XVII Jornadas Nacionales de Toxicología Clínica y VII de Toxicovigilancia

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1 XVII Jornadas Nacionales de Toxicología Clínica y VII de Toxicovigilancia Epidemia aguda laboral por Hg en Avilés. Control analítico de Biomarcadores y evolución. Pablo Fernández Rodríguez Dr. Ciencias Químicas Jefe Laboratorio D. Técnico INS

2 DETERMINACIÓN DE ELEMENTOS TRAZA Y ULTRATRAZA MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS CON FUENTE DE PLASMA DE ACOPLAMIENTO INDUCTIVO (ICP-MS)

3 QUÉ ELEMENTOS PUEDEN SER MEDIDOS MEDIANTE ICP-MS? TODOS a excepción de: Presentes en el plasma Elementos <5 amu o >260 amu No ionizables

4 PROPIEDADES DEL ICP-MS Gran capacidad multielemental (casi toda la Tabla Periódica) Bajos límites de detección (muy pocas ppt para la gran mayoría de los elementos) Amplio intervalo dinámico lineal Análisis muy rápidos (<5 minutos para un barrido multielemental completo) Espectros libres de interferencias espectrales (celda de colisión/reacción) Tolerancia a gran variabilidad de matrices Robustez Facilidad de acoplamiento de una técnica de separación cromatográfica al ICP-MS aumentando las aplicaciones de la técnica

5 CONCENTRACIONES EN PPM, PPB, PPT A QUÉ EQUIVALEN? 1ppm (parte por millón) 1ppb (parte por billón americano) 1ppt (parte por trillón americano) (= 1mg/L) (= 1 µg/l) (= 1 ng/l) 1 ppt =? 1 gota del elemento en 10 piscinas olímpicas de agua

6 ANÁLISIS DE MUESTRAS BIOLÓGICAS POR ICP-MS: PREPARACIÓN DE MUESTRA ORINA: Dilución 1: 10 (v/v) de la muestra en HNO 3 al 1% ó HNO 3 1% / HCl 0,5% SUERO: Dilución 1: 10 (v/v) de la muestra en H 2 O ultrapura SANGRE/PLASMA SANGUÍNEO/TEJIDOS: Digestión en horno de microondas 50 mg Tejido 1 ml Sangre + 1 ml HNO 3 conc. + 3 ml H 2 O 2 conc. + 3 ml Agua milliq POTENCIA 1600 W POWER 100 % RAMPA 10:00 min TEMPERATURA 175 ºC MANTENIMIENTO 4:30 min

7 ANÁLISIS CUALITATIVO O SEMICUANTITATIVO MEDIANTE ICP-MS ANÁLISIS CUALITATIVO Los espectros de masas son sencillos de interpretar, lo cual permite conocer los elementos presentes en una muestra, a partir de la identificación de sus isótopos y abundancias características. Ejemplo: 50 Cr (4,34%), 52 Cr (83,79%), 53 Cr (9,50%) y 54 Cr (2,37%). ANÁLISIS SEMICUANTITATIVO Permite una estimación rápida del contenido elemental de una muestra, con una exactitud del 50-80% lo cual es suficiente para muchos procesos de control. Requiere la adición a la muestra de una serie de estándares internos que permitan calcular la curva de respuesta del equipo. Ejemplo: 7 Li, 45 Sc, 69 Ga, 89 Y, 103 Rh, 115 In, 159 Tb, 165 Ho y 209 Bi.

8 CUANTIFICACIÓN DE ELEMENTOS ICP-MS: CALIBRACIÓN EXTERNA A 10 ppt Hg B 100 ppt As Calibrado: blanco+5 patrones con empleo de estándar interno ( 45 Sc, 89 Y, 159 Tb, 209 Bi ) C 100 ppt Se D 1180 ppm Na Intervalos de calibración: Hg (0,01 2ppb) Std Mode As (0,1 200 ppb) He Mode Se (0,1 200 ppb) H2 Mode Na (0, ppm) He Mode

9 ANÁLISIS DE ORINA Análisis directo de la muestra tras una dilución 1/10 (v/v) en 1 % HNO 3 /0,5 % HCl y adición de patrones internos

10 CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS PARA EL ANÁLISIS DE ORINA POR ICP-MS (I) Isótopo 7 Li 9 Be 52 Cr 51 V 55 Mn 59 Co 60 Ni 63 Cu 66 Zn 75 As 78 Se LOD= 3 RSDb c/sbr LOD (ng/l) min, n = 10 0,8 1,5 1,7 2,4 3,0 1,8 2,9 0,9 0,8 2,1 2,4 RSD (%) 20 min, n = 20 2,7 4,2 3,1 3,4 3,1 2,6 3,4 3,1 3,0 2,8 3,7 5 horas, n = 60 4,5 3,9 4,6 4,1 3,6 4,9 5,1 4,4 5,1 5,6 6,2 RSDb: Desviación estandar relativa de la intensidad del fondo (10 medidas), c: concentración el elemento en la disolución; SBR: relación señal/ruido

11 CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS PARA EL ANÁLISIS DE ORINA POR ICP-MS (I) Isótopo LOD (ng/l) RSD (%) 98 Mo 103 Rh 111 Cd 115 In 118 Sn 121 Sb 138 Ba 195 Pt 205 Tl 208 Pb 238 U 2 min 20 min, 5 hours n = 10 n = 20 n = ,8 2,8 5, ,2 3,3 4,8 8 2,4 3,2 3,9 4 0,5 3,0 3,7 19 1,6 3,2 5,8 6 1,1 2,6 5, ,5 0,7 2,8 1,9 4,1 3,8 3 0,6 2,1 2,3 2 0,7 2,3 2, ,2 2,2 3,2 LOD= 3 RSDb c/sbr RSDb: Desviación estandar relativa de la intensidad del fondo (10 medidas), c: concentración el elemento en la disolución; SBR: relación señal/ruido

12 CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS DEL ANÁLISIS DE SANGRE POR ICP-MS Límites de cuantificación (LOQs) calculados en sangre sin diluir: De 0,003 µg/l para 238 U hasta 0,1 µg/l para 69 Ga Recuperaciones De 1 µg/l a excepción de: 10 µg/l para B, Mn y Sr y de 200 µg/l para Cu y Rb obteniendo valores entre % Data: Peter Heitland, Helmut D. Koster, Medical Laboratory Bremen, Germany

13 Abundancia isotópica (%) DETERMINACIÓN DE ELEMENTOS TRAZA Y ULTRATRAZA MEDIANTE DILUCIÓN ISOTÓPICA (IDA-ICP-MS) Ni Nat Traz ,08 2, Isótopo a Isótopo b 60 26,22 3, ,14 91, Muestra (s) Trazador (sp) Mezcla (m) 62 3,63 1, ,93 0,10 Cs Análisis por dilución isotópica (IDA) ( - ) W a sp M s A sp R m R sp = Csp Ws Msp A b s (1 - Rm Rs) Midiendo la alteración de la relación isotópica frente a la natural se puede calcular la concentración de dicho elemento en la muestra

14 Error magnification factor Preparación de muestra 10 ml 1 ml suero/orina + 20 ml isótopos enriquecidos H 2 O f Optimización cantidad trazador Factor de magnificación de error ( R) ( R m R m (1 R R t t R s )(1 R ) m R s ) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Cu 65 enriquecido al 98,548 % 0,01 0, R m (63/65)

15 Análisis de materiales de referencia Determinación de elementos traza y ultratraza en suero por IDA-ICP-MS Seronorm: Trace Elements SERUM Level 2 Elemento Valor (ng/g) U exp Valor certificado (ng/g) Cr 5,40 0,15 4,0-6,4 Fe Cu Zn Se Cd (*) Hg 2,03 0,27 1,61-2,11 Pb 2,85 0,12 3,0 (*) (*) Valor informado

16 Ventajas de IDA-ICP-MS En la ecuación de la dilución isotópica no hay ningún parámetro que afecte a la sensibilidad instrumental, por lo que su variación (p.e. efectos de matriz, deriva de señal) no influye en la concentración final del elemento. Mejor exactitud y precisión de los análisis Disminución de los tiempos de análisis, con la ventaja que esto supone para laboratorios de rutina.

17 INTOXICACIÓN POR Hg (AZSA-ASTURIAS) ZnS (s) + 0.5O 2 ZnO (s) + SO 2 (g) Hg(s) + SO 2 (g) O 2 (g) + HgSO 4 (s) Hg (s) + H 2 SO 4 Hg 2+ + SO H + + 2e- Hg 2+ + Se + 2e - HgSe 3Hg Se + 2Cl - + 4e - 2HgSe.HgCl2 HgCl 2 + Hg Hg 2 Cl 2

18 INTOXICACIÓN POR Hg (AZSA-ASTURIAS) El Hg está presente en concentraciones altas (40-70%) en los sólidos de depuración húmeda del SO 2 : cloruro mercurioso (HgCl 2 ), precursor del metil-mercurio, sulfatos de mercurio y óxido de mercurio Los sólidos se recogen en espesadores en forma de lodos ( hollines de Hg ). Los trabajadores afectados se encargan de la manipulación y cambio de tubos de los intercambiadores de calor, llevando a cabo operaciones en caliente : corte con sierra radial, oxicorte o botado de tubos. Dada la volatilidad del Hg ese tipo de operaciones generan vapores de Hg. Lluvia intensa durante las operaciones (turnos de 12 horas): se cubren los intercambiadores con toldos, pero el agua provoca arrastres de depósitos de Hg desde cotas altas y contamina la ropa y el equipamiento Medidas de protección inadecuadas: mascarillas, ropa de trabajo El acceso al organismo se produce fundamentalmente por vía respiratoria, sin descartar la cutánea En definitiva, se trata de un fallo desde el punto de vista de la prevención.

19 DETERMINACIÓN DE Hg EN SANGRE Y ORINA MEDIANTE ICP-MS ICP-MS: AGILENT 7500 CX PREPARACIÓN DE MUESTRAS: - Orinas diluidas al menos 1:10 en HNO 3 1%+HCl 0,5%+200 ppb Au - La sangre se digiere con 1 ml HNO 3 +3ml H 2 O ml H 2 O ultrapura en horno de microondas y posteriormente se diluye con HNO 3 1%+HCl 0,5%+200 ppb Au CUANTIFICACIÓN MEDIANTE CALIBRACIÓN EXTERNA: - Blanco + 5 patrones con intervalo de calibración 0,5-10 ppb Hg - Isótopo monitorizado 201 Hg empleando como estándar interno 159 Tb - Patrones de calibración en HNO 3 1%+HCl 0,5%+200 ppb Au

20 CONCENTRACIÓN (mg/l) CONCENTRACIONES DE Hg EN SANGRE DE TRABAJADORES IMPLICADOS EN EL ACCIDENTE DE AZSA NIVELES DE Hg EN SANGRE TRABAJADOR 1 TRABAJADOR 2 TRABAJADOR 3 TRABAJADOR 4 TRABAJADOR 5 TRABAJADOR 6 TRABAJADOR 7 TRABAJADOR 8 1ª MEDICIÓN (04/12/2012) 2ª MEDICIÓN (11/12/2012) 3ª MEDICIÓN (30/01/2013) VLB = 10 ug/l

21 CONCENTRACIÓN (mg/24 horas) CONCENTRACIONES DE Hg EN ORINA DE TRABAJADORES IMPLICADOS EN EL ACCIDENTE DE AZSA NIVELES DE Hg EN ORINA TRABAJADOR 1 TRABAJADOR 2 TRABAJADOR 3 TRABAJADOR 4 TRABAJADOR 5 TRABAJADOR 6 TRABAJADOR 7 TRABAJADOR 8 1ª MEDICIÓN (04/12/2012) 2ª MEDICIÓN (11/12/2012) 3ª MEDICIÓN (30/01/2013) VLB =30 ug/24 horas

22 CONTENIDO DE Hg EN BIOPSIA (MUCOSA INTESTINAL) DE TRABAJADOR Nº1 Paciente con diarreas. Se le hace una colonoscopia que resulta ser normal. Se obtiene una biopsia de mucosa intestinal para su análisis (determinación de Hg). PREPARACIÓN DE MUESTRA (4,6 mg): - Digestión con 1 ml HNO 3 +3ml H 2 O ml H 2 O ultrapura en horno de microondas y posterior dilución con HCl para una concentración final de 1%HNO 3 +0,5%HCl +200 ppb Au, con adición de estándar interno ( 159 Tb) CUANTIFICACIÓN MEDIANTE CALIBRACIÓN EXTERNA: - Blanco + 5 patrones con intervalo de calibración 0,5-5 ppb Hg - Isótopo monitorizado 201 Hg empleando como estándar interno 159 Tb - Patrones de calibración en HNO 3 1%+HCl 0,5%+200 ppb Au 8,4 ppm Hg (µg/g)

23 RESUMEN DE ANÁLISIS DE MUESTRAS DE SANGRE Y ORINA DE TRABAJADORES DE AZSA NO IMPLICADOS EN EL ACCIDENTE Se analizaron muestras de 25 trabajadores Los niveles de Hg en orina estuvieron por debajo del valor de referencia (30 µg/g de creatinina). En sangre sólo tres de ellos mostraron concentraciones por encima del valor de referencia (10 µg/l): 16, 38 y 62 ppb.

24 ESPECIACIÓN ELEMENTAL Las especies de un elemento pueden influir en: Biodisponibilidad Toxicidad Movilidad medioambiental Por qué es inportante conocer las especies?

25 Response (CPS) TÉCNICAS INSTRUMENTALES EMPLEADAS EN ESPECIACIÓN Acoplamiento de una técnica de separación con un detector altamente sensible y selectivo (ICP-MS) GC ICP-MS LC Detector opcional a los convencionales CE P MPA IBH 2. H 2 P 3. EPA 4. DMH 5. PPA 6. EMP 7. IMP 8. D EH 9. IPH Time (min)

26 ESPECIACIÓN DE Hg EN ORINA MEDIANTE HPLC-ICP-MS Nebulizador y cámara de nebulización Antorcha ICP Cuadrupolo Bomba turbomolec. Bomba turbomolec. Controlador de gas Bomba rotatoria Ar gas Cromatógrafo de líquidos LC-ICP-MS es la técnica idónea para especies térmicamente inestable Acoplamiento sencillo mediante un capilar de PFA/PEEK al ICP-MS

27 Ino-Hg Etil Mercurio Metil Mercurio UKP CROMATOGRAMA DE UN PATRÓN DE MERCURIO ELEMENTAL, METIL MERCURIO Y ETIL MERCURIO CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS 2000 Count FASE ESTACIONARIA: - ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6 x 150 mm, 5 um) FASE MÓVIL: % (v/v) de mercaptoetanol % (m/v) de L-cisteína M de acetato amónico. - 5 % (v/v) de metanol grado HPLC FLUJO: 1 ml/min, en modo isocrático. TIEMPO DE ANÁLISIS: 12 minutos ( 201 Hg) TRATAMIENTO DE LA MUESTRA sec-> Inyección directa de la muestra. Dilución con fase móvil.

28 CROMATOGRAMAS DE MUESTRAS DE ORINA (TRABAJADOR Nº1) 5.0E4 1.0E4 Count Count 2.5E4 Trabajador 1 (3/12/2012) ~3 ppm Ino-Hg 5000 Trabajador 1 (5/12/2012) ~1 ppm Ino-Hg sec-> sec-> Count 500 Trabajador 1 (31/1/2013) ~200 ppb Ino-Hg Hg inorgánico sec->

29 CROMATOGRAMAS DE MUESTRAS DE ORINA (TRABAJADOR Nº1) 5.0E4 1.0E4 Count Count 2.5E4 Trabajador 1 (3/12/2012) ~3 ppm Ino-Hg 5000 Trabajador 1 (5/12/2012) ~1 ppm Ino-Hg sec-> sec-> Count Hg inorgánico 500 sec-> Trabajador 1 (31/1/2013) ~200 ppb Ino-Hg TODAS LAS MUESTRAS ANALIZADAS TANTO DE TRABAJADORES IMPLICADOS EN EL ACCIDENTE, COMO EN EL RESTO DE LA EMPRESA, MOSTRARON EL MISMO TIPO DE CROMATOGRAMA

30 CONCLUSIONES El ICP-MS es una técnica analítica de enorme potencial en el campo del análisis clínico para la determinación elemental a nivel de ultratrazas metálicas así como para la realización de estudios de especiación en aquellos casos en los que interesa conocer la forma físicoquímica en que se encuentran. La aplicación de esta técnica al análisis de muestras de orina y sangre de pacientes intoxicados por metales pesados (Hg) ha permitido conocer los niveles de exposición así como la identificación de la especie química responsable de la intoxicación (Hg inorgánico).

31 GRACIAS!! Contacto Web: Tf.:

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