Diversas teorías acerca de la etiología de las enfermedades priónicas han sido formuladas desde los primeros diagnósticos de Scrapie.

Transcripción

1 Etiología Diversas teorías acerca de la etiología de las enfermedades priónicas han sido formuladas desde los primeros diagnósticos de Scrapie. En 1814, Roche-Lubin afirmaba que se trataba de una enfermedad causada por una superactividad sexual de los machos o como consecuencia de las tormentas, mientras que McGowan proponía como agente causal el Sarcosporidium. El primer autor que decidió aventurar una nueva teoría con respecto a la etiología de estas enfermedades fue Besnoit, que, en 1899, postuló que el agente etiológico podía ser un virus. Inicialmente, Parry apoyaba la hipótesis de que se trataba de una enfermedad causada por un gen autosómico recesivo; sin embargo, también afirmaba que los animales debían poseer un agente transmisible que fuera infeccioso por diversas rutas. Así, después de más de 100 años considerándose una enfermedad hereditaria, los experimentos de Cuile y Chelle en 1938, probaron que se trataba de una enfermedad transmisible con capacidad de atravesar los filtros más pequeños. Con respecto a la naturaleza del agente responsable de esta enfermedad, son varias las hipótesis que han sido formuladas. Una de ellas es la denominada teoría vírica, por la que Heino Diringer en 1991 afirmaba que las denominadas EETs podían ser consideradas como amiloidosis inducidas por virus. Éstos se replicarían en el tejido linfoide, eventualmente alcanzarían el SNC, donde se replicarían causando agregados de una proteína celular, que a su vez debería funcionar como un receptor viral, en forma de fibrillas amiloides patológicas. En este mismo año, Rohwer definía la existencia de varias cepas de este virus, considerando que concretamente una proteína del hospedador, la proteína PrP, jugaba un papel fundamental en la infección, así como en su propagación. El problema de la teoría vírica es que por muchos análisis que se han efectuado de preparados altamente infectivos, el tamaño más grande de ácido nucleico que se ha encontrado no tiene más de 80 nucleótidos. Por otro lado, teniendo en cuenta las peculiares propiedades físicoquímicas que estos supuestos agentes virales presentaban y que los diferenciaban de los virus clásicos, el Comité Internacional de Taxonomía Viral, introducía el término virus no convencional que se define como agente de transmisión asimilable pero no idéntico a los virus convencionales. Concretamente, las características comunes a todos ellos se resumirían en: pequeñas dimensiones (10 a 30 nm); bajo peso molecular (inferior a ); extrema resistencia al calor; estabilidad frente a las variaciones del ph; peculiar resistencia a las radiaciones ionizantes y ultravioletas, y a las sustancias clásicamente virocidas, ADNasa, ARNasa, tripsina y el formol. En la teoría del virino de Dickinson y Outram se formulaba que el agente causal es un ácido nucleico no traducido, por lo que se asumía que la proteína denominada SAF (Scrapie associated fibril, proteína prión) actuaría protegiendo el ácido nucleico, de ahí que sea resistente a tratamientos que normalmente romperían dicho ácido. Recientemente, Alper postulaba la hipótesis de la membrana modificada. Se trataría de una membrana unitaria o vesícula infectiva que explicaría mejor que la teoría de los

2 virus o los virinos el fenómeno de especies barrera y el largo período de incubación en la infección horizontal. Previamente se habían barajado otras teorías, entre las que se encuentra la del viroide, basada en un modelo vegetal, por la que el agente en cuestión debía contener un ácido nucleico con una secuencia tan simple que pequeñas secciones de la cadena de polinucleótidos retienen toda la información. Finalmente, la teoría más ampliamente aceptada actualmente, de Stanley Prusiner (1982), en la que se postula que todas las EETs, tanto animales como humanas, tienen como agente causal una partícula proteinácea infecciosa, que denominó prión. Posteriormente, se demostró que la fracción más infecciosa y de mayor actividad patógena correspondía a una proteína de Kilodalton (Kd) de peso molecular, que resultó ser una sialoglicoproteína. En realidad, la teoría de la existencia de una única proteína como agente causal, era formulada ya en 1967 por Alper et al., y Griffith et al. Para explicar el mecanismo de propagación del agente, se proponía que el agente causal era una proteína modificada del hospedador capaz de convertir la proteína normal en proteína modificada. Para explicar cómo esta proteína patológica conseguiría transformar la proteína celular normal en patológica, se establecían dos teorías: la del modelo de replegamiento y la del modelo de nucleación dependiente de polimerización, ambas defendiendo una interacción directa de PrPc con PrPsc. Mencionar aquí la propuesta realizada muy recientemente por Aguzzi y Brandner, en la que se sugiere que la PrPsc aparece como un intermediario en la génesis de la PrPc, tal como sucede en las amiloidosis humanas. BIOLOGÍA DE LA PROTEÍNA PRIÓN El descubrimiento de la proteína prión fue un gran avance para caracterizar la etiología de las EETs al proporcionar un marcador molecular, en principio, específico de dichas enfermedades. Así, aceptando como válida la teoría de Prusiner, por la que la proteína prión (PrPsc) es una variante conformacional de una proteína normal celular (PrPc), los diferentes estudios de conversión soportan un modelo de propagación del prión que involucra una interacción proteína-proteína, entre la PrPc del huésped y la PrPsc inoculada, que actúa promoviendo la conversión de PrPc a PrPsc en un proceso autocatalítico, que a su vez procede muy eficientemente al interaccionar proteínas con la misma estructura primaria. En este proceso de conversión, una porción de su estructura α-helicoidal y enrollada es reordenada hacia β-lámina. Esta transición estructural, que va acompañada de profundos cambios en las propiedades físico-químicas de PrPc, conlleva básicamente un cambio de conformación de la proteína que pasa de tener un 40% de estructura de α- hélice y un 3 % de hoja plegada en β en la proteína celular normal (PrPc), a tener un 30% de α-hélice y un 45% de hoja plegada en β en la proteína patológica (PrPsc). La diferencia esencial entre ambas isoformas se basa en la insolubilidad y la parcial resistencia frente a proteasas (únicamente sufre proteolisis del extremo amino-terminal) de la PrPsc. Sin embargo, el mecanismo concreto de formación de PrPsc todavía se desconoce. Algunos estudios especulan que PrP tiene una capacidad inherente para promover su

3 propio cambio conformacional, mientras otros piensan que es necesaria una asociación de esta proteína con un agente infeccioso (todavía sin determinar) para su propagación. Por otro lado, los estudios realizados indican que la estructura primaria de PrPc codificada por genes de animales sanos no difiere de la codificada por el cdna de animales infectados, lo que sugiere que las distintas propiedades entre PrPc y PrPsc de cerebros infectados por Scrapie son debidas a eventos post-traduccionales. Al considerar la hipótesis de que un cambio conformacional de la proteína prión es la causa del comienzo de las EETs, el conocimiento de la estructura 3D de PrPc es esencial para la comprensión de su transición hacia PrPsc. Su estructura se caracteriza por: - un dominio globular (C-t) que se extiende, aproximadamente, desde los residuos , y - un extremo amino terminal (N-t) flexible y desordenado. El carboxilo terminal (C-t) se caracteriza por la presencia de dos hebras antiparalelas (formadas por los residuos y ), que forman una corta lámina- β, y tres α-hélices (A, B y C, formadas por los residuos , y , respectivamente). Dicho dominio también contiene la mayoría de los sitios de mutación puntual relacionados con la aparición de las enfermedades familiares del prión en humanos, así como ambos sitios de glicosilación y el único puente disulfuro, entre las Cisteínas 179 y 214. La estructura por RMN demuestra que dichas mutaciones ocurren dentro de, o directamente asociadas a, estructuras secundarias regulares. Tanto la secuencia como la estructura 3D de este dominio carboxilo terminal (C-t) de hprp (humano), mprp (ratón) y shprp (hamster), son muy similares. Además, la proteína PrPc madura glicosilada está unida a la superficie celular mediante un ancla de GPI (glicosil-fosfatidilinositol) en la serina 231 C-t, que parece ser necesaria para la función sináptica normal, la alta supervivencia de las células de Purkinje y la regulación de los ritmos de actividad circadianos y del sueño. También se ha demostrado que, en el caso de la mprp, el segmento es suficiente para la propagación de la enfermedad in vivo, indicando que la región C-t de PrP es de especial importancia funcional. El extremo N-t se caracteriza por la presencia de un octapéptido (PHGGGWGQ) repetido (5 veces en la hprp), al parecer relacionado con la función de la proteína prión. Diversos estudios acerca de la síntesis y localización de las dos isoformas de la PrP han demostrado que la proteína prión se encuentra principalmente expresada en el SNC aunque también en menor medida, en tejido extraneural. La localización de PrPc dentro de las neuronas no está clara. La mayoría de los estudios inmunohistoquímicos describen una expresión somática de PrPc en neuronas, con menor o ninguna señal en el neuropilo. Sin embargo, los datos obtenidos mediante histoblot y microscopía electrónica indican una localización sináptica de PrPsc. Además, se ha observado la colocalización de PrPc con sinaptofisina (proteína de vesícula presináptica), y se ha especulado que pueda ser un constituyente de la membrana de la vesícula sináptica o un producto acumulado dentro de dichas vesículas. Otros estudios en los que se ha usado métodos de fraccionamiento sinaptosomal complementados con técnicas inmunohistoquímicas, apoyan la idea de que PrPc es expresada predominantemente en la membrana presináptica. Además, y debido a que es sabido que PrPc une cobre, se han

4 usado técnicas de espectroscopía de absorción que demuestran una reducción en la concentración de cobre en las preparaciones sinaptosomales de ratones Prnp0/0. FUNCIÓN DE LA PROTEÍNA PRIÓN Por último, aunque se ha avanzado mucho en el papel de la proteína prión en las EETs, la función biológica de la PrPc es todavía desconocida. Sin embargo, - se ha sugerido que debe jugar un importante papel en el mantenimiento y/o regulación de las funciones neuronales. - los resultados obtenidos demuestran la habilidad para unir cobre de PrPc, y se ha propuesto su relación en la regulación de la concentración de cobre presináptico y en la transmisión sináptica. - también se le ha relacionado con la señalización en la superficie celular o con la adhesión celular, debido a su unión a la membrana plasmática a través de la GPI anteriormente mencionada. Además, se sabe que el receptor de laminina se une a PrPc. Como receptor de superficie celular, se ha encontrado un acoplamiento de PrPc a la tirosina-kinasa Fyn, dependiente de caveolin-1; esto implica la existencia de una(s) señal extracelular capaz de disparar la activación de esta proteína y proporcionar una base para descubrir dicha señal. Cómo la acumulación de PrPsc puede interferir con la actividad de señalización de PrPc es una pregunta todavía sin resolver. Adicionalmente, se ha demostrado que el dominio amino-terminal de PrPc exhibe cinco a seis sitios que ligan cobre (Cu II), presentadas como un quelato de glicina. A ph neutro, la unión ocurre con cooperatividad positiva, con una afinidad compatible con las estimaciones para el cobre lábil extracelular. Ratones que carecen del gen PrPc (Prnp0/0) exhiben reducciones severas en el contenido de cobre de extractos de cerebro enriquecidos en membrana, y reducciones similares en las fracciones subcelulares sinaptosomales y endosomales-enriquecidas. Dichos ratones también tienen alterado el fenotipo celular, incluyendo, entre otras, una reducción en la actividad superóxido dismutasa de cobre / zinc, y las respuestas electro-fisiológicas en presencia de un exceso de cobre. Estos resultados indican que PrPc puede existir en una forma de Cumetaloproteína in vivo. Además, en ratones infectados por Scrapie, debido a la alteración en la actividad enzimática que en estos se observa, la elevada generación de radicales libres de oxígeno y la reducida actividad en la mitocondria podrían causar el daño cerebral. Tales cambios deletéreos en la mitocondria (cuya microscopía electrónica indica que su ultraestructura está destruida) pueden contribuir al desarrollo de la enfermedad del prión. Esta capacidad de la proteína prión para unir cobre le otorga una actividad antioxidante que refuerza la supervivencia de las neuronas en cultivo. Se ha probado la habilidad de PrP para ligar otros cationes, pero únicamente el manganeso puede sustituir al cobre. Aunque inicialmente la PrP cargada de manganeso exhibe una estructura y actividad similares a las de PrP cargada de cobre, tras madurar, se vuelve proteinasa-resistente y pierde su función. Estos resultados demuestran que es posible generar PrP resistente frente a proteinasa a partir de células y hacen pensar en un posible mecanismo para la generación de la isoforma PrP del Scrapie esporádico.

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