismo tronco cuerpos fructíferos de algún otro hongo superior que lo haya invadido previamente, situación que debe ser evitada desde un comienzo, desechando aquellos troncos que presenten alguna evidencia de contaminación, siendo su uso más común el empleo como combustible.