11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : C12Q 1/70, C07H 21/04

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : C12Q 1/70, C07H 21/04 C12Q 1/68, A61K 39/21 G01N 33/69, A61K 39/42 A61K 31/70 //C12N /49 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Secuencias nucleotídicas procedentes del genoma de retrovirus del tipo VIH-1 y sus aplicaciones para la amplificación de los genomas de estos retrovirus y para el diagnóstico in vitro de las infecciones producidas por estos virus. k Prioridad: FR FR k 73 Titular/es: INSTITUT PASTEUR 2-28, Rue du Docteur Roux 7724 Paris Cédex, FR INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Moncany, Maurice y Montagnier, Luc ES T3 k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: Aviso: k 74 Agente: Carpintero López, Francisco En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 ES T3 2 3 DESCRIPCION Secuencias nucleóticas procedentes del genoma de retrovirus del tipo VIH-1 y sus aplicaciones para la amplificación de los genomas de estos retrovirus y para el diagnóstico in vitro de las infecciones producidas por estos virus. La presente invención se refiere a las secuencias nucleotídicas utilizables para la realización de técnicas de amplificación de secuencias nucleicas específicas de los retrovirus de la inmunodeficiencia humana del tipo VIH o del retrovirus de inmunodeficiencia del mono del tipo SIV. La invención se refiere en particular a la aplicación de estas secuencias a procedimientos diagnósticos in vitro en el hombre de la infección de un individuo con un retrovirus del tipo VIH (concretamente VIH-1 y/o VIH-2). El aislamiento y caracterización de los retrovirus agrupados bajos los nombres VIH-1 y VIH-2 han sido descritos en las solicitudes de patente europea n 8/ y n 87/0.1.4 respectivamente. Estos retrovirus se han aislado en muchos enfermos que presentan síntomas de linfoadenopatía o de síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Los retrovirus del tipo VIH-2 y del tipo VIH-1 se caracterizan por un tropismo por los linfocitos T4 humanos y por un efecto citopatógeno respecto a estos linfocitos mientras que se multiplican produciendo entre otras, poliadenopatías generalizadas y persistentes o SIDA. Otro retrovirus, denominado SIV-1, esta denominación sustituye a la denominación anterior conocida como STLV-III, ha sido aislado del mono macaco rhesus (M.D. DANIEL et al. Science, 228, 11 (198); N.L. LETWIN et al. Science, 2, 71 (198) bajo el nombre de STLV-IIImac ). Otro retrovirus, denominado STLV-III AGM (osiv AGM ) ha sido aislado de los monos verdes salvajes. Pero al contrario de lo que sucede con los virus presentes en el mono macaco rhesus, la presencia del STLV-III AGM no parece inducir una enfermedad del tipo SIDA en el mono verde africano. Por comodidad estos virus se denominarán en los sucesivo con la expresión SIV (la expresión SIV es la abreviatura inglesa de Simian Inmunodeficiency Virus (Virus de inmunodeficiencia del mono) eventualmente seguida de una abreviatura que designan la especie de mono en la que están presentes, por ejemplo MAC para el macaco o AGM para el mono verde africano (abreviatura de African Green Monkey ). Una cepa de retrovirus SIV-1Mac ha sido depositada en el C.N.C.M. el 7 de febrero de 1986 bajo el número I El objetivo del estudio de los retrovirus VIH-1 y VIH-2 ha conducido igualmente a la obtención de secuencias de ADN complementarias (ADNc) del ARN de su genoma. La secuencia nucleotídica completa de un ADNc de un retrovirus representativo de la clase VIH-2 (VIH-2 ROD) ha sido depositada el en el C.N.C.M. bajo el número n I-22, bajo el nombre de referencia LAV-2 ROD. Igualmente, WAIN HOBSON, SONIGO, COLE, DANOS y ALIZON en Cell (enero de 198) han descrito la secuencia nucleotídica completa de un ADNc de un retrovirus representativo de la clase VIH-1. Igualmente por comodidad, los virus del tipo VIH-1 y VIH-2 se designarán a veces en lo sucesivo con la expresión HIV. Los procedimientos de diagnóstico in vitro de las infecciones con los virus del tipo VIH-1 ó VIH-2 que actualmente existen se basan en la detección de anticuerpos ANTI-VIH-1 ó ANTI-VIH-2 eventualmente presentes en una muestra biológicas (biopsia) o en un fluido biológico, por ejemplo en un suero obtenido, a partir del paciente de estudio, poniendo en contacto este fluido biológico con extractos o antígenos del VIH-1 ó del VIH-2, en condiciones que permiten la producción eventual de una reacción inmunológica de estos extractos o antígenos con estos anticuerpos. Tales procedimientos de diagnóstico tienen el riesgo de dar falsos negativos, concretamente en el caso de una infección reciente de un individuo con el virus del tipo VIH. Las técnicas de amplificación génica representan una ayuda considerable para la puesta a punto de procedimientos diagnósticos in vitro especialmente sensibles de enfermedades virales. Entre estas técnicas 2

3 ES T de amplificación génica, se puede citar la técnica PCR (reacción en cadena de la polimerasa), como la descrita en las solicitudes de patente europea n 86/ de y n 87/0.3.4 del ó incluso la técnica citada Qβreplicasa descrita en Biotechonology, vol. 6, página 1197 (octubre 1988) y la que funciona mediante una ARN polimerasa (T7RNA polimerasa) descrita en la solicitud de patente internacional n WO89/00. Estas técnicas permiten mejorar la sensibilidad de detección de los ácidos nucleicos de los virus y requieren de la utilización de cebadores de síntesis específicos. Para la búsqueda de virus del tipo VIH la selección de cebadores constituye un problema. En efecto, debido al hecho de la gran variabilidad de secuencias nucleotídicas del genoma viral, un cebador para una secuencia conocida de un aislado dado de un virus del tipo VIH puede fallar en la amplificación de determinadas variantes virales del tipo VIH. Por otra parte, incluso si se elige un cebador en una región conservada del genoma de un virus VIH para otra, su buen funcionamiento no está asegurado y puede dar lugar a malos rendimientos de amplificación. La presente invención proporciona precisamente cebadores oligonucleotídicos que permiten, entre otros, la amplificación, concretamente con fines diagnósticos, del genoma de todos los virus del tipo VIH y SIV, con rendimientos considerados como máximos en el estado actual de la técnica y, sobre todo, evitándose la presencia de numerosas bandas específicas. Los cebadores de la presente invención son a la vez específicas de los virus del genoma VIH-1 y/o de los virus de los grupos VIH-2 y SIV y son insensibles a las variaciones del genoma de estos virus. La presente invención tiene por objeto cebadores oligonucleotídicos de aproximadamente a nucleótidos, utilizables para la amplificación genómica de los virus del tipo VIH-1 y/o del tipo VIH-2 y SIV. La invención se refiere a toda secuencia nucleotídica caracterizada porque su secuencia: - o se elige entre aquellas que están contenidas en una de las secuencias nucleotídicas que comprenden los genes gag, vpr y pol de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 ROD y SIV MAC o en los genes nef2, vif2 y vpx de los virus VIH-2 ROD y SIV MAC o en los genes env, nef1, vif1 y vpr de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal y VIH-1 Eli y más particularmente entre aquellos contenidos en las secuencias nucleotídicas definidas a continuación, - o (especialmente por las secuencias más largas) contiene una de las secuencias nucleotídicas anteriormente citadas procedentes del VIH-1 Bru o VIH-1 Mal o VIH-1 Eli o VIH-2 ROD o SIVMac, o contiene una secuencia nucleotídicas complementaria de una de estas últimas secuencias, entendiéndose que los nucleótidos suplementarios eventuales que desbordan la secuencia nucleotídicas del género en cuestión, en el lado de los extremos 3 ó, coinciden preferentemente con aquellos que se encuentran situados en los extremos ó 3 correspondientes al mismo sentido mismo de la secuencia completa de los virus de tipo VIH-1, VIH-2 ó del VIS MAC, anteriormente mencionados, - o si esta secuencia nucleotídica no es idéntica a una de las secuencias nucleotídicas anteriormente mencionadas, o no es complementaria de una de estas secuencias, es al menos susceptible de hibridarse con una secuencia nucleotídica procedente del virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli y/o con una secuencia nucleotídica procedente del virus VIH-2 ROD o SIV MAC anteriormente mencionada. La hibridación se puede efectuar a una temperatura de C ± 1 C, (preferentemente C ± 0, C) para un rendimiento máximo. La numeración de los nucleótidos mencionados posteriormente corresponde a la utilizada en el manual de referencia Human Retrovirus and AIDS 1989 editado por el Los Alamos National Laboratory New Mexico, USA. (Las secuencias de los virus VIH-1 Mal y VIH-1 Eli han sido descritas por MONTAIGNER, SONIGO, WAIN-HOBSON y ALIZON en la solicitud de patente europea n de ). Las secuencias de la invención se sintetizan en un sintetizador comercializado por Applied Biosystems (procedimiento fosforamidita) y en cualquier otro aparato que utilice un procedimiento similar. La invención se refiere más especialmente a las secuencias nucleotídicas caracterizadas por los encadenamientos nucleotídicos siguientes (representados en los sentidos -> 3 ; las iniciales S y AS indican si el oligonucleótido es sentido o antisentido, es decir, si el oligonucleótido está orientado respectivamente en el sentido o-> 3 o en el sentido 3 o-> ): 3

4 ES T3 1 ) las secuencias comunes a los genomas del virus VIH-1, VIH-2 y SIV (las series de cifras espaciadas con un trazo indican la posición de los nucleótidos sobre los genomas correspondientes a los virus VIH-1, Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 ROD y SIV): secuencias específicas del gen gag del genoma de los virus anteriormente mencionados (gen que codifica para un grupo de antígenos específicos del nucleoide de estos virus). Pueden introducirse determinadas variantes sobre determinadas posiciones de las secuencias nucleotídicas citadas posteriormente, sin que las propiedades de hibridación de estas secuencias nucleotídicas con los genes de los virus del tipo VIH y/o SIV se vean afectadas. Las secuencias nucleotídicas que llevan estas variantes están representadas debajo de las secuencias nucleotídicas iniciales de las cuales derivan por sustitución de una o varias bases. Las bases modificadas en relación a las de las secuencias nucleotídicas iniciales están indicadas en mayúscula en vertical con las posiciones correspondientes a las bases que han sido sustituidas en estas secuencias iniciales, mientras que las bases de las secuencias iniciales que no han podido ser reemplazadas en las secuencias que llevan estas variantes están indicadas por puntos. La síntesis de cebadores se hace utilizando todas las variantes simultáneamente. En los ensayos se utiliza la mezcla de todas las variantes para una secuencia dada

5 ES T ) secuencias comunes a los genomas de los virus VIH-2 y SIV (las series de cifras espaciadas con un trazo indican la posición de los nucleótidos sobre los genomas correspondientes respectivamente a los virus VIH-2 ROD y SIV-MAC).

6 ES T ) Secuencias comunes a los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal y VIH-1 Eli (las series de cifras espaciadas con un trazo indican la posición de los nucleótidos sobre los genomas correspondientes respectivamente a los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal y VIH-1 Eli. 0 6

7 ES T La invención tiene igualmente por objeto las secuencias (o cebadores) que poseen una estructura nucleotídica complementaria a las de los cebadores definidos a continuación. 7

8 ES T La invención se refiere igualmente a las secuencias nucleotídicas que presentan determinadas mutaciones en relación a las definidas anteriormente sin que las propiedades de hibridación, como las definidas anteriormente, de estas secuencias se modifiquen. El porcentaje de nucleótidos diferentes de los que constituyen las secuencias descritas anteriormente, sin afectar a las propiedades de hibridación de las secuencias de la invención, puede llegar hasta el %. De forma general, en el caso de un cebador (primer) en sentido (S), se tolerarán una mayor número de mutaciones en el extremo que en el extremo 3 del cebador, debiéndose hibridar perfectamente el extremo 3 con una hebra determinada de una secuencia nucleotídica para permitir la amplificación de esta secuencia. En el caso de un cebador antisentido (AS), la tolerancia está permitida en el extremo 3. La invención tiene igualmente por objeto los cebadores como los definidos anteriormente y que implican la conservación de al menos bases de cada lado, siendo la parte intermedia la que lleva las modificaciones, sin que las propiedades de hibridación anteriores se vean modificadas. Una de las características de los cebadores oligonucleotídicos de la invención es dar una banda de amplificación clara, desprovista generalmente de bandas no específicas, utilizando las indicaciones técnicas de utilización descritas en la presente invención. Este hecho es debido a la longitud los cebadores, los cuales pueden tener hasta 27 bases, lo que aumenta la especificidad de hibridación, así como las condiciones drásticas de utilización que permiten eliminar las asociaciones parásitas. La especificidad para cada tipo de virus es función, además del porcentaje de homología con la matriz de referencia, de la longitud de los cebadores, pudiendo llegar hasta bases para un rendimiento aceptable. La invención se refiere igualmente a los cebadores como los descritos anteriormente unidos a nivel de su extremo a un promotor para la realización de un procedimiento de amplificación genómica mediante la síntesis de múltiples copias de ADN o ARN, como la descrita en la solicitud de patente europea n 88/7.2.9 de La invención tiene claramente por objeto la utilización de los cebadores descritos anteriormente para la realización de un procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleicas del virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o VIS, siendo este procedimiento aplicable al diagnóstico in vitro de la infección potencial de un individuo con un virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2 o de un animal con al menos uno de los tres virus (VIH-1, VIH-2, SIV). Este procedimiento de diagnóstico in vitro de la invención se realiza a partir de una muestra biológica (por ejemplo un fluido biológico como suero, linfocitos de sangre circulante) obtenida del paciente de estudio y que comprende principalmente las etapas siguientes: - una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar que pertenece al genoma del virus del tipo VIH- 1 y/o VIH-2 y/o SIV eventualmente presente en la muestra biológica anteriormente mencionada, y dado el caso, una etapa de tratamiento mediante una transcriptasa inversa de dicho ácido nucleico, si este último está enformadearn, conelfindeobtenerunácido nucleico de doble hebra (designándose esta última etapa como etapa de retrotranscripción del ARN viral), - un ciclo que comprende las etapas siguientes: desnaturalización del ácido nucleico de doble hebra a detectar, lo que conduce a la formación de un ácido nucleico de hebra simple, hibridación de cada una de las hebras de ácido nucleico, obtenidas durante la etapa de desnaturalización precedente, con al menos un cebador según la invención, mediante la puesta en contacto de las hebras anteriormente mencionadas con al menos una par de cebadores según la invención en las condiciones de hibridación definidas más abajo, la formación a partir de los cebadores de los ADN complementarios de las hebras sobre las cuales hibridan en presencia de un agente de polimerización (ADN polimerasa) y de cuatro nucleósidos trifosfato (dntp) diferentes, lo que conduce a la formación de un número mayor de ácidos nucleicos de doble hebra a detectar que en la etapa de desnaturalización precedente, repitiéndose este ciclo un número de veces determinado para obtener dicha secuencia nucleica a detectar, eventualmente presente en la muestra biológica en una proporción suficiente para permitir su detección, - una etapa de detección de la eventual presencia del ácido nucleico perteneciente al genoma del virus deltipovih-1y/ovih-2y/osivenlamuestrabiológica. 8

9 ES T3 La etapa de hibridación descrita anteriormente se realiza ventajosamente a C durante 1 minuto y segundos en tampón X buffer, cuya composición (en concentración final de utilización) se indica posteriormente. El procedimiento diagnóstico in vitro de la invención puede realizarse o a partir del ARN viral o a partir del ADN complementario, episomial o integrado. En efecto, los genomas de los virus VIH y SIV se presentan en forma de ARN o de ADN en función de la localización del virus en el organismo. Cuando el virus está situado en el interior de las células del organismo, concretamente en el interior de las células sanguíneas, su ARN se vuelve a copiar en ADN mediante una transcriptasa inversa. Por el contrario, el genoma del virus de tipo VIH en medio extracelular, concretamente en la sangre, está en forma de ARN. La etapa de extracción según la invención del ADN viral contenido en las células de la muestra biológica preconizada por los inventores, distinta del procedimiento clásico del fenol cloroformo, presenta las etapas siguientes: suspensión del residuo celular en 0, ml de agua pirolizada en un chupón Potter. ruptura de las células por ida y vuelta, adición de Triton X0 para 1 concentración final de 0,1 %, 2 desnaturalización con calor durante a 2 minutos a 0 C, centrifugación corta para eliminar los desechos celulares, precipitación del ADN durante la noche a - Cañadiendo 2, volúmenes de etanol absoluto y % del volumen final de acetato sódico 3 molar. A continuación el ADN se recupera, después se resuspende en agua y después de haber sido lavado 2 veces con etanol a 70 C conjuntamente el ADN y el ARN, lo que permite la detección del mensaje genómico de los virus de los tipos VIH y VIS utilizando el procedimiento denominado PCR directe ADN o por el denominado PCR-ARN. La etapa de extracción del ARN viral se realiza generalmente según el procedimiento clásico conocido por el experto en la técnica. Después de la extracción del ARN, es necesario llevar a cabo una etapa suplementaria de transformación del ARN monohebra en ADN de doble hebra, mientras que el diagnóstico in vitro de la invención se realiza a partir de muestras biológicas que contienen los virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o SIV, cuyos genomas están en forma de ARN. Esta transformación del ARN en ADN se realiza mediante tratamiento del ARN obtenido después de la extracción de la muestra biológica, especialmente del suero, en un medio apropiado mediante una transcriptasa inversa. La invención tiene además particularmente, entre otros, por objeto un procedimiento de diagnóstico in vitro, como el definido anteriormente, en el cual la etapa de retrotranscripción del ARN viral se realiza de la manera siguiente: -µg delarnextraído resuspendido en agua se pone en presencia de un par de cebadores con una concentración de µm cada uno de ellos, en un volumen final de µl. El conjunto se desnaturaliza a 0 C durante minutos, después se sumerge en agua helada, -seañaden µl de la mezcla siguiente: µl deltampón X buffer descrito posteriormente + 1 unidad de transcriptasa inversa (de AMV (Avian Myeloblastosis Virus) o del MuMLV (Moloney Leukemia Virus)) + 1 unidad de Taq polimerasa + 1 µl de mezcla de los 4 dntp, a razón de 2 mm cada uno + agua c.s.p. µl. El volumen final es de 0 µl. Esta reacción tiene lugar en dos etapas: - a) primera etapa: fabricación del ADNc por acción de la transcriptasa inversa a 42 C durante 13 minutos, 9

10 ES T3 - b) segunda etapa: amplificación génica clásica: se calienta a 9 C durante 3 minutos para destruir la transcriptasa inversa y permitir la etapa de deshibridación/hibridación, a continuación se inicia el ciclo descrito anteriormente para la amplificación génica. 2 La invención tiene además particularmente por objeto un procedimiento de diagnóstico in vitro, como el descrito a continuación, en el cual la etapa de desnaturalización se realiza en presencia de un cebador(es) (o primers) de la invención. En efecto, como se ha precisado anteriormente, una de las características de los oligonucléotidos (o primers) de la invención es dar una banda de amplificación clara, desprovista generalmente de bandas específicas, utilizándose éstas en las condiciones siguientes: - hibridación: los cebadores (1 µl de una solución µmolar) de cada cebador) se ponen en presencia del ADN molde (0 a 0 ng) para la primera etapa de desnaturalización-reasociación; se calienta durante minutos a 0 C, a continuación se sumergen los tubos que contienen esta mezcla de ADN-molde y los cebadores en el agua con hielo con el fin de aumentar la tasa de reasociación del ADN molde/cebadores. Los cebadores deben utilizarse en una concentración final en la etapa de amplificación siguiente de 0,8 µm cada uno. - amplificación: se añade al medio anterior los 4 dntp, cada uno de ellos a 0, µmolar en solución final (0 µl) y una unidad de Taq-polimerasa para un medio de reacción de 0 µl; esta etapa se realiza en un tampón de amplificación de la presente invención generalmente denominado X buffer, cuya composición (cuando está diluida a 1/) es la siguiente: Tris-HCl, ph 8,9: 0 mm; (NH 4 ) 2 SO 4 : mm; MgCl 2 :mm;β-mercapto-etanol: mm, gelatina: 0,2 mg/ml. Se añaden µl deestetampón y agua c.s.p. 0 µl al medio anterior. Los ciclos de amplificación se realizan de la manera siguiente: a ciclos compuestos de: 94 C durante segundos (desnaturalización), C durante 1 minuto (hibridación), 78 C durante 1 minuto (elongación). A todo ello le sigue un ciclo único a 78 C durante minutos La precisión de las temperaturas indicadas a aproximadamente ± 0,3 C, así como su estabilidad durante los diferentes ciclos, representan condiciones esenciales para la obtención de rendimientos máximos, así como la ausencia de bandas específicas. La concentración óptima de ADN es de 0 a 0 ng para el ADN genómico extraído de las células (de pacientes o en cultivo, de mamíferos o de otros). Se sobrentiende que las condiciones anteriores representan condiciones óptimas para un medio de reacción final de 0 µl y que estas condiciones pueden modificarse en función del volumen final del medio de reacción. La utilización de varias parejas de cebadores diferentes (o cócteles de parejas) de la invención permite o la detección cruzada de varios tipos de virus del tipo VIH y/o SIV, o la detección simultánea de varios genes de un mismo virus del tipo VIH y/o SIV. Atítulo de ejemplo de parejas de cebadores preferidos utilizables en el marco de la presente invención, se pueden citar las parejas de cebadores siguientes: - MMy1-MMy4, MMy2-MMy4, MMy1-MMy3, MMy18-MMy19, MMy4bis-MMy28bis, MMy28- MMy29bis, MMy29-MMybis, MMy31-MMy32bis, concretamente para el diagnóstico in vitro de la infección de un individuo con VIH-1 y/o VIH-2 - MMy-MMy8, MMy6-MMy8, MMy7-MMy8, MMy-MMy7bis, MMy6-MMy7bis, MMy9-MMy11, MMy-My11, MMy9-MMybis, MMy26-MMybis, MMy8bis-MMy9bis, MMy8bis-MMy89, MMy89bis-MMy9bis, MMy-MMy17, MMy-MMy16bis, MMy16-MMy17, MMy2-MMy27, MMy26-MMy27, concretamente para el diagnóstico in vitro de la infección de un individuo con el VIH-1, - MMy-MMy22, MMy-MMy21bis, MMy21-MMy22, MMy23-MMy24, MMy12-MMy14, MMy12- MMy13bis, para el diagnóstico in vitro de la infección de un individuo con el VIH-2.

11 ES T3 El agente de polimerización utilizado en la etapa de elongación del ciclo es una ADN polimeasa termoestable, concretamente la Taq polimerasa, la amplificasa de la empresa Appligéne como ADN polimerasa termoestable disponible comercialmente. 2 3 El procedimiento de diagnóstico in vitro de la invención permite igualmente, en función de las parejas de cebadores nucleotídicos utilizadas, detectar selectivamente los genes de los virus del tipo VIH y/o SIV presentes en la muestra biológica. Las parejas de cebadores utilizables a título de ejemplo para el procedimiento diagnóstico gen por gen anteriormente mencionado de la invención son las siguientes: - MMy1-MMy4, MMy2-MMy4, MMy1-MMy3, MMy4bis-MMy28bis para el gen gag, - MMy18-MMy19 para el gen vpr, - MMy-MMy8, MMy6-MMy8, MMy7-MMy8, MMy-MMy7bis, MMy6-MMy7bis, MMy26- MMybis, MMy8bis-MMy9bis, MMy8bis-MMy89, MMy89bis-MMy9bis para el gen env, - MMy9-MMy11, MMy9-MMybis, MMy-MMy11 para el gen nef1, - MMy-MMy17, MMy-MMy16bis, MMy16-MMy17, para el gen vif1, - MMy-MMy22, MMy-MMy21bis, MMy21-MMy22 para vif2, - MMy23-MMy24, para vpx, - MMy12-MMy14, MMy12-MMy13bis, MMy13-MMy14 para nef2, - MMy2-MMy27, MMy26-MMy27 para el gen vpu, - MMy28-MMy29bis, MMy29-MMybis, MMy-MMy31bis, MMy31-MMy32bis para el gen pol. En cualquier caso, las combinaciones entre cebadores S y AS descritos anteriormente no representan limitaciones y pueden variarse según el deseo del usuario. En las tablas I a XI siguientes figuran, a título de ejemplo, los trozos de fragmentos nucleotídicos sintetizados con la ayuda de las parejas de cebadores anteriormente mencionados. (las cifras indicadas en las tablas siguientes representan el número de nucleótidos de los fragmentos sintetizados y las rayas indican que las parejas de cebadores ensayados no permiten la caracterización de las cepas virales correspondientes. TABLA I gag gag 4 MMy1-MMy3 MMy1-MMy4 MMy2-MMy4 MMy4bis-MMy28bis HIV1-BRU HIV1-MAL HIV1-ELI HIV2-ROD SIV

12 ES T3 TABLA II env env MMy-MMy7bis MMy-MMy8 MMy6-MMy7bis MMy6-MMy8 HIV1-BRU HIV1-MAL HIV1-ELI HIV2-ROD SIV TABLA III env env 2 MMy7-MMy8 MMy26-MMybis MMy8bis-MMy9bis HIV1-BRU HIV1-MAL HIV1-ELI HIV2-ROD SIV TABLA IV env env 4 MMy8bis-MMy89 MMy89bis-MMy9bis HIV1-BRU HIV1-MAL HIV1-ELI HIV2-ROD - - SIV

13 ES T3 TABLA V nef1 nef1 MMy9-MMybis MMy9-MMy11 MMy-MMy11 HIV1-BRU HIV1-MAL HIV1-ELI HIV2-ROD SIV TABLA VI nef2 nef2 2 MMy12-MMy13bis MMy12-MMy14 MMy13-MMy14 HIV1-BRU HIV1-MAL HIV1-ELI HIV2-ROD SIV TABLA VII vif1 vif1 4 MMy-MMy16bis MMy-MMy17 MMy16-MMy17 HIV1-BRU HIV1-MAL HIV1-ELI HIV2-ROD SIV

14 ES T3 TABLA VIII vpr vif2 MMy18-MMy19 MMy-MMy21bis MMy-MMy22 HIV1-BRU HIV1-MAL HIV1-ELI HIV2-ROD SIV TABLA IX 2 vif2 MMy21-MMy22 vpx MMy23-MMy24 HIV1-BRU HIV1-MAL - - HIV1-ELI - - HIV2-ROD SIV TABLA X vpu pol 4 MMy2-MMy27 MMy26-MMy27 MMy28-MMy29bis HIV1-BRU HIV1-MAL HIV1-ELI HIV2-ROD SIV

15 ES T3 TABLA XI pol pol MMy29-MMybis MMy-MMy31bis MMy31-MMy32bis HIV1-BRU HIV1-MAL HIV1-ELI HIV2-ROD SIV Hay que señalar que gracias a su disposición en el genoma, los cebadores que sirven para la amplificación pueden combinarse de tal forma que pueden utilizarse como sonda, o después de marcaje con 32 P por quinación, o para la utilización en la técnica de sondas frías para verificar la especificidad de la banda de amplificación observada durante un análisis de transferencia Southern. Además de la combinación clásica de cebadores, para que un tercer oligonucleótido pueda servir de sonda interna específica, hay que citar el caso particular de los genes vifl/vpr y vif2/vpx debido a la sobreposición de estos genes; lo cual permite una detección cruzada. Además de para un análisis por secuenciación del ADN amplificado, estos oligonucleótidos pueden utilizarse como cebador específico para la ADN polimerasa, permitiendo una doble secuenciación en cada sentido, por lo tanto una doble lectura de secuencias, evitando así eventuales ambigüedades de interpretación. La invención tiene igualmente por objeto los cebadores, como se definen a continuación, marcados, concretamente radiactivamente o enzimáticamente, así como su utilización como sondas nucleotídicas, concretamente en el marco del procedimiento diagnóstico in vitro, como el descrito anteriormente. La invención tiene igualmente por objeto los oligonucleótidos como los descritos anteriormente y que incluyen azúcares en conformación α. Dichos oligonucleótidos presentan la característica de invertir el sentido de la doble hélice formada con el molde (hebra de genoma del virus), pasando así esta doble hélice del estado S al estado AS. La invención se refiere igualmente a los oligonucleótidos descritos anteriormente, entre los cuales algunos nucleótidos están metilados y/o tienen uno o varios átomos de azufre, concretamente sobre las adeninas. Tales oligonucléotidos poseen la característica de aumentar la estabilidad de la doble hélice y, por consiguiente, se hibridan mejor con la hebra de ADN a amplificar. La invención se refiere igualmente a los oligonucléotidos como los descritos anteriormente y que están en la forma conocida como de bases modificadas, que poseen nucleótidos sobre las cuales están unidos de forma covalente agentes cromóforos (moléculas aromáticas planas, como el naranja acridina), concretamente según el procedimiento descrito en el artículo de C. Hélène publicado en La vie des Sciences, serie general, tomo 4, n 1, página Dichos oligonucleótidos poseen la característica de ser fácilmente detectables, concretamente por fluorescencia. Los oligonucleótidos de la invención se utilizan igualmente para la realización de un procedimiento diagnóstico in vitro de la infección de monos (macaco, mono de mangabey o mono verde) con el virus del tipo SIV, recogiendo este procedimiento las principales característicos del descrito anteriormente. La invención tiene igualmente por objeto los estuches o equipos de diagnóstico para la realización de los procedimientos diagnósticos in vitro anteriormente mencionados. A título de ejemplo, un estuche de diagnóstico de la presente invención comprende: - al menos una pareja de cebadores oligonucleotídicos según la invención, comprendiendo cada pareja un cebador que hibrida con una de las hebras de la secuencia de ácido nucleico a detectar y un cebador que se hibrida con la hebra complementaria de este último en las condiciones definidas anteriormente,

16 ES T3 - reactivos apropiados para la realización del ciclo de operación de amplificación, concretamente la ADN polimerasa y cuatro nucleótidos trifosfato diferentes y el medio de reacción denominado X buffer descrito anteriormente una (o varias) sondas que pueden estar marcadas, concretamente con radiactividad o mediante la técnica de las sondas frías,capazdehibridarseespecíficamente con la (o las) secuencia(s) de ácidos nucleicos amplificada(s) a detectar. La invención se refiere también a la utilización de los cebadores de la invención indicados anteriormente para la realización de un procedimiento de síntesis de proteínas codificadas por las secuencias nucleotídicas amplificadas mediante la ayuda de estos cebadores. A título ilustrativo, este procedimiento de síntesis de proteínas comprende la amplificación de secuencias nucleotídicas de genomas de virus del tipo VIH o SIV (que codifican para una proteína determinada y que, dado el caso, ha sufrido determinadas modificaciones de sus nucleótidos) mediante la puesta en contacto de dichas secuencias con al menos una pareja de cebadores según la invención en las condiciones descritas anteriormente, seguido de la traducción de estas secuencias así amplificadas en proteínas; esta última etapa se realiza especialmente por transformación de células hospedadoras apropiadas mediante vectores que contienen dichas secuencias amplificadas y recuperación de las proteínas producidas en estas células hospedadoras. La invención concierne igualmente a los polipéptidos obtenidos de la traducción de las secuencias (o cebadores) nucleotídicos de la invención. La invención tiene igualmente por objeto la utilización de cebadores oligonucleotídicos antisentido como agentes antivirales en general, concretamente en la lucha contra el SIDA, así como las composiciones farmacéuticas que contienen estos cebadores antisentido en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención se refiere igualmente a las composiciones inmunógenas que contienen uno o varios productos de traducción de las secuencias nucleotídicas según la invención y/o uno o varios productos de traducción de las secuencias nucleotídicas amplificadas según los procedimientos descritos anteriormente, a partir de cebadores definidos según la invención, estando estos productos de traducción asociados a un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención se refiere a los anticuerpos dirigidos contra uno o varios de los productos de traducción descritos anteriormente (o en otros términos, susceptibles de formar una reacción inmunológica con uno o varios productos de traducción de las secuencias nucleotídicas según la invención, o incluso uno o varios productos de traducción de las secuencias nucleotídicas amplificadas a partir de cebadores definidos según la invención) y su utilización para la realización de procedimientos diagnósticos in vitro de la infección de un individuo con un virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2 o de un animal con al menos uno de los tres virus (VIH-1, VIH-2, SIV) según los procedimientos conocidos por el especialista en la técnica. A título ilustrativo, un procedimiento diagnóstico in vitro de este tipo según la invención comprende la puesta en contacto de una muestra biológica (concretamente suero) extraído del paciente en estudio, con los anticuerpos según la invención y la detección mediante cualquier procedimiento apropiado (concretamente mediante antiinmunoglobulinas marcadas) de los complejos inmunológicos formados entre los antígenos de los virus del tipo VIH o SIV eventualmente presentes en la muestra biológica y dichos anticuerpos. La invención tiene igualmente por objeto los estuches de diagnóstico in vitro que contienen anticuerpos según la invención, y dado el caso, los reactivos apropiados para la detección de la reacción inmunológica formada entre dichos anticuerpos y los antígenos de los virus VIH o SIV. La invención contempla igualmente un procedimiento de preparación de los polipéptidos mencionados anteriormente, concretamente de aquellos que se corresponden según el código genético universal a las secuencias (o cebadores) nucleotídicas descritas anteriormente, estando este procedimiento caracterizado porque, partiendo preferentemente del aminoácido C terminal, se condensan sucesivamente dos a dos los aminoácidos sucesivos en el orden requerido, o los aminoacilos y los fragmentos formados previamente y que contienen ya varios residuos aminoacilos en el orden apropiado, o incluso varios fragmentos previamente preparados así, entendiéndose que se tendrá cuidado de proteger antes todas las funciones reactivas que llevan estos aminoacilos o fragmento, excepto las funciones amina de uno y las carboxilo del otro o viceversa, que normalmente son las que intervienen en la formación de enlaces peptídicos, concretamente 16

17 ES T3 después de la activación de la función carboxilo, según los procedimientos conocidos en la síntesis de péptidos y a continuación, paso a paso, hasta el aminoácido N-terminal. 2 3 Por ejemplo, se recurrirá a la técnica de la síntesis peptídica en solución homogénea descrita por Houbernueyl en Methode der organischen Chemie (Procedimientos de química orgánica) editado por E. Wunsch, vol. -I y II, THIEME, Stuttgart 1974, o a la síntesis peptídica en fase sólida descrita por R.D. Merrifield en Solid phase peptide synthesis (J. Am. Chem. Soc., 4, ). La invención se refiere igualmente a un procedimiento de preparación de secuencias (o cebadores) nucleotídicas descritas anteriormente, comprendiendo este procedimiento las etapas siguientes: - incubación del ADN genómico, aislado a partir de uno de los virus del tipo VIH o SIV anteriormente mencionados, con la ADNasa I, seguida de adición de EDTA y purificación mediante extracción en la mezcla fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (2/24 1) y después en éter, - tratamiento del ADN así extraído con la Eco R1 metilasa en presencia de DTT y purificación mediante extracción como la descrita anteriormente, - incubación del ADN así purificado con los 4 desoxinucleótidos trifosfato datp, dctp, dgtp y dttp en presencia de ADN polimerasa T4 y ADN ligasa de E. coli, seguida de purificación según el procedimiento descrito anteriormente, -la clonación de los ácidos nucleicos así obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido nucleico investigado mediante una sonda apropiada. Un procedimiento de preparación especialmente ventajoso de las secuencias nucleotídicas de la invención comprende las etapas siguientes: -lasíntesis de ADN utilizando el procedimiento automatizado de la β-cianetil fosforamidita descrita en Bioorganic Chemistry 4; (1986), -la clonación de los ácidos nucleicos así obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido nucleico por hibridación con una sonda apropiada. Otro procedimiento de preparación de las secuencias nucleotídicas de la invención comprende las etapa siguientes: - el ensamblaje de los oligonucleótidos sintetizados químicamente, provistos en sus extremos de sitios de restricción diferentes, siendo las secuencias compatibles con el encadenamiento de aminoácidos del polipéptido natural según el principio descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80; (1983), -la clonación de los ácidos nucleicos así obtenidos en un vector apropiado y la recuperación del ácido nucleico investigado por hibridación con una sonda apropiada

18 ES T3 REIVINDICACIONES 1. Oligonucleótido utilizable como cebador para la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos, caracterizado porque su secuencia se elige entre las secuencias conservadas y específicas de los genes nef1, vif1de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal y VIH-1 Eli o entre las secuencias complementarias de estos últimos. 2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque contiene una secuencia conservada y específica de un gen elegido entre los genes de nef1, vifide los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal y VIH-1 Eli y los nucleótidos suplementarios, o porque contiene una secuencia nucleotídica complementaria de una de estas últimas secuencias, entendiéndose que los nucleótidos suplementarios eventuales que desbordan la secuencia nucleotídica conservada específica del gen en cuestión, en los extremos 3 o coinciden preferentemente con los que se encuentran situados en los extremos 3 ó correspondientes al mismo sentido de la secuencia completa de los genes de los virus del tipo VIH-1 anteriormente mencionados. 3. Oligonucleótido caracterizado porque su secuencia está modificada en relación a la secuencia nucleotídica de un oligonucleótido según la reivindicación 1 ó 2 y porque hibrida a una temperatura de C ± 1 C con dicho oligonucleótido según la reivindicación 1 ó2. 4. Oligonucleótido utilizable para la amplificación de secuencias de ácido nucleico, caracterizado porque su secuencia procede del gen env de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal y VIH-1 Eli y porque responde a uno de los encadenamientos nucleotídicos siguientes:

19 ES T3. Oligonucleótido caracterizado porque su secuencia hibrida a una temperatura de C ± 1 C con una secuencia según la reivindicación Oligonucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque su secuencia procede del gen nef1 de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal y VIH-1 Eli y porque responde a uno de los encadenamientos nucleotídicos siguientes: 7. Oligonucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque su secuencia procede del gen vif1 de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal y VIH-1 Eli y porque responde a uno de los encadenamientos nucleotídicos siguientes: Pareja de cebadores caracterizada por contiene los oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 asociados según una de las posibilidades siguientes: MMy7-MMy8 o MMy9- MMybis o MMy-MMy17 o MMy8bis-MMy89 o MMy89bis-MMy9bis. 9. Procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleicas de los virus del tipo VIH-1 realizado a partir de una muestra biológica, comprendiendo este procedimiento principalmente las etapas siguientes: - una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar que pertenece al genoma del virus del tipo VIH-1 eventualmente presente en la muestra biológica anteriormente mencionada y, dado el caso, una etapa de tratamiento mediante una transcriptasa inversa de dicho ácido nucleico si este último está en forma de ARN, - un ciclo que comprende las etapas siguientes: desnaturalización del ácido nucleico de doble hebra a detectar, lo que conduce a la formación de un ácido nucleico de hebra simple, hibridación de cada una de las hebras de ácido nucleico, obtenidas durante la etapa de desnaturalización precedente, con al menos un oligonucleótido utilizado según una de las reivindicaciones 1 a 8, mediante la puesta en contacto de las hebras anteriormente mencionadas con al menos una par de cebadores anteriormente mencionados, la formación a partir de los cebadores de los ADN complementarios de las hebras sobre las cuales hibridan en presencia de ADN polimerasa y de cuatro nucleósidos trifosfato (dntp), lo que conduce a la formación de un número mayor de ácidos nucleicos de doble hebra a detectar 19

20 ES T que en la etapa de desnaturalización precedente, repitiéndose este ciclo un número de veces determinado para obtener dicha secuencia nucleica a detectar eventualmente presente en la muestra biológica en una proporción suficiente para permitir su detección, - una etapa de detección de la eventual presencia del ácido nucleico perteneciente al genoma del virus del tipo VIH-1 en la muestra biológica.. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa de extracción del ADN viral comprende las etapas siguientes: suspensión del residuo celular en 0, ml de agua pirolizada en un chupón Potter, ruptura de las células por ida y vuelta, adición de Triton X0 para 1 concentración final de 0,1 %, desnaturalización con calor durante a 2 minutos a 0 C, centrifugación corta para eliminar los desechos celulares, precipitación del ADN durante la noche a - Cañadiendo de 2, volúmenes de etanol absoluto y % del volumen final de acetato sódico 3 molar. 11. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa de retrotranscripción del ARN viral comprende las etapas siguientes: - µg delarnextraído resuspendido en agua se pone en presencia de una pareja de cebadores con una concentración de 0,8 µm cada uno de ellos, en un volumen final de µl, el conjunto se desnaturaliza a 0 C durante minutos y después se sumerge en agua helada, -seañaden µl de la mezcla siguiente: µl deltampón X buffer (que contiene cuando está diluido 1/: Tris-HCl, ph 8,9: 0 mm; (NH 4 ) 2 SO 4 : mm; MgCl 2 : mm; β-mercapto-etanol: mm, gelatina: 0,2 mg/ml ) + 1 unidad de transcriptasa inversa + 1 unidad de Taq polimerasa +1µl de mezcla de los 4 dntp, a razón de 2 mm cada uno + agua c.s.p. µl, la fabricación del ADN se realiza mediante la acción de la transcriptasa inversa a 42 C durante 13 minutos, a continuación se calienta a 9 C durante 3 minutos para destruir la transcriptasa inversa. 12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la etapa de desnaturalización se realiza en presencia de una pareja(s) de cebador(es) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque se realiza en las condiciones siguientes: - para la etapa de hibridación: los cebadores (1 µl de una solución µmolar de cada cebador) se ponen en presencia del ADN molde (0 a 0 ng) para la primera etapa de desnaturalizaciónreasociación; se calienta durante minutos a 0 C, a continuación se sumergen los tubos que contienen esta mezcla de ADN-molde y los cebadores en el agua con hielo, utilizándose los cebadores en una concentración final en la etapa de amplificación siguiente de 0,8 µm cada uno. - para la etapa de amplificación: se añade al medio anterior los 4 dntp, cada uno de ellos a 0, µmolar en solución final (0 µl) y una unidad de Taq-polimerasa para un medio de reacción de 0 µl; esta etapa se realiza en el tampón de amplificación denominado X buffer, cuya composición se indica en la reivindicación Uso del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 para el diagnóstico in vitro de la infección de un individuo con un virus del tipo VIH-1.. Procedimiento de expresión de proteínas codificadas por las secuencias nucleotídicas de virus del tipo VIH-1 amplificables mediante oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprenden las etapas de - puesta en contacto de al menos una pareja de oligonucleótidos específicos de un gen elegido entre los genes env, nef1, vif1de un retrovirus del tipo VIH-1, respondiendo estos oligonucleótidos a las secuencias nucleotídicas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, procedentes del genoma de un virus del tipo VIH-1, en condiciones que permitan la hibridación de estas secuencias con los oligonucleótidos,

21 ES T3 - la amplificación de las secuencias nucleotídicas contenidas en los genes env, nef1, vif1 de retrovirus del tipo VIH-1, a partir de dichos oligonucleótidos según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, recuperación y traducción de las secuencias así amplificadas para obtener secuencias de proteínas. 16. Composiciones inmunogénicas que contienen uno (o varios) producto(s) de traducción de los oligonucleótidos que responden a las secuencias nucleicas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y/o uno (o varios) producto(s) de traducción de las secuencias nucleotídicas contenidas en uno de los genes env, nef1 o vif1 de retrovirus del tipo VIH-1 amplificadas con el procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 13, después de la hibridación con una pareja de oligonucleótidos seleccionados entre los oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, específicos de un gen de un virus del tipo VIH-1 elegido entre los genes env, nef1 o vif1 y/o uno (o varios) producto(s) de expresión obtenidos mediante el procedimiento según la reivindicación. 17. Equipo para la realización de un procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende: - al menos una pareja de cebadores oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, - reactivos apropiados para la realización del ciclo de operación de amplificación, concretamente la ADN polimerasa y cuatro nucleótidos trifosfato diferentes y el tampón denominado X buffer descrito en la reivindicación 11, - una (o varias) sonda(s) que pueden estar marcadas, capaz de hibridar específicamente con la (o las) secuencia(s) de ácidos nucleicos amplificada(s) a detectar. 18. Composición para el tratamiento de enfermedades virales, concretamente el SIDA, que comprende al menos una secuencia nucleotídica antisentido según una de las reivindicaciones 1 a 8 en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 19. Anticuerpos susceptibles de formar una reacción inmunológica con los productos de traducción de los oligonucleótidos que responden a las secuencias nucleicas según una de las reivindicaciones 1 a 8, y/o uno (o varios) producto(s) de traducción de las secuencias nucleotídicas contenidas en uno de los genes env, nef1 o vif1 de los virus del tipo VIH-1 amplificadas por el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, después de la hibridación con uno cualquiera de los oligonucleótidos elegidos entre los oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, específicos de un gen de un virus del tipo VIH-1 seleccionado entre los genes env, nef1 o vif1 y/o uno (o varios producto(s) de expresión obtenido(s) mediante el procedimiento según la reivindicación.. Procedimiento de diagnóstico in vitro de la infección de un individuo o de un animal con un virus del tipo VIH-1 que comprende la puesta en contacto de una muestra biológica (concretamente suero) extraída del paciente de estudio, con anticuerpos según la reivindicación 19, y la detección de complejos inmunológicos formados entre los antígenos de los virus del tipo VIH-1 eventualmente presentes en la muestra biológica y dichos anticuerpos. 21. Equipo para la realización de un procedimiento según la reivindicación, que comprende los anticuerpos según la reivindicación 19 y, dado el caso, los reactivos apropiados para la puesta en evidencia de la reacción inmunológica formada entre dichos anticuerpos y los antígenos del virus VIH Solución tampón ( x tampón ) utilizable en un procedimiento de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos mediante oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque comprende, cuando está diluida a 1/: - Tris-HCl, ph 8,9: 0 mm; - (NH 4 ) 2 SO 4 :mm; 21