C12N 1/14 //A01H 17/00

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 k N. de publicación: ES k Número de solicitud: k Int. Cl. 5 : A01G 1/04 C12N 1/14 //A01H 17/00 k 12 SOLICITUD DE PATENTE A1 22 kfecha de presentación: k Solicitante/es: Ramon Espigol Llora Sorall, Arbucies, Gerona, ES k 43 Fecha de publicación de la solicitud: k 72 Inventor/es: Espigol LLora, Ramón k 43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud: k 74 Agente: Pons Ariño, Angel k 54 Título: Procedimiento para la obtención de un árbol micorrizado para reforestación. k 57 Resumen: Procedimiento para la obtención de un árbol micorrizado para reforestación; que comprende: aislar en una cámara de flujo laminar el micelio a partir de un trozo de cartóforo esterilizado con cloruro de mercurio; sembrar el micelio en una placa de agar que previamente se ha preparado con el medio de cultivo; prepara el inóculo vegetativo para lo cual se hace crecer el micelio en una mezcla de turba y vermiculita embebida en medio del cultivo, sometiendo esta preparación a una esterilización en autoclave. Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION La presente Invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un árbol micorrizado para reforestación. Los árboles tratados con especies micorrizógenas y destinados a planteles para reforestación son árboles que llevan simbiónte en sus raices el micélio de una serie de hongos. Ya se conoce como el estado de la técnica experiencias en laboratorio realizadas desde los años cuarente por investigadores alemanes, modificadas posteriormente por diferentes investigadores americanos y franceses. El procedimiento de la invención mejora todas estas experiencias en laboratorio consiguiendo por métodos sencillos y muy operativos, mediante el procedimiento de la invención un árbol micorrizado para reforestación. Los hongos utilizados son los siguientes: Hebeloma crustuliniforma cepas HCS 166. HCS 260 HCS LL 01. HCS LL 02, HCS LL 03. Pisolithus tinctorius cepa PT 306. Paxilus involutus cepas PI TG 01. PI TG 02. Rhizopogon luteolus. Rhizopogon roseolus. Estos árboles están destinados a la reforestación con el objetivo de aumentar la vigorosidad y su desarrollo incluso en condiciones limite. Las especies que se utilizan para establecer tal asociación son las siguientes: Pinus pinea. Pinus pinaster- (variedad landais). Pinus pinaster- (variedad cortensis). Pinus halepensis. Pinus strobus. Pinus radiata. Pinus sylvestris. Quercus ilex. Quercus suber. Quercus robur. Populus nigra. Populus alba. Populus tremula. Castanea sativa. Juglans regia. Eucalyptus dalrympleana. Fagus sylvatica. Picea sp. Abies sp. El proceso de micorrización empieza por el aislamiento del micelio a partir de un ejemplar fresco. Para ello se utiliza el himenio, es decir, la zona donde el micelio guarda su gran actividad y que se haya en el sombrero de la seta, debajo de las láminas. Este trocito de carne debe esterilizarse con cloruro de mercurio y sembrarse en una placa de petri que se habrá preparado anteriormente con el medio de cultivo apropiado (el medio de cultivo es un complejo de azúcares, pro teinas, vitaminas y sales minerales que es necesariofabricar en el propio laboratorio). Todo este proceso debe realizarse en condiciones totalmente estériles por lo que es indispensable utilizar una cabina de flujo laminar; todos los medios de cultivo, utensilios y substratos que se utilicen deber ser estériles (esterilizados al autoclave). Cuando se ha conseguido aislar la cepa que será diferente en cada caso según provenga de una u otra seta se procederá a clonar el micelio en un medio líquido para conseguir su rápido crecimiento. A continuación se preparará el inóculo que consistirá en hacer crecer el micelio del hongo en una mezcla de turba y vermicultiva embebida en medio de cultivo y esterilizado al autoclave (una primera vez a 121 grados durante 70 minutos y una segunda vez a 121 grados 20 minutos, en la última esterilización se le agregará elmedio de cultivo). O bien pueden adquirirse algunas de estas cepas en los Estados Unidos. Por otra partes se procederá a la obtención de la planta receptora del micelio y que consistirá en el cultivo en invernadero de las semillas esterilizando suavemente su superficie con agua oxigenada al 30% durante 30 minutos. El establecimiento de este tipo de micorriza no necesita tantos cuidados de esterilidad por tratarse de especies muy vigorosas y de rápida colonización de las raices. El inóculo se puede aplicar en el momento de sembrar las semillas o bien en el momento de transplantar el plantel a raíz desnuda. El medio de cultivo que se utiliza tiene la siguiente composición: Cloruro cálcico...0,05 gr/l Cloruro sódico...0,025 gr/l Fosfato potásico gr/l Fosfato amónico gr/l Sulfato magnésico gr/l Cloruro férrico al 1% ml/l Tiamina microgr/l Extracto de malta...3 gr/l Glucosa...10 gr/l Agar...15 gr/l (sólo para...placas de petri) PH En el dibujo se observa la obtención del inóculo, es decir, el micélio del hongo en condiciones asépticas en el laboratorio y por otra parte la obtención del plantel en el invernadero ó similar. Descrita suficientemente la naturaleza del invento, así como la manera de realizarse en la práctica, debe hacerse constar que las disposiciones anteriormente indicadas y representadas en los dibujos adjuntos, son susceptibles de modificaciones de detalle en cuanto no alteren su principio fundamental. 65 2

3 REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para la obtención de un árbol micorrizado para reforestación; caracterizado porque comprende: aislar en una cámara de flujo laminar el micelio de hongos a partir de un trozo de carpóforo esterilizado con cloruro de mercurio: sembrar el micelio en una placa de agar que previamente se ha preparado con el medio de cultivo, preparar el inóculo vegetativo para lo cual se hace crecer el micelio en una mezcla de turba vermiculita embebida en medio de cultivo, sometiendo ésta preparación a una esterilización en autoclave. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo tiene la siguiente composición: Cloruro cálcico...0,05 gr/l Cloruro sódico...0,025 gr/l Fosfato potásico gr/l Fosfato amónico gr/l Sulfato magnésico gr/l Cloruro férrico al 1% ml/l Tiamina microgr/l Extracto de malta...3 gr/l Glucosa...10 gr/l Agar...15 gr/l (sólo para...placas de petri) PH Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque los hongos son: Hebeloma crustuliniforme cepas HCS 166, HCS 260, HCS LL 01, HCS LL 02, HCS LL03. Pisolithus tinctorius cepa PT 306. Paxilus involutus cepas PI TG 01. PI TG 02. Rhizopogon luteolus. Thizopogon roseolus

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5 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA k 11 ES k 21 N. solicitud: k 22 Fecha de presentación de la solicitud: k 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA k 51 Int. Cl. 5 : A01G 1/04, C12N 1/14 // A01H 17/00 DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reivindicaciones afectadas A EP-A (N.P.I.) 1 *Tablas4y5;reiv. 19* A US-A (WARNER) 1,2 *Col. 2,lín. 1-19; reiv. 6 * A US-A (LITCHFIELD & LAWHON) 1-3 * Col. 2, lín ; col. 3, lín ; reivindicaciones * A ES-A (KABUSHIKI KAISHA) 1,2 *Pág. 8, lín. 4-9 * Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones n : Fecha de realización del informe Examinador Página Fco. J. Haering Pérez 1/1