EVALUACIÓN DE DIFERENTES MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN (INFORME)

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1 EVALUACIÓN DE DIFERENTES MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN (INFORME)

2 INTRODUCCIÓN Los conceptos sobre infecciones y los métodos para combatirlas se han mantenido vigentes desde los tiempos de Hipócrates, quién ya 400 años antes de Cristo, promulgaba medidas para el control de las infecciones, hoy en día se emplean métodos más sofisticados y de alta tecnología. Son muchas las ciencias que frecuentemente se ven enfrentadas a seleccionar el método de esterilización y desinfección adecuados para evitar la contaminación de sus materiales y objetos de trabajo, destrucción total de todos los microorganismos y agentes infecciosos los que por sus características de precisión, termolabilidad, costo elevado, y que además presentan cavidades, lúmenes, sinuosidades, válvulas, anillos y otros, dificultan la decisión. Es importante precisar que eliminar por completo los gérmenes es un imposible. Ya que muchos de los microorganismos que acaban provocando una contaminación conviven de forma pacífica con el personal. Estos casos abundan más en las ciencias de la medicina. Sin embargo, y a pesar de que estos campos abonados para estos microorganismos, las autoridades sanitarias de todos los países batallan para reducir las consecuencias que pueden traer, mediante la aplicación de ciertas normas preventivas conocidas mundialmente como precauciones universales. Precauciones como el simple lavado de manos de todo el personal. De igual forma la utilización de barreras protectoras ((mascarilla, guantes, etc), la desinfección y la esterilización de materiales (Normas de Higiene). La lista de medidas preventivas son innumerables. Generalmente se utilizan métodos de desinfección de alto nivel que sólo destruyen microorganismos en las formas vegetativas y no en las formas esporuladas. Estos desinfectantes provocan corrosión y alteración en su estructura en el tiempo.

3 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Evaluar la efectividad de algunos métodos de esterilización y desinfección. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Evaluar la esterilidad del medio ambiente del laboratorio Evaluar la contaminación de la cavidad oral. Evaluar la desinfección de los mesones. Evaluar la efectividad de la esterilización en un cultivo bacteriano. Evaluar el isodine como antiséptico en la piel. Determinar el método de desinfección más apropiado para la industria alimentaria.

4 TEORÍA RELACIONADA DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN La desinfección es la eliminación de todos los gérmenes dirigida a evitar totalmente la transmisión de determinados microorganismos indeseables, mediante la transmisión de determinados agresiones a su estructura o a su metabolismo sin considerar su estado funcional. La esterilización, por otra parte, implica la destrucción de todas las formas de vida de los microorganismos, sobre todo de esporas, especialmente resistentes a las condiciones externas. Desinfección química Una desinfección total no puede alcanzarse realmente con medios químicos solamente, puesto que las esporas raramente se destruyen así. Generalmente tampoco puede esperarse acción viricida y para la destrucción de hongos patógenos deben emplearse igualmente medios especiales. Se diferencia una desinfección grosera para cuerpos, paredes, vehículos, establos, excrementos, letrinas, etc. Condiciones que influyen en la acción antimicrobiana Temperatura: a mayor temperatura mayor acción. Tipo de microorganismo: las células vegetativas en desarrollo son mucho más susceptibles que las esporas. Estado fisiológico de las células: las células jóvenes son más vulnerables que las viejas. Ambiente: El calor es más eficaz en un medio ácido que en uno alcalino. La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye marcadamente en la penetración del agente. Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo general, la resistencia térmica de los organismos.

5 La presencia de materia orgánica extraña reduce notablemente la eficacia de los agentes químicos antimicrobianos por inactivar éstos o proteger al microorganismo. Criterio de muerte de un microorganismo Pérdida irreversible de la capacidad de reproducción en un medio adecuado. Para poder determinar la eficacia antimicrobiana (la muerte de los microorganismos) se utilizan técnicas que descubran a los sobrevivientes es decir, a los capaces de reproducirse; ya que los incapaces de reproducirse están muertos. Esto se determina generalmente mediante métodos cuantitativos de siembra en placa en los que los supervivientes se detectan porque forman colonias. Cuando una población microbiana se expone a un agente letal, la cinética de la muerte es casi siempre exponencial ya que el número de supervivientes disminuye de forma geométrica con el tiempo. Para establecer los procedimientos de esterilización hay que tener en consideración dos factores: la tasa de mortalidad y el tamaño de la población inicial. En la práctica de la esterilización la población microbiana que ha de ser destruida es mixta. Como los microorganismos difieren ampliamente en su resistencia a los agentes letales, los factores que se hacen significativos son el tamaño de la población inicial y la tasa de mortalidad de los miembros más resistentes de la población mixta. Para asegurar la fiabilidad de los métodos de esterilización se utilizan suspensiones de esporas de resistencia conocida. Los procedimientos rutinarios de esterilización se diseñan siempre de forma que proporcionen un amplio margen de seguridad. ESTERILIZANTES FÍSICOS El calor húmedo (autoclave a vapor) y el óxido de etileno (gas) son los principales sistemas de esterilización. Algunos compuestos químicos considerados como desinfectantes pueden utilizarse como esterilizantes si se usan adecuadamente. Los procedimientos empleados para tales propósitos deben ser efectivos contra toda clase de microbios y ser relativamente insensibles a su estado metabólico. Altas Temperaturas La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es uno de los métodos más efectivos para destruir microorganismos. En este caso la esterilización por calor se

6 basa en la desnaturalización proteica y la desorganización de las membranas lipídicas. La acción letal del calor es una relación de temperatura y tiempo afectada por muchas condiciones. Esterilización por calor húmedo: (121 a 132º C durante diversos intervalos de tiempo). La esterilización por calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación irreversible, desnaturalización de enzimas y proteínas. El Autoclave es el aparato más comúnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se desnaturalicen a temperaturas mayores a 100 C. Una temperatura de 121 C (una atmósfera de sobrepresión). El tiempo de exposición depende del volumen del líquido. Tindalización: Se utiliza cuando las sustancias químicas no pueden calentarse por encima de 100 C sin que resulten dañadas. Consiste en el calentamiento del material de 80 a 100 C hasta 1 hora durante 3 días con sucesivos períodos de incubación. Las esporas resistentes germinarán durante los períodos de incubación y en la siguiente exposición al calor las células vegetativas son destruidas. Pasteurización: La leche, nata y ciertas bebidas alcohólicas (cerveza y vino) se someten a tratamientos de calor controlado que sólo matan a ciertos tipos de microorganismos pero no a todos. La temperatura seleccionada para la pasteurización se basa en el tiempo térmico mortal de microorganismos patógenos. Esterilización por calor seco: (se utiliza para materiales sólidos estables al calor) El calor seco produce desecación de la célula, efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos, procesos oxidativos y fusión de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos. El aire es mal conductor del calor, y el aire caliente penetra más lentamente que el vapor de agua en materiales porosos. La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja. Esto se debe a que las proteínas se estabilizan mediante

7 uniones puente de hidrógeno intramoleculares que son más difíciles de romper por el calor seco. La Estufa de esterilización es el artefacto utilizado en los laboratorios para esterilizar por calor seco. Sirve para esterilizar material de vidrio. El papel y el algodón no pueden ser esterilizados a más de 160 C. Horno Pasteur: El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio y otros materiales sólidos estables al calor. Incineración: La destrucción de los microorganismos por incineración es una práctica rutinaria en los laboratorios. Las asas de siembra se calientan a la llama de mecheros Bunsen. Acción directa de la llama: Se lleva al rojo el material de metal como hansas, lancetas, agujas de disección. Bajas Temperaturas El metabolismo de las bacterias está inhibido a temperaturas por debajo de 0 C. Sin embargo estas temperaturas no matan a los microorganismos sino que pueden conservarlos durante largos períodos de tiempo. Esta circunstancia es aprovechada por los microbiólogos para conservar los microorganismos indefinidamente. Radiaciones: También denominado esterilización en frío. Su fundamento se basa en el poder ionizante de la radiación que reduce o inhibe el poder multiplicador de los microorganismos por su interacción con su DNA. La esterilización en frío consiste en usar soluciones que contiene sustancias químicas, que diluídas en agua destilada, provocan la destrucción de las bacterias vegetativas y esporas. Afecta las proteínas de la membrana celular dañando su función. Ultravioletas: Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos debido a que forman dímeros de pirimidinas adyacentes que inducen errores en la duplicación y por lo tanto la pérdida de la viabilidad de las células. Son

8 escasamente penetrantes y se utilizan para superficies. Se usan para reducir la población microbiana en quirófanos, cuartos de llenado asépticos en la industria farmacéutica y para tratar superficies contaminadas en la industria de alimentos y leche. Filtración Algunos materiales como los líquidos biológicos son termolábiles. Los microorganismos quedan retenidos en parte por el pequeño tamaño de los poros del filtro y en parte por adsorción a las paredes del poro durante su paso a través del filtro debido a la carga eléctrica del filtro y de los microorganismos. Debido al pequeño tamaño de los virus, nunca es posible tener certeza de que, por los métodos de filtración que dejan libre de bacterias una solución, se van a eliminar también los virus. Desecación La desecación de las células vegetativas microbianas paraliza su actividad metabólica. El tiempo de supervivencia de los microorganismos después de desecados depende de muchos factores, entre ellos la especie microbiana. En general, los cocos Gram (-) son más susceptibles a la desecación que los cocos Gram (+). Las endoesporas bacterianas son muy resistentes a la desecación pudiendo permanecer viables indefinidamente. ESTERILIZANTES QUÍMICOS Los gases y vapores se utilizan para esterilizar objetos e instrumental que no soportan el calor. Se utilizan como desinfectantes químicos a bajas temperaturas los aldehídos (glutaraldehído), ácido peracético y peróxido de hidrógeno. Esterilización mediante gas (óxido de etileno) Las dos desventajas más importantes de este método son que el material precisa de un tiempo de aireación antes de ser utilizado, lo que enlentece el proceso, y su elevado coste. La efectividad de la esterilización se monitoriza con esporas de B. subtilis.

9 Gas plasma El gas plasma, que se obtiene al aplicar determinadas ondas a los vapores de peróxido de hidrógeno, posee actividad esporicida. Los productos finales de su descomposición son el oxígeno y el agua. Los controles de eficacia del proceso pueden ser químicos o biológicos, y en este último caso se utilizan esporas de B. subtilis niger. La principal ventaja es que puede aplicarse a materiales sensibles a calor, no corroe los metales y no es preciso airear el material esterilizado. DESINFECTANTES Son aquellas sustancias químicas que matan las formas vegetativas y no necesariamente las formas de resistencia de los microorganismos patógenos, se aplica sobre material inerte sin deteriorarlo. No necesariamente elimina las esporas bacterianas. Espectro de actividad de los desinfectantes Las sustancias con actividad biocida tienen grados variables de actividad sobre los diferentes grupos de microorganismos. Se pueden clasificar en tres categorías según su potencia y efectividad de acción contra los microorganismos: baja, intermedia y alta. Los desinfectantes de bajo nivel pueden destruir la mayor parte de las formas vegetativas bacterianas, tanto grampositivas como gramnegativas, algunos virus (virus con envoltura lipídica) y hongos (levaduras), pero no Mycobacterium spp, ni las esporas bacterianas. Los desinfectantes de nivel intermedio consiguen inactivar todas las formas bacterianas vegetativas, incluyendo Mycobacterium tuberculosis, la mayoría de los virus (virus con y sin envoltura) y hongos filamentosos, pero no destruyen necesariamente las esporas bacterianas. En cambio, los desinfectantes de alto nivel matan bacterias vegetativas, bacilo de tuberculosis, hongos, virus lipídicos y no lípidos, pero no necesariamente alto número de esporos bacterianos. Las propiedades que ha de reunir un desinfectante ideal son: amplio espectro antimicrobiano, rápida acción microbicida, facilidad de uso, escasa capacidad para alterar el instrumental, solubilidad en agua, estabilidad de la forma concentrada y diluida del producto, toxicidad reducida para el hombre de las soluciones de uso, ininflamabilidad y coste bajo o moderado.

10 La eficacia de los desinfectantes se puede ver alterada por varios factores. Entre éstos se incluyen las sustancias interferentes, el tipo y grado de contaminación microbiana, la concentración y ph de la solución desinfectante, el tiempo de exposición, el diseño y composición del objeto a desinfectar y la temperatura a la que se realiza el proceso de desinfección. A continuación se describen los desinfectantes más utilizados en la actualidad, agrupándolos según el grupo químico al que pertenecen. Alcoholes: Los alcoholes poseen una rápida acción bactericida, actuando sobre bacterias gramnegativas y grampositivas, y virus con envuelta, siendo por tanto considerados como desinfectantes de bajo nivel. La concentración bactericida óptima se sitúa en el 70%. Los alcoholes actúan desnaturalizando las proteínas disolviendo las capas lipídicas, lesionan la membrana celular de los microorganismos, desorganizan la estructura fosfolipídica y como agentes deshidratantes, pero no tienen actividad residual. Los alcoholes se inactivan en presencia de materia orgánica. Aldehídos: Son agentes alquilantes que actúan sobre proteínas, lo que provoca modificación irreversible de enzimas e inhibición de la actividad enzimático (Adición nucleofílica de grupos -NH 2 y -SH). Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes. Destruyen esporas. Formaldehído (formalina o formol). Se utiliza como desinfectante de alto nivel en estado líquido y gaseoso. En solución acuosa (formaldehído al 37%); posee actividad bactericida, fungicida, virucida, tuberculicida y esporicida. Tiene poco poder de penetración en las células, pero su actividad aumenta con la temperatura y la humedad relativa (combinación de formaldehído gas con vapor a 70-75ºC). Glutaraldehído: El glutaraldehído es el único esterilizante efectivo en frío. Es un dialdehído saturado aceptado como desinfectante de alto nivel y esterilizante químico. En solución acuosa el glutaraldehído es ácido, poco estable y no posee actividad esporicida. Sin embargo, cuando la solución se alcaliniza (ph 7,5-8,5), se

11 activa y posee actividad esporicida. Su actividad biocida se debe a la alteración del RNA, DNA y síntesis de proteínas. Fenoles y derivados: Son desinfectantes de tipo orgánico que provocan lesiones en la membrana citoplasmática porque desordenan la disposición de las proteínas y fosfolípidos. Esto causa filtración de compuestos celulares, inactivación de enzimas y lisis. Los derivados del fenol más utilizados son el hexaclorofeno (compuesto difenílico) y los cresoles (alquil fenoles). Estos son muy efectivos a bajas concentraciones contra formas vegetativas de bacterias. Metales: Los más efectivos son el mercurio, plata,cobre y zinc. Actúan inactivando las proteínas celulares al combinarse con ellas. Entre los compuestos de mercurio que se emplean como antisépticos en heridas superficiales de la piel y mucosas están el mercurocromo (mercromina) y el mertiolato. Entre los compuestos de plata utilizados como antisépticos está el nitrato de plata (AgNO 3 ) que en solución al 1% se ha utilizado para prevenir infecciones gonocócicas en los ojos de los recién nacidos aunque actualmente se está reemplazando por antibióticos como la penicilina. Entre los compuestos de cobre se encuentra el sulfato de cobre (CuSO 4 ) que se utiliza como algicida en los recipientes abiertos que contienen agua. También es fungicida por lo que se utiliza para controlar las infecciones fúngicas de plantas. Los compuestos de zinc también son fungicidas por lo que se utilizan para tratar el pié de atleta. Ácidos y álcalis: Actúan alterando la permeabilidad y coagulando las proteínas. En general los ácidos son más eficaces que los álcalis. Dentro de estos compuestos se encuentran el sulfúrico (H2SO4), nítrico (HNO3), hidróxido sódico (NaOH) e hidróxido potásico (KOH). Tienen aplicación limitada debido a su naturaleza cáustica y corrosiva. Aún así el NaOH se utiliza en la industria del vino para limpiar las cubas de madera. Compuestos inorgánicos oxidantes: actúan oxidando los componentes de la membrana y enzimas. El agua oxigenada (H2O2) al 6% (20 volúmenes) se utiliza como antiséptico en pequeñas heridas de la piel.

12 Ácido peracético (ácido peroxiacético): Es un desinfectante corrosivo frente a metales, pero este efecto puede disminuirse modificando su ph. Su acción biocida se debe a la desnaturalización de proteínas y enzimas y cambios de permeabilidad de la pared celular. Derivados de amonio cuaternario: El cloruro de benzalconio tiene una buena actividad bactericida frente a grampositivos, pero es poco activo frente a bacterias gramnegativas. Las bacterias gramnegativas pueden crecer en las soluciones de estos productos. También presentan actividad fungicida y virucida sobre virus con envoltura, pero ésta es escasa frente a virus sin envoltura y casi nula frente a micobacterias y esporas. Poseen una buena actividad como detergentes. Halógenos: Los halógenos especialmente el cloro y el iodo son componentes de muchos antimicrobianos. Los halógenos son agentes fuertemente oxidantes por lo que son altamente reactivos y destructivos para los componentes vitales de las células microbianas. Cloro: La muerte de los microorganismos por acción del cloro se debe en parte a la combinación directa del cloro con las proteínas de las membranas celulares y los enzimas. Así mismo en presencia de agua desprende oxígeno naciente (O) que oxida la materia orgánica: Cl2 + H2O > HCl + HClO (ácido hipocloroso) HClO > HCl + O (oxígeno naciente) El gas cloro licuificado se utiliza en la desinfección del agua de bebida y piscinas. El hipoclorito sódico (lejía) al 1% se puede utilizar como desinfectante doméstico. El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actúan sobre proteínas y ácidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos, índoles y al hidroxifenol de la tirosina. Iodo: Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos. Inactiva proteínas y enzimas por oxidación de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar también grupos amino, indoles, etc. Además la habilidad que tiene el iodo para

13 combinarse con el aminoácido tirosina resulta en la inactivación de enzimas y otras proteínas. El iodo se puede utilizar como antiséptico bajo dos formas: i) tintura de iodo, es una solución alcohólica (tintura) de iodo (I2) más ioduro potásico (KI) o ioduro sódico (NaI). ii) iodóforos, son mezclas de iodo (I2) con compuestos que actúan como agentes transportadores y solubilizadores del iodo. Los iodóforos tienen la ventaja de que no tiñen la piel, es efectivo contra esporas en una concentración de 1600 ppm de iodo libre. Las preparaciones de iodo se utilizan principalmente para desinfectar la piel así como en la desinfección de pequeñas cantidades de agua. Los vapores de iodo se utilizan a veces para desinfectar el aire. ANTISÉPTICOS Son aquellas sustancias químicas que previenen el crecimiento o acción de los microorganismos ya sea destruyéndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo. La selección de un antiséptico se debe hacer teniendo en cuenta el espectro de actividad, concentración, aceptación de los usuarios, rapidez de acción, inactivación por materia orgánica, coste y toxicidad, entre otros. Clorhexidina Aunque la actividad de la clorhexidina es más lenta que la de los alcoholes, se ha comprobado su eficacia para reducir la flora de la piel tras unos segundos de aplicación. Poseen buena actividad frente a bacterias grampositivas, pero ésta es menor frente bacterias gramnegativas y hongos. Tiene una acción remanente superiora 6 h. Su actividad se reduce por alteración de ph (actividad máxima a ph 5,5-7), dilución con agua corriente, jabones con aniones orgánicos o inorgánicos. Paraclorometaxilenol Posee una buena actividad frente a bacterias grampositivas, pero ésta es menor frente a bacterias gramnegativas, hongos y virus. La actividad aumenta en presencia de EDTA. No es agresivo para la piel y produce una actividad residual que perdura durante varias horas. Sin embargo, este antiséptico se neutraliza en presencia de detergentes no iónicos. Las concentraciones de uso son del 0,5-3,75%.

14 Yodóforos Las formulaciones de yodóforos utilizadas como antisépticos contienen menos yodo libre que las formuladas como desinfectantes (entre 0,75-1,2% de yodo disponible). Su actividad residual es mínima, inferior a otros antisépticos, y su actividad antimicrobiana es neutralizada por materia orgánica. El yodo penetra fácilmente en los microorganismos a través de sus membranas celulares, destruyendo las proteínas. Son bactericidas de potencia intermedia, poseen actividad frente a bacterias grampositivas y gramnegativas, pero tienen escasa actividad frente a micobacterias. Son activos frente a virus con y sin envoltura. Sin embargo, su actividad se reduce en presencia de sustancias alcalinas y materia orgánica. Son corrosivos para los metales. Agentes iónicos y anfóteros Son sustancias que lesionan la membrana celular debido a que desordenan la disposición de las proteínas y de los fosfolípidos, por lo que se liberan metabolitos desde la célula, se interfiere con el metabolismo energético y el transporte activo. No son esporicidas ni tubercolicidas aún en altas concentraciones. Su principales ventajas se hallan en que son inodoros, no tiñen, no son corrosivos de metales, estables, no tóxicos y baratos. Organo Mercuriales Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las proteínas, inactivando enzimas. Dentro de los mercuriales orgánicos se encuentran el metafen y el merthiolate. Colorantes Interfieren en la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas (acridina) o interfieren en la síntesis de la pared celular (derivados del trifenilmetano). La acridina se inserta entre dos bases sucesivas del DNA separándolas físicamente. Esto provoca errores en la duplicación del DNA. EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS

15 Técnica de dilución en tubo: Primero se realizan diferentes diluciones del agente químico. El mismo volumen de cada dilución se dispensa en tubos estériles. A cada tubo se le añade la misma cantidad de una suspensión del microorganismo utilizado como prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere una alícuota de cada tubo a otro tubo que contenga medio de cultivo. Estos tubos inoculados se incuban a la temperatura óptima de crecimiento del microorganismo utilizado como prueba durante 24 a 48 horas. Al cabo de este tiempo se examina el crecimiento del microorganismo mediante la aparición de turbidez en el tubo (crecimiento +) o ausencia de turbidez (crecimiento -). Aquellos tubos que presenten crecimiento negativo indican la dilución a la cual ese agente químico mata al microorganismo utilizado como prueba cuando este microorganismo es expuesto al agente químico durante ese período de tiempo. Técnica de la placa de agar: Se inocula una placa que contenga medio de cultivo sólido con el microorganismo utilizado como prueba. El agente químico se coloca en el centro de la placa, bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de papel. Al cabo de 24 a 48 horas se observan zonas de inhibición alrededor del agente químico. Una modificación de esta técnica es la incorporación del agente químico en el medio de cultivo antes de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se inocula con el microorganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el crecimiento microbiano. Técnica del coeficiente fenólico: Es una técnica estandarizada que se utiliza para comparar el poder desinfectante de un agente químico frente al del fenol. Es una modificación de la técnica de dilución en tubo tal como se describe a continuación: (i) Se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes diluciones del desinfectante. (ii) A la vez se prepara una segunda serie de tubos que contengan diferentes diluciones de fenol. (iii) Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas del microorganismo utilizado como prueba. (iv) A los 5, 10 y 15 minutos se recoge una alícuota de cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio de cultivo estéril. (v) Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el crecimiento del microorganismo (aparición de turbidez). (vi) La mayor dilución del desinfectante que mate a los microorganismos en 10 minutos pero no los mate en 5 minutos se divide por la dilución mayor de fenol que dé los mismos resultados. El número obtenido es el coeficiente fenólico de ese desinfectante.

16 PRINCIPIOS DE LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN La desinfección de superficies inanimadas pueden llevarse a cabo por medio de agentes físicos o químicos ( desinfección domestica: pisos, paredes, muebles, equipos médicos, etc; desinfección de instrumentos quirúrgicos ). Durante la higiene debe minimizarse la turbulencia para prevenir la dispersión del polvo que puede contener microorganismos. Los productos de limpieza y desinfección deben seleccionarse en base a su uso, eficacia, aceptabilidad, seguridad y costo. La naturaleza de la contaminación microbiana, influye en los resultados de la desinfección química. Las bacterias, virus, esporas, hongos están presentes en el aire y la superficie del ambiente. La aplicación directa de la solución desinfectante ( domestico o inmersión de instrumental) es muy efectiva que por rocío con aerosol. La desinfección es inactivo en presencia de materia orgánica. No penetra los aceites o grasas adheridos al instrumental. Los desinfectantes deber ser bactericidas, pseudomonacida, fungida y esporocida. Para la desinfección de instrumental o equipos se seleccionaran las soluciones según nivel desinfección que uno quiere alcanzar. La calidad de los desinfectantes se controlará según sus especificaciones técnicas. El almacenamiento debe efectuarse en un lugar fresco ( temperatura inferior a los 25 C y oscuro, envases herméticos y tiempo de almacenamiento no debe superar los 120 días. PRINCIPIOS DE ESTERILIZACIÓN La selección del agente para el logro de una buena esterilización se basa especialmente en el material empleado. Las formas de resistencia, las esporas, requieren de un tiempo de esterilización crítico ( calor húmedo, calor seco, oxido de etileno, glutaraldehido activado y radiación ionizante). El calor húmedo en la forma de vapor saturado a presión es eficaz para la destrucción de todas las formas microbianas, incluso las esporas ( vapor a presión calor húmedo)..

17 La aplicación de altas temperaturas produce en el microorganismo desnaturalización proteica y desorganización de las membranas lipídicas. La presión mayor que la atmósfera es vital para acrecentar la temperatura del vapor y favorecer la destrucción microbiana por el calor. Al interactuar el vapor en la cámara de esterilización con artículos fríos se produce la condensación liberando calor, humedeciendo y calentando los productos en forma simultanea ( calor y humedad). Las formas vegetativas de la mayoría de las bacterias son destruidas en pocos minutos entre temperaturas de 54 y 65 C. Pero formas esporulados pueden resistir temperaturas de 115 C por mas de 3 horas. El vapor que entra a presión y permanece arriba del aire, desaloja el aire tanto de la cámara como del contenido del bulto por esterilizar forzando a salir a través del orificio de descarga. La esterilización por calor seco de microorganismos requiere de altas temperaturas para obtener el daño irreversible ( 160 C durante 2 horas). Los agentes químicos producen la disolución de la capa lipídica de las membranas celulares por acción de detergente, por alteraciones irreversibles de proteínas y ácidos nucleicos con desnaturalizantes, oxidantes. La velocidad de desinfección esterilizante aumenta con la concentración del compuesto y con la temperatura. No se consideran estériles los bordes de las envolturas una vez que se abren los sobres Los materiales ( batas, equipo y otros) húmedos se clasifican como contaminantes.

18 FLUJOGRAMAS Procedimiento Para Evaluar La Esterilidad Del Medio Ambiente Del Laboratorio Determinar la presencia de mohos y levaduras Abrir caja Agar saboreaud Exponer a ambiente 8, 16, 20, 24 min Incubar Determinar la presencia de bacterias Abrir caja 22ºC, 72-92horas Agar nutritivo Exponer a ambiente 8, 16, 20, 24 min Incubar 37ºC, 24-48horas Evaluar La Desinfección De Los Mesones Efectividad del hipoclorito de sodio Humedecer escobillón Frotar mesón Sembrar Incubar Desinfectar hipoclorito de sodio Frotar con otro escobillón

19 Sembrar Incubar Efectividad del alcohol al 70% Humedecer escobillón Frotar mesón Sembrar Incubar Desinfectar con alcohol al 70% Frotar con otro escobillón Sembrar Incubar Evaluar el poder antiséptico del fenol al 5% Empapar con escobillón cultivo líquido Sembrar Incubar 37ºC de 24 a 48h Empapar escobillón Cepa bacteriana Dejar en fenol al 5% 10min Sembrar en agar

20 Incubar a 37ºC de 24 a 48h Evaluar La Efectividad De La Esterilización En Un Cultivo Bacteriano Sembrar con asa Incubar 37ºC de 24 a 48h Sembrar con asa Incubar 62ºC por 30 min Sembrar con asa Incubar 90ºC por 10 min Evaluar El Isodine Como Antiséptico En La Piel Frotar antebrazo escobillón Sembrar Agar Sangre 37ºC de 24 a 48ºC Desinfectar antebrazo Isodine Frotar antebrazo escobillón Sembrar Agar Sangre Incubar 37ºC de 24 a 48h Evaluar La Contaminación De La Cavidad Oral caja de petri (Agar Sangre) Respirar y Espirar Incubar 37º de 24 a 48h

21 RESULTADOS EVALUAR LA ESTERILIDAD DEL MEDIO AMBIENTE DEL LABORATORIO Determinar la presencia de mohos y levaduras. (medio agar saboreaud ) Caja 1. Se expuso al ambiente durante 8 min. se observó 1 UFC, no presentó cambio de color el medio. (ver anexo 1) Caja 2. Se expuso al ambiente durante 16min. se observó 4 UFC amarillas y 3 UFC blancas. El medio se tornó opaco. (ver anexo 2) Caja 3. Se expuso al ambiente durante 24 min. se observó 5 UFC colonias blancas y 5 UFC amarillas. No presentó cambio de color el medio. (ver anexo 3) Caja 4. Se expuso al ambiente durante 30min. se observó tres colonias blancas y cuatro amarillas, sin cambio en el medio. (ver anexo 4) Determinar la presencia de bacterias. (medio agar nutritivo ) Caja 1. Se expuso al ambiente durante 8 min. se observó 2 UFC blancas, no presentó cambio de color el medio. Presencia de moho. (ver anexo 5) Caja 2. Se expuso al ambiente durante 16min. se observó 1 UFC blanca en el centro y variedad de estas en un extremo de la caja. No presentó cambio de color el medio. (ver anexo 6) Caja 3. Se expuso al ambiente durante 24 min. se observó 1 UFC blanca en el centro y variedad de estas en un extremo de la caja. No presentó cambio de color el medio. (ver anexo 7) Caja 4. Se expuso al ambiente durante 30min. se observó 1 UFC blanca, sin cambio en el medio. (ver anexo 8) EVALUAR LA DESINFECCIÓN DE LOS MESONES Efectividad del hipoclorito de sodio. (medio agar nutritivo ) Caja 1. Sin hipoclorito de sodio, se observó 3 UFC blancas y 1 UFC amarilla. (ver anexo 9)

22 Caja 2. Con hipoclorito de sodio, no presentó UFC. (ver anexo 10) Efectividad del alcohol al 70% (medio agar nutritivo) Caja 1. Sin alcohol, se observó 1 UFC blanca y 1 UFC amarilla. (ver anexo 11) Caja 2. con alcohol, se observó 3 UFC blancas. (ver anexo 12) Evaluar el poder antiséptico del fenol al 5% Sin fenol: Caja 1. En el medio EMB se sembró E. coli, se observaron siembras de color morado. No se pudo contar las UFC. (ver anexo 13) Caja 2. En el medio MacConkey se sembró Shigella. Las colonias eran de un color mas claro que el medio, este era naranja, casi no se distinguía el medio con la siembra, se denota un margen en ella que las diferencia. (ver anexo 14) Caja 3. En el medio BP, con S. aureus. Se observó siembra negra y medio verde oscuro. (ver anexo 15) Caja 4. En el medio endo C se sembró Proteus sp. esta se observó incolora y el medio fucsia. (ver anexo 16) Caja 5. En el medio cetrimide, con Pseudomona, se observó transparente. (ver anexo 17) Con fenol: No se observó crecimiento alguno en los diferentes medios y con las diferentes cepas utilizadas. (ver anexos 18 al 22) Evaluar la efectividad de la esterilización en un cultivo bacteriano Caja 1. En el medio EMB se sembró E. coli, se observaron siembras de color morado. No se pudo contar las colonias. (ver anexo 23) Caja 2. En el medio MacConkey se sembró Shigella. Las colonias eran incoloras. (ver anexo 24) Caja 3. En el medio BP, con S. aureus. Se observó siembra negras, lustrosas, convexas, con borde estrecho blanquecino, rodeado por un halo claro y medio verde oscuro. (ver anexo 25) Caja 4. En el medio endo C se sembró Proteus sp. Se observó el medio fucsia. (ver anexo 26)

23 Caja 5. En el medio cetrimide, con Pseudomona. No hubo crecimiento ni cambio del medio. (ver anexo 27) EVALUAR EL ISODINE COMO ANTISÉPTICO EN LA PIEL(agar sangre) Caja 1. Sin isodine. Se observó 15 UFC blancas y 8 UFC amarillas, el medio cambio de color se tornó de color café. (ver anexo 28) Caja 2. Con isodine. Se observó 1 UFC amarilla y 1 UFC mamon. Medio de color café. (ver anexo 29) EVALUAR LA CONTAMINACIÓN DE LA CAVIDAD ORAL(agar sangre) Caja 1. Se observó 2 UFC blancas, 1 UFC amarilla y 1 UFC mamon. El medio se tornó café. (ver anexo 30)

24 ANÁLISIS DE RESULTADOS EVALUAR LA ESTERILIDAD DEL MEDIO AMBIENTE DEL LABORATORIO La aparición de colonias indican la presencia de mohos y bacterias, esto se debe a que no hay un grado completo de esterilidad en el laboratorio ya sea, por que no se practican algunos principios de esterilización y desinfección. EVALUAR LA DESINFECCIÓN DE LOS MESONES Efectividad del hipoclorito de sodio. Debido a que no hubo aparición de colonias al utilizar el hipoclorito de sodio indica que es un método activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y además es efectivo en un amplio rango de temperaturas. Efectividad del alcohol al 70%. Debido a la aparición de colonias se considera la actividad del al alcohol poco efectivo. Este se considera con una rápida acción bactericida, actuando sobre bacterias gramnegativas y grampositivas, y virus con envuelta, siendo por tanto considerado como desinfectantes de bajo nivel. No destruyen esporas y tienen una acción germicida lenta. Evaluar el poder antiséptico del fenol al 5%. Se considera un desinfectante efectivo, pues no hubo aparición de colonias. La solución acuosa al 5% de fenol mata rápidamente a las células vegetativas de los microorganismos. Evaluar la efectividad de la esterilización en un cultivo bacteriano. Debido a las características que presentaron cada una de las siembras se puede decir que hay efectividad en la esterilidad de cada uno de los medios.

25 EVALUAR EL ISODINE COMO ANTISÉPTICO EN LA PIEL Debido a la presencia de UFC se considera poco efectivo, el isodine se considera como bactericidas de potencia intermedia, posee actividad frente a bacterias grampositivas y gramnegativas, pero tienen escasa actividad frente a micobacterias. Son activos frente a virus con y sin envoltura. Sin embargo, su actividad se reduce en presencia de sustancias alcalinas y materia orgánica. EVALUAR LA CONTAMINACIÓN DE LA CAVIDAD ORAL La presencia de UFC indica el crecimiento de gérmenes aerobios y anaerobios.

26 PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. Cómo actúa, desde el punto de vista químico, cada método de esterilización y desinfección? Alcoholes Los alcoholes permiten observar la interacción de los solventes orgánicos con las membranas lipídicas. Desorganizan la estructura lipídica por penetración en la región hidrocarbonada los alcoholes de cadena corta producen alteraciones cuantitativamente mayores en la organización de la membrana que los homólogos superiores. Los alcoholes y otros solventes orgánicos también desnaturalizan las proteínas celulares. Sin embargo, su acción como desinfectante para destruir esporas a temperaturas normales es muy limitada. Por esta razón no se debe confiar en ellos para a esterilización de los instrumentos. Es activo contra microorganismos grampositivos, gramnegativos y acidorresistentes y tiene mayor efectividad en concentraciones de 50-70% Halógenos Cloro y yodo: se encuentran entre los desinfectantes mas útiles. El yodo como desinfectante de la piel y el cloro como desinfectante del agua. Los compuestos de yodo son los halógenos mas eficaces disponibles para desinfección. El yodo es un elemento altamente reactivo que precipita las proteínas y oxida enzimas esenciales. Tiene actividad microbicida contra prácticamente todos los microorganismos, incluyendo bacterias esporuladas y micobacterias. La actividad microbicida de las soluciones de yodo no es afectada por la concentración del elemento ni por el ph, aunque su eficacia aumenta en soluciones ácidas debido a la liberación de mas yodo libre. El yodo actúa con mayor rapidez que otros halógenos y que los compuestos de amonio cuaternario. Sin embargo, la actividad del yodo puede disminuir en presencia de algunas sustancias orgánicas e inorgánicas, es necesario limpiar las superficies cutáneas antes de utilizar el yodo como desinfectante. El yodo existe principalmente en la forma de I 2 a valores de ph inferiores a 6, donde se manifiesta la acción bactericida máxima. El índice

27 germicida disminuye a medida que el ph se incrementa por encima de 7.5 las mezclas de yodo con diferentes agentes tensioactivos que actúan como transportadores para el yodo se conocen como yodóforos. Los transportadores son polímeros neutros que sirven no solo para aumentar la solubilidad del yodo sino también para proporcionar un reservorio de liberación sostenida de halógeno. Los hipocloritos y las eloraminas orgánicas e inorgánicas: la acción desinfectante de todos los compuestos clorados se debe a la liberación de cloro libre. En el agua pueden existir tres formas de cloro: cloro elemento (Cl 2 ), un oxidante muy fuerte, ácido hipocloroso (HOCl) e ión hipoclorito (OCl). El cloro puede actuar mediante oxidación irreversible de grupos SH en enzimas esenciales. Se cree que los hipocloritos interaccionan con componentes citoplasmáticos para formar derivados N-cloro tóxicos, capaces de interferir con el metabolismo celular. la eficacia del cloro es inversamente proporcional al ph, y la mayor actividad se obtiene a ph ácido. Eso está de acuerdo con la mayor eficacia del ácido hipocloroso comparado con el ión hipoclorito. La actividad de los derivados del cloro aumenta también con la concentración. El producto clorado más utilizado en desinfección es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y además es efectivo en un amplio rango de temperaturas. La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al ácido hipocloroso (HClO) y al Cl 2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua. La actividad germicida del ión hipocloroso es muy reducida debido a que por su carga no puede penetrar fácilmente en la célula a través de la membrana citoplasmática. En cambio, el ácido hipocloroso es neutro y penetra fácilmente en la célula, mientras que el Cl 2 ingresa como gas. Fenoles Estos germicidas se emplean ahora rara vez como desinfectantes. Sin embargo, tienen interés históricos debido a que fueron usados como patrón de comparación para evaluar la actividad de otros germicidas. La relación de la actividad germicida entre un compuesto bajo prueba y una concentración especifica de fenol proporcionada del coeficiente fenol.

28 El fenol no es esporicida a temperatura ambiente (pero si cuando la temperatura se aproxima a 100ºC) y resulta poco activo contra los virus no lipídicos. Se cree que el fenol actúa mediante alteración de las membranas que contienen lípidos, lo que conduce a fuga del contenido celular. los derivados fenólicos son activos contra bacterias normalmente resistentes, debido a que la pared celular de esos microorganismos tiene una concentración muy alta de lípidos. El contacto con los derivados fenólicos con productos alcalinos reducen en forma significativa su actividad, mientras que la halogenación de los fenólicos potencian su efecto. También aumenta la eficacia la introducción de grupos alifáticos o aromáticos en el núcleo de los fenoles halógenos. 2. Qué tipo de desinfectante utilizaría en las empresas alimentarias?, sustente su respuesta. Los hipocloritos son los compuestos clorados más útiles y se encuentran disponibles en forma líquida o en polvo, como sales de calcio, litio y sodio. Los hipocloritos se emplean en gran escala en la industrias láctea y alimenticia para el saneamiento del equipo utilizado en el procesamiento de alimentos. 3. Fundamento de las pruebas realizadas BAIRD PARKER AGAR Para el aislamiento y la diferenciación de estafilococos en materiales y materiales farmacéuticos. Este medio de cultivo contiene cloruro de lítio y telurito para la inhibición de la flora acompañante, en tanto que el piruvato y la glicocola actúan favoreciendo selectivamente el crecimiento de estafilococos. Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo, las colonias de estafilococos muestran dos características diagnósticas por lipólisis y proteolisis, se producen halos y anillos característicos y, debido a la reducción del telurito a teluro, se desarrolla una colonia negra. La reacción con la yema de huevo y la reducción del telurito se presentan con notable paralelismo con la coagulasa-positividad, y por tanto, pueden utilizarse como índice de esta última.

29 Colonias Negras, lustrosas, convexas, con borde estrecho blanquecino, rodeado por un halo claro. Negras, lustrosas, pero de forma irregular. Crecimiento ocasional: muy pequeñas, pardas hasta negras, ausencia de halos de clarificación. Pardo-oscuras, mates, presencia a veces de halos de clarificación. Blancas sin halos de clarificación. Microorganismos Staphilococcus aureus. Staphilococcus epidermis. Micrococcus. Bacillus. Levaduras. MacConkey Medio selectivo para BGN. Lactosa+indicador El agar MacConkey es una medio selectivo y diferencial para la detección de organismos coliformes y patógenos entéricos. La fórmula del agar MacConkey II se diseñó especialmente para mejorar su capacidad de inhibir el swarming de Proteus spp y para alcanzar una definitiva diferenciación entre fermentadores y no fermentadores de la Lactosa. Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración de sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relación con otros medios similares. Se incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos. La diferenciación de organismos entéricos se lleva a cabo con la combinación de Lactosa con el indicador Rojo neutro. Se producen colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y colonias sin color en caso contrario. LECTURA: colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentación de la Lactosa). Salmonella, Shigella, Pseudomonas colonias lactosa (+): rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas. E. coli (rosa/roja), E. aerogenes (rosa y mucosa) ENDO-C AGAR Medio selectivo para la demostración y aislamiento de E. Coli fecal y coliformes. El sulfito sódico y la fucsina inhiben a las bacterias grampositivas. E. Coli y coliformes consumen lactosa formando aldehído y ácido. Por otra parte, el aldehído libera fucsina a partir de la combinación fucsina-sulfito, lo cual da lugar a la coloración roja de las colonias. En el caso de E. Coli, esta reacción es tan intensa que la fucsina llega a

30 cristalizar y por este motivo, confiere a dichas colonias un brillo metálico estable, de reflejo verde (típico de la fucsina cristalizada). Las placas con medio de cultivo son claras y casi incoloras. Si una placa con medio de cultivo muestra, tras la solidificación, un tono rojo demasiado intenso, puede eliminarse dicho exceso de rojo añadiendo algunas gotas de una solución recién preparada al 10% de sulfito sódico anhidro. Por la acción del oxigeno atmosférico y debido a la consiguiente oxidación del sulfito, el medio de cultivo vertido en placas se vuelve paulatinamente rojo y, por lo tanto, inservible. Incluso conservando en la oscuridad y a la temperatura de nevera, solo es utilizable durante pocos días. AGAR SANGRE (= Tsa= Trypticase Soja Agar) medio enriquecido estándar El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, aunque no es medio de elección para anaerobios. Permite visualizar reacciones hemolíticas que producen muchas especies bacterianas. Tiene por base una fuente proteica (digeridos trípticos, digeridos proteicos de soja) con una pequeña cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro sódico y 5% de sangre. La aportación de caseína y peptonas de soja al agar de Tripticasa-soja hace el medio en muy nutritivo por el suministro de nitrógeno orgánico, particularmente aminoácidos y péptidos de cadena más larga. La presencia de estas peptonas en el medio permite el cultivo de una gran variedad de gérmenes aerobios y anaerobios que crecen rápidamente, así como los del género Candida. También permite el crecimiento de algunos gérmenes exigentes como Estreptococos, Pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella. El cloruro sódico proporciona electrolitos esenciales. La adición de sangre de carnero desfibrinada enriquece la base y lo hace un medio adecuado para realizar la prueba del factor CAMP. Permite así mismo determinar la capacidad de algunas bacterias de producir enzimas extracelulares que actúan sobre los glóbulos rojos, ya sea por lisis completa (hemólisis beta, produce un halo transparente alrededor de la colonia hemolítica), parcial (hemólisis alfa, coloración verdosa alrededor de la colonia) o por ausencia de alteración (hemólisis gamma).

31 La producción de hemolisinas por las bacterias depende de muchos factores ambientales como ph o atmósfera de incubación. Las muestras que puedan contener Brucella o Neisseria deben incubarse en atmósfera enriquecida en CO 2. Si se añade al medio el 0,5% de telurito potásico es muy útil par el cultivo y aislamiento selectivo de Corynebacterium diphteriae, Candida albicans, Listeria y estreptococos. formulación (según Becton Dickinson): AGAR SALADO DE MANITOL Es un medio selectivo y diferencial. AMS es selectivo porque contiene 7.5% de sal. Una alta concentración de sal promueve el crecimiento de algunos organismos mientras inhibe el crecimiento de otros. AMS es un medio diferencial porque contiene el azúcar manitol y el indicador de ph rojo de fenol. Los organismos que pueden fermentar el manitol liberan subproductos ácidos, que causan un cambio de color. El rojo de fenol presenta un color rojo cereza por arriba de ph 8.5, un color amarillo rojizo desde un ph 6.9 a 8.5, y un amarillo brillante por debajo de un ph de 6.9. Aunque tanto el Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureus puede tolerar el alto contenido de sal en el AMS, solamente S. aureus puede fermentar el manitol, causando que el rojo de fenol vire al amarillo. AGAR CETRIMIDE (agar selectivo para Pseudomonas) Para aislamiento y diferenciación de Pseudomonas aeruginosa, a partir de diversos materiales. La cetrimide (cetiltrimetilamonio bromuro), sirve para conseguir una notable inhibición de la flora acompañante. De acuerdo con una proposición hecha por Lowbury y Collins (1955), la concentración primitiva (0.1%) de la substancia inhibidora ha sido disminuida con el fin de interferir aun menos en el desarrollo de Pseudomonas. El desarrollo de color a cargo de Pseudomonas aeruginosa cursa sin obstáculo en este medio de cultivo. Las colonias de Pseudomonas aeruginosa forman un pigmento verde-azulado (piocianina) y son fluorescentes a la luz UV.

32 MEDIOS DE CULTIVOS SEGÚN SABOREAUD Para cultivo, aislamiento e identificación de hongos patógenos. Los medios de cultivo de este tipo que contienen glucosa son especialmente adecuados para dermatofitos, en tanto que para levaduras y mohos son preferibles los que contienen maltosa. Estos medios de cultivos facilitan el crecimiento óptimo de hongos, merced a concentraciones altas (2 ó 4%) de carbohidratos. No contienen ninguna substancia que actúe selectivamente sobre la flora indeseable de acompañamiento. Para inhibir el crecimiento de bacterias, se ajusta a 5.6 el valor de ph. Este efecto es potenciable ajustando el ph a valores extremos (cercanos a 3.5 ó a 10). AGAR NUTRITIVO - CALDO NUTRITIVO Se basa en contar el número de colonias desarrolladas en una placa de medio de cultivo sólido, donde se ha sembrado un volumen conocido de agua, transcurrido un tiempo y a una temperatura de incubación determinados. Transcurridas las 72 h (± 3 h) o las 48 h, según proceda en cada caso, contar todas las colonias desarrolladas en cada placa. Si se ha sembrado más de una dilución se seleccionará la que contenga entre 30 y 300 colonias, descartando las demás. El recuento no se efectuará en placas que contengan menos de 30 colonias, excepto en aquellas sembradas con agua sin diluir. El resultado se expresa como número de bacterias aerobias totales en 1ml en 72 h a 22 C o en 48 h a 37 C

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