UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Departamento de Fomento de la Producción Animal Unidad de Reproducción

Transcripción

1 1 UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Departamento de Fomento de la Producción Animal Unidad de Reproducción LA FECUNDACIÓN EN MAMÍFEROS Mónica De los Reyes (DVM; MSc) Al momento de la eyaculación, los espermatozoides viajan desde la cola de los epidídimos, conductos deferentes, hacia la uretra por medio de contracciones musculares reflejas de la pared de estos conductos, donde se mezclan con el plasma seminal que es producido por las glándulas sexuales accesorias, las cuales variarán de acuerdo a la especie, constituyendo el semen. El semen durante la eyaculación es depositado en el genital de la hembra. En rumiantes, felinos, caninos y humanos, la eyaculación es vaginal, mientras que en otras especies como porcinos y equinos, es uterina. Sin embargo, independiente del sitio de depósito del semen, la gran mayoría de los espermatozoides son eliminados del genital de la hembra inmediatamente o posteriormente. En el tracto reproductivo de la hembra, los espermatozoides deben atravesar ciertas barreras para alcanzar el sitio de fecundación, que en los mamíferos es la ampolla del oviducto. Existen barreras de tipo anatómico como son el cervix, especialmente para los espermatozoides de aquellos animales de eyaculación intravaginal y la unión úterotubarica, especialmente para aquellos que depositan el semen a nivel uterino. Por otra parte, está la acción fagocitaria de leucocitos en el genital femenino. 1

2 2 El mucus cervical también cumple un rol importante en el transporte espermático, dentro del tracto reproductivo de la hembra. Este mucus es una mezcla de sustancias producidas por las células del epitelio endocervical y el transudado de proteínas plasmáticas, describiéndose en este, dos fases: fase acuosa y fase gel. La primera se caracteriza por contener un 98% de agua, además de iones inorgánicos, proteínas solubles, enzimas, hidratos de carbono y aminoácidos; la segunda, posee principalmente mucina cervical, aminoácidos hidroxilados, galactosa y glucosaminas. El mucus sufre cambios físico-químicos dependiendo del estado endocrino de la hembra. Así, durante la fase lútea, debido al predominio progestacionlal, el mucus es una barrera importante para el paso de los espermatozoides ya que cambia su orientación molecular impidiendo el avance espermático a través del mucus. Durante la etapa periovular, por acción de los estrógenos, se estimula una mayor producción de mucus, haciéndose éste más filante y se dispone en forma longitudinal, asegurándo así que los espermatozoides se muevan unidireccionalmente, proporcionando además, el medio adecuado para el movimiento progresivo espermático y la actividad metabólica, cumpliendo también una actividad antimicrobiana a través de los leucocitos. Estudios realizado en humanos y bovinos, especies caracterizadas por tener abundante secreción de mucus durante la fase preovular, muestran que los espermatozoides que han penetrado el mucus cervical, no sólo presentan una mayor motilidad espermática, sino que también aumenta la proporción de espermatozoides morfológicamente normales, en comparación con aquellos que no lo han atravesado. Los espermatozoides que entran al mucus nadan a través de las microestructuras longitudinales de las glicoproteínas del mucus hasta alcanzar la superficie del epitelio. De esta forma, el tracto genital de la hembra selecciona el número de espermatozoides que llega al sitio de fecundación. En los métodos de fecundación in vitro, es necesario contar con tecnologías que permita seleccionar a los espermatozoides previo a la interacción gamética, como son los métodos de Percoll o Swim-up. 2

3 3 En las especies que presentan eyaculación intravaginal, muchos espermatozoides se eliminarán del tracto reproductivo de la hembra, luego del coito. De los espermatozoides que logran entrar al cervix, algunos migran inmediatamente al sitio de fecundación, transporte rápido; es probable que este transporte ocurra en parte por la relajación momentánea del cervix y las contracciones vaginales que se producen por el estímulo coital; pero la mayoría de los espermatozoides que logra entrar, se depositan en los pliegues cervicales, denominadas criptas cervicales, de donde son liberados cada ciertas horas, dependiendo de la especie, transporte lento. La fase de transporte rápido se caracteriza por contracciones del tracto genital de la hembra, propulsando a los espermatozoides al oviducto. Durante esta fase se han encontrado espermatozoides en el sitio de fecundación entre 5 a 15 minutos después del coito. Existen evidencias científicas en diferentes especies, que han demostrado que la mayor parte de estos espermatozoides son de baja viabilidad. Durante la fase de transporte lento en cambio, los espermatozoides se mueven del cervix hacia los oviductos a la región del Istmo, lo que puede tomar horas, ya que en el útero los espermatozoides involucrados en el transporte lento, se unen a las células epiteliales de la pared uterina, donde van avanzando hasta un poco más abajo del istmo, cerca de la unión útero-tubaria. Este lugar es otro reservorio espermático, bastante importante en aquellas especies que presentan eyaculación intrauterina principalmente, también se ha confirmado este reservorio en los rumiantes. La última fase del transporte espermático, es en el oviducto. Los cilios del epitelio oviductal ayudan también en el transporte espermático, como asimismo las contracciones de la musculatura del oviducto. Se sabe actualmente, que los espermatozoides fecundantes esperan en la parte baja de la región istmica del oviducto, la ovulación. Por lo tanto, los espermatozoides ascienden hacia la ampolla y los ovocitos descienden a la ampolla en forma sincronizada. En este segmento bajo el istmo, donde los espermatozoides esperan a 3

4 4 los ovocitos, existen receptores adrenérgicos e irrigación directa de la sangre, lo que lo hace más sensible a pequeños cambios en los niveles hormonales. oviducto ampolla istmo ovario útero vagina cervix Figura 1: Transporte espermático desde la vagina al sitio de fecundación (ampolla oviductal) Capacitación Espermática Austin (1951) y Chang (1951), observaron que la fecundación no ocurría hasta varias horas después que los espermatozoides eran depositados dentro del útero de ratones y conejas; este período de tiempo que debían permanecer los espermatozoides en el tracto genital, previo a la fecundación, se denominó genéricamente capacitación espermática, ya que en ese lapso de tiempo algo debería ocurrirles a los espermatozoides para hacerlos capaces de fecundar exitosamente a los ovocitos. Este tiempo de capacitación se observó posteriormente en otras especies animales, reconociéndose actualmente como un fenómeno generalizado en las diversas especies estudiadas. 4

5 5 Muchos cambios ocurren en los espermatozoides durante la capacitación, que son aun objeto de innumerables estudios científicos, sin embargo, existen dos fenómenos que se han logrado identificar más claramente durante este proceso, a pesar que los mecanismos moleculares no están aun completamente entendidos: cambios a nivel del flagelo que hace que los espermatozoides se muevan más activamente, Hiperactivación y cambios a nivel de la membrana plasmática de la zona de la cabeza, donde está el acrosoma, Reacción Acrosómica (Fig. 2). CAPACITACIO ESPERMÁTICA Reacción Acrosómica Hiperactivación Interacción con la Zona Pelúcida Fusión membranas gamética Figura 2. Esquema de las posibles relaciones entre los eventos de la capacitación que llevan a la fusión de las membranas gaméticas Hiperactivación La mayoría de los espermatozoides de mamíferos se aglutinan uniendo sus cabezas cuando son mezclados con soluciones fisiológicas como los medios de capacitación in vitro, o secreciones corporales, esta aglutinación no es de carácter inmunológico, sino que se debe a las cargas negativas de superficie, ya que parte de este proceso de capacitación involucra la remoción de los componentes de superficie del espermatozoide, adquiridos principalmente durante su tránsito por el epidídimo y en 5

6 6 su encuentro con el plasma seminal. Luego de permanecer aglutinados por un determinado tiempo, que varía entre las especies, son liberados los espermatozoides, observándose en ellos un movimiento muy activo. El término de hiperactivación se ha utilizado para describir el cambio en el patrón de motilidad espermática que ocurre en la capacitación y diferenciarla de aquella activación en el movimiento durante la maduración en el epidídimo. El movimiento durante la capacitación, se hace muy vigoroso, con un fuerte batir del flagelo (Fig. 3). Lo importante de este movimiento, es aumentar la fuerza generada por la cola al moverse y no un patrón de movimiento per se. La frecuencia del batir del flagelo varía bastante entre las especies, por lo que es posible esperar que el patrón de hiperactivación también puede variar en las distintas especies animales. El patrón de hiperactivación se ve influído en gran medida por la viscosidad y microestructuras del medio. Figura 3: Patrones de hiperactivación espermática En algunas especies, como los conejos, no se han encontrado espermatozoides hiperactivados en la región istmica, sólo a nivel de la ampolla. En otras especies como el hamster y ratón los espermatozoides comienzan a adquirir el movimiento 6

7 7 hiperactivado poco después de dejar el istmo; en estas mismas especies si son depositados espermatozoides hiperactivados en el útero de hembras en estro, éstos no entran al oviducto. Al parecer el fenómeno de hiperactivación espermática en las diversas especies, ocurriría cerca o en el sitio de fecundación. La evidencia científica indica que existe una estrecha relación entre la capacidad de los espermatozoides de hiperactivarse y la capacidad de éstos para fecundar. El componente no direccional de la motilidad hiperactivada pude ayudar a los esperamatozoides a despegarse de las células epitelales del oviducto, favorecer el desplazamiento a través de los fluidos viscosos oviductales, como también particularmente, a cruzar las cubiertas ovocitarias, especialmente la matriz extracelular que une a las células del cúmulo oosforo y alcanzar así, la zona pelúcida. Los procesos de generación e inicio de la motilidad espermática no están aun claros, particularmente los mecanismos que la gatillan; por lo que los mecanismos que determinan inicialmente que se produzca la hiperactivación son aun menos entendidos. Lo que se sabe es que se necesita calcio extracelular para iniciar y mantener la hiperactivación y la cola espermática tiene tanto proteína kinasa como proteina G. La proteína G activaría los canales de calcio, permitiendo el influjo transitorio de calcio, el aumento del calcio intracelular estimularía la adenilciclasa para iniciar la cascada camp-proteína kinasa. La proteían G, sin embargo, podría estar estimulando otros canales ionicos. Puede existir una hiperactivación falsa, que ocurre en los espermatozoides moribundos. Al empezar a morir los espermatozoides, van perdiendo la impermeabilidad de la membrana plasmática, lo que hace que el calcio extracelular entre a la célula y se gatille la hiperactivación, lo que se ha observado en cultivos in vitro (Bedford et al., 1990). Reacción Acrosómica 7

8 8 La reacción del acrosoma es un pre requisito para la penetración de la zona pelúcida y para la fusión del espermatozoide con la membrana plasmática del ovocito, contituyendo un mecanismo de control para la fecundación. La reacción acrosómica se puede considerar como una exocitosis en que las membranas plasmática y acrosómica externa se fusionan y fenestran progresivamente entre sí, permitiendo que el espermatozoide establezca una unión secundaria con la zona pelúcida, iniciando así su paso a través de ella para más tarde fusionarse con la membrana plasmática del ovocito (Fig.4). Figura 4: Estructuras espermáticas antes y después de la reacción del acrosoma. A: espermatozoide intacto; B: espermatozoide durante la fusión de la membrana plasmática y acrosomal externa, permitiendo la exposición del contenido acrosomal; C y D: espermatozoide luego de la reacción acrosómica Las evidencias indican que para que estos cambios ocurran, es necesario, al igual que para la hiperactivación, el calcio extracelular, al menos parte del que es internalizado. No obstante, aun no están completamente claros los mecanismos que controlan el flujo de calcio, sugiriéndose que este podría producirse a través de los canales de calcio operados por receptores, o como resultado de estímulos extracelulares y 8

9 9 mecanismos de regulación iónica, donde estaría involucrada la proteína G. Se sabe que el aumento de este ion, intracelularmente, provoca variadas respuestas, entre ellas la estimulación de la adenilato ciclasa, lo que a su vez induce un aumento del AMPc y activación de fosfolipasas asociadas a la membrana, con la consiguiente perturbación de la membrana plasmática. La reacción acrosómica puede ocurrir en forma espontánea e independiente de la presencia del ovocito; sin embargo, se ha probado que las envolturas ovocitarias cumplirían un rol importante en este proceso. Evidencias experimentales estarían demostrando que la reacción del acrosoma es un proceso mediado por receptores y regulado por ligandos derivados del ovocito o de sus cubiertas más cercanas, esto probablemente gatillaría el influjo de calcio a través de los canales operados por receptores específicos. En el ratón se ha postulado que el componente proteico del agonista espermático de la zona pelúcida, ZP3, estaría asociado a la actividad inductora de la reacción acrosómica. La reacción acrosómica permite la liberación del contenido acrosomal, que incluye a la serina proeteasa acrosina. La acrosina ha sido demostrada en espermatozoides de diferentes especies mamíferas. Esta enzima se almacena en el compartimento acrosomal en su forma zimógena, proacrosina; la proacrosina autocataliza su propia conversión a la forma activa, acrosina durante la reacción acrosómica. Se ha demostrado que Proacrosina/acrosina estarían involucradas el la dispersión de la matriz acrosomal y en la unión y penetración a través de la zona pelúcida. Después de la inducción de la reacción acrosómica, la matriz acrosomal queda expuesta, perdiéndose la primera unión entre el espermatozoide y la zona pelúcida. Sin embargo, el espermatozoide penetrante establece un segundo tipo de interacción, llamada unión secundaria. Esta segunda unión se mantendría durante la penetración espermática a través de la zona pelúcida; otra proteína de la zona pelúcida, la ZP2, sería responsable de esta segunda unión. Por parte del espermatozoide, se ha 9

10 10 postulado proacrosina/acrosina. que la proteína responsable de la segunda unión, sería el sistema La reacción acrosómica permite además, cambios en la composición de la membrana plasmática del espermatozoide, a nivel de la región posterior de la cabeza, cerca del segmento ecuatorial. Estos cambios son esenciales para que esta región se pueda fusionar más tarde con la membrana plasmática del ovocito, después que el espermatozoide haya atravesado la zona pelúcida. Fusión de los gametos Una vez que el espermatozoide ha atravesado la zona pelúcida, éste cruza el espacio perivitelino rápidamente. La cabeza espermática se une a la membrana plasmática del ovocito, siendo la membrana plasmática de la región ecuatorial del espermatozoide la que se fusiona con el ovocito. La región posterior de la cabeza espermática y la cola son incorporadas subsecuentemente al ovocito a través de la fusión de las membranas de ambos gametos. La membrana plasmática del ovocito (oolema), está cubierta por numerosas microvellosidades, excepto en el área que está sobre el huso meiótico, donde se encuentra la placa metafásica de la segunda división meiótica, en esta zona justamente, no ocurre la fusión gamética. Al parecer, esta zona libre de vellosidades, estaría carente de receptores espermáticos, por lo que se ha sugerido, que el espermatozoide no se fusione en esta área por la falta de receptores, más que por estar desprovista de vellosidades. No obstante, este hecho evita que el espermatozoide sea eliminado del ovocito, junto con el segundo corpúsculo polar al reiniciarse la meiosis. Activación del ovocito 10

11 11 El contacto del espermatozoide fecundante con la membrana plasmática del ovocito, inicia una serie de cambios en el huevo. Durante la activación del ovocito, un evento crucial es el bloqueo a la poliespermia, vale decir, que más de un espermatozoide pueda penetrar la zona pelúcida del huevo y llegar a fusionarse con la membrana plasmática. El bloqueo a la polispermia, puede ocurrir en los mamíferos a nivel de la zona pelúcida, como se ha visto en bovinos, ovinos y cerdos, o a nivel de la membrana plasmática del ovocito como ocurre en los conejos. El bloqueo a la poliespermia se debe a la fusión de los granulos corticales del ovocito con la membrana plasmática de éste, este fenómeno de fusión permite que el contenido de los gránulos se libere al espacio perivitelino, lo que se conoce como Reacción de Zona. La zona pelúcida se altera después de la exocitosis de los granulos corticales, probablemente por acción enzimática; de esta forma, los espermatozoides no son capaces de entrar o continuar atravesando la zona. Otro efecto importante durante la activación del ovocito, es el reinicio de la meiosis, lo que conduce a la formación de los pronúcleos. La envoltura nuclear del espermatozoide se desintegra debido a factores intracitoplasmaticos del ovocito y la cromatina espermática se decondensa, sincrónicamente con la cromatina del ovocito. La cromatina espermática se condensa nuevamente durante su transformación a pronúcleo masculino, similar a lo que ocurre en la formación del pronúcleo femenino (Fig. 5). La formación de los pronúcleos implica la culminación del complejo fenómeno de la fecundación. 11

12 12 Figura 5: Cigoto de mamífero (cerdo), obtenido por fecundación in vitro. 12