PACIENTE CON SOSPECHA CLINICO EPIDEMIOLOGICA TOMA DE MUESTRA EXUDADO CULTIVO

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1 PACIENTE CON SOSPECHA CLINICO EPIDEMIOLOGICA TOMA DE MUESTRA TEJIDO EXUDADO SUERO RASPADO BIOPSIA ASPIRADO MICROPIPETA FROTIS PCR FROTIS HISTOPATOLOGIA CULTIVO INOCULACION EN HAMSTERS IDRM LEISHMANINA

2 INDICE Pág INTRODUCCION -2- EL LABORATORIO EN LEISHMANIASIS.-3- TOMA DE MUESTRA DE LA LESION - coloración -4- TECNICA COLORACIÓN -5- INTRADERMOREACCION DE MONTENEGRO -6- CULTIVO- CONTROL DE CALIDAD- OBSERVACION MICROSCOPICA -7- FLUJOGRAMA -8- BIBLIOGRAFIA..-9-

3 INTRODUCCION La leishmaniasis constituye un importante problema de salud pública por el alto costo que representa a nivel psicológico, socio- cultural y económico. Es una enfermedad de presentación desigual, transmitida por distintas especies de protozoarios pertenecientes al género Leishmania En Argentina la leishmaniasis tegumentaria es endémica, presentando manifestaciones cutáneas en la primoinfección y mucosas en aproximadamente en el 20% y 10% de los casos cutáneos no tratados cuando el agente etiopatogénico en Leishmania Viannia braziliensis; la localización mas frecuente de las lesiones son las partes expuestas del cuerpo, como ser miembros inferiores, miembros superiores, tronco, cara entre otros. El agente causal es un protozoario flagelado perteneciente al género Leishmania, cuyo ciclo biológico se presenta bajo 2 formas: amastigotes, dentro de los fagolisosomas de los macrófagos en el huésped vertebrado (roedores, perros y humanos) y promastigote en el tubo digestivo del huésped invertebrado (insecto) o medios de cultivos. La transmisión de la enfermedad se realiza mediante la picadura de un flebótomo adulto hembra infectado, que durante el día reposa en áreas cubiertas de vegetación y que vuela buscando fuentes de alimentación, principalmente vertebrados. Los parásitos se desarrollan y multiplican en el intestino del flebótomo y en un período de 8 a 20 días, según las condiciones de temperatura y el sistema huésped-vector de que se trate, de este proceso surgen parásitos infectantes bajo la forma de promastigotes, que ingresan por el sitio de la picadura. La picadura en estado de vigilia suele ser percibida. En su inicio aparece una pápula que se agranda y transforma en una úlcera. Esta puede ser una lesión única o múltiple; se caracteriza por sus bordes elevados, violáceos, en general indolora, de fondo granuloso que puede o no, tener exudado en su fondo. En Argentina la especie habitualmente encontrada es L. Viannia braziliensis, aunque recientemente se describieron las especies L. L amazonensis y panamensis / guyanensis. Como se mencionó el transmisor es un insecto díptero, del género Lutzomyia, y una amplia gama de Especies. La leishmaniasis es una enfermedad de alta prevalencia en muchas áreas tropicales y subtropicales del mundo y se calcula que anualmente se producen casos nuevos. La denuncia de casos de Leishmaniasis en la República Argentina es obligatoria, sin embargo, la situación de algunas provincias es poco conocida, ya que la información es insuficiente.

4 EL LABORATORIO EN LEISHMANIASIS El laboratorio participará en el análisis de la información, evaluación y planificación de actividades de localización, diagnóstico y seguimiento de los casos de leishmaniasis, teniendo en cuenta que examen directo, frotis, del raspado del borde activo de la lesión, es un método suficientemente evaluado para su aplicación en cualquier área de transmisión. Los métodos de diagnósticos directo (método parasitológico) son simples de implementar se lo recomienda en primera instancia por su sencillez, y bajo costo; se basa en la observación de la presencia de parásitos en su forma amastigote en la lesión y de promastigote en cultivos. Estos constituyen un gran apoyo en el diagnóstico confirmatorio de la enfermedad, con una sensibilidad de hasta un 60% en las formas cutáneas. La IDRM (Intradermo Reacción de Montenegro), es un método de diagnóstico indirecto (inmunológico). Los métodos inmunológicos se basan en la detección de la respuesta inmune celular tardía, o humoral de anticuerpos específicos, desarrollados como consecuencia de la infección Otros métodos como cultivo, PCR, ELISA, requieren laboratorios de mayor complejidad. La red de laboratorios en el control de Leishmaniasis tendrá que estar integrada por los laboratorios de Salud Pública que realicen técnicas para identificar la Leishmania. Es deseable que todo establecimiento de salud que cuente con laboratorio equipado con un microscopio realice exámenes para el diagnóstico de Leishmaniasis.

5 TOMA DE MUESTRA DE LA LESION Material necesario: palillo punta afilada - porta objetos limpios y desengrasado- guantes descartables- gasa estéril- torundas de algodón alcohol 70%- Microscopio con objetivos de 10x, 40x, 100x. Aceite de inmersión. Técnica toma de muestra: se toma muestra del borde activo y no contaminado con gérmenes de la lesión; si hay varias lesiones escoja la que tenga menor tiempo de evolución y los bordes más indurados. Sobre el borde activo de la lesión se realiza un paulatino raspado con el palillo de punta afilada en forma de paleta. Se hace compresión de la herida con gasa estéril hasta que deje de fluir sangre. Con la punta del palillo se raspa el borde tratando que sea siempre en el mismo lugar a fin de obtener tejido que contengan macrófagos místicos. Con el material obtenido se coloca sobre el portaobjeto limpio y desengrasado esparciéndolo suavemente y con movimientos circulares. Se repite el procedimiento otras dos veces más para tener tres frotis por portaobjetos. Se debe realizar 2 portaobjetos por lesión. Dejar secar a temperatura ambiente y colorear. El frotis es el método confirmatorio más rápido, sensible ( más del 60% en lesión con una evolución menor a 3 meses) y de fácil transferencia. Coloración: May - Gruenwald Giemsa éste método utiliza dos soluciones: 1) Solución de May Gruenwald: Solución de eosinato de azul de metileno en alcohol metílico, éste actúa como fijador. Los colorantes neutros de este tipo, cuando están disueltos en alcohol metílico, carecen de propiedades tintoriales. Al agregar agua precipitan y recién entonces actúan, tornándose otra vez inactivos cuando han precipitado completamente. 2) Solución de Giemsa: solución metílica y glicerínica de eosina, azul de metileno y azur II. Este último es un derivado de oxidación del azul de metileno que tiene gran afinidad por los núcleos y ciertas granulaciones. Es metacromático.

6 TECNICA Elementos: Cubeta- Soporte para portaobjeto.- Colorante May Grunwald: solución standard- Colorante de Giemsa: solución stock.- Agua destilada.- agua tamponada o eventualmente agua corriente.- Timer.- Pipeta de 5 ml.- Tubo de ensayo.- Gradilla. Procedimiento: 1) Cubrir el frotis con solución de May- Grunwald, 1 30 para su fijación. 2) Sin volcar, agregar igual cantidad de agua destilada; aquí se colorea en Volcar 3) Se prepara una dilución acuosa de Colorante de Giemsa a razón de 6 gotas cada 4 ml de agua, por cada preparado a colorear. Se lo cubre durante 20 a 30 minutos. 4) Lavar con agua corriente y secar. Las estructuras celulares se tiñen de la siguiente manera: Núcleo: Violeta rojizo Citoplasma: dependiendo del ph del agua con que se preparó el colorante del tipo de célula, debería ser de color celeste grisáceo. Se recomienda observar la coloración que toma el citoplasma de los macrófagos que deben presentar el mismo color. El kinetoplasto toma color más oscuro e intenso que el núcleo, lo que constituye una característica fundamental para confirmar el diagnóstico. Identificación de la muestra: es muy importante. La identificación se asienta con lápiz negro en uno de los borde del portaobjeto ( borde esmerilado), nombre del paciente, área operativa que realiza la toma de muestra. En caso de no contar con dicho elemento, emplear un marcador resistente al agua.

7 INTRADERMOREACCION DE MONTENEGRO Materiales: Jeringa de 1ml con aguja 26G x 3/8 (tuberculina) Alcohol 96% Algodón Antígeno de Montenegro (leishmanina) Lapicera birome Regla Planilla de registro Procedimiento: Verificar que el frasco que contiene el antígeno, se conserve en heladera y agitar antes de usar. Desinfectar el tapón de goma del frasco que contiene la leishmanina Asépticamente cargar 0,1 ml de leishmanina en jeringa de tuberculina Limpiar con algodón embebido en alcohol la cara media del antebrazo. Introducir el antígeno lentamente, observando que se forma una pequeña pápula que luego desaparece. Si no se formace la pápula en razón que la aguja penetró profundamente, debe repetirse la experiencia en el otro brazo, ya que en caso contrario, el resultado será siempre negativo. Lectura Entre las 48 y 72 horas leer la reacción. 1) Delimitar el área de induración con una lapicera birome según técnica. 2) Medir el diámetro del área dibujada 3) Anotar el diámetro, en milímetros en la historia clínica. Interpretación Diámetros iguales o superiores a 5 mm se consideran positivos Es muy importante tener en cuenta que: La reactividad de la IDRM traduce la respuesta de la inmunidad celular desarrollada en el individuo infectado. Esta respuesta celular permanece aún después de haber cicatrizado la lesión, con o sin tratamiento (cura espontánea). Si el paciente estuvo en contacto con el parásito pero no desarrolló lesión, también puede resultar positiva (infección asintomática). En las siguientes circunstancias la IDRM puede resultar negativa : pacientes con breve período evolutivo de la lesión ( 2 semanas o menos), en ancianos y en sujetos inmunodeprimidos. Una prueba de IDRM positiva no es diagnóstico de leishmaniasis activa, sólo indica que el paciente ha tenido contacto previo con el parásito.

8 Las pruebas falsas positivas se pueden presentar eventualmente en pacientes con: Enfermedad de Chagas Tuberculosis. Aunque ello es inusual, rescatando el valor de la reacción como altamente específico de leishmaniasis. Cultivo: El material proveniente del aspirado de la lesión o de la biopsia se puede amplificar, si se dispone de las instalaciones adecuadas para tal fin; se puede hacer cultivos observándose el parásito bajo la forma promastigote en el medio de N.N.N (Novy, Mc. Neal, Nicole). Cuando se dispone de bioterio, resulta conveniente emplear, como método complementario o filtro biológico, la inoculación a hámsters. Control de Calidad del Diagnóstico de Laboratorio: El procesamiento y lectura de frotis requiere capacitación permanente, por lo que es necesario la instrumentación de un sistema de control de calidad del diagnóstico parasitológico. Todos los preparados entrarán en el sistema de control de calidad. Cada laboratorio deberá enviar mensualmente del 1 al 10 de cada mes, el 100% de frotis tanto POSITIVOS como NEGATIVOS al referente, para su control. Una vez realizadas las lecturas de control, se devolverán las placas enviadas, con las observaciones que surgiera del diagnóstico, en lo concerniente a calidad de la muestra, del extendido, de la coloración, condiciones en que se recibió las placas y resultado de las lecturas. Observación microscópica: Se debe observar la totalidad de los frotis realizados, con dos o tres extendidos cada uno, en todos los campos microscópicos mediante el empleo de objetivo de 100x de excelente resolución. El amastigote es un pequeño corpúsculo de forma ovoidea o esférica de 2 a 6 micrones de diámetro, que en la observación al microscopio óptico (100X) se distingue el núcleo redondo rojo violáceo y kinetoplasto en forma de bastón más picnótico y un citoplasma celeste.

9 BIBLIOGRAFIA Velez Bernal, I. D. y Aguado López S del P (1996). Manual de procedimientos para el diagnóstico de la Leishmaniasis cutánea americana; editorial Universidad de Antioquia; Medellín, Colombia. Minaya Gloria; (1997); Manual de procedimientos de Laboratorio para el Diagnóstico de la Leishmaniasis; Serie de Normas Técnicas Nª 13; Instituto Nacional de Salud; Ministerio de Salud; Lima Perú. OMS; (1984); Métodos Básicos de Laboratorio en Parasitología Médica; Ginebra. Servicio Nacional de Antioquia; (1997); Leishmaniasis, Normas Técnicas y Administrativas; Antioquia, Colombia. De los Rios Eudoro, De los Rios Rossana; Leishmaniasis, Actualizaciones Terapéuticas Dermatológicas (1998); 21: 354. Ióvine Selva- 3ª Edición- Ed. Panamericana- El Laboratorio en la Clínica. Furtado T. A.1972 Diagnóstico Laboratorial de Leishmaniasis Tegumentaria Americana. An. Bras. Derm. 47 : Manual de Procedimientos para el control de Leishmaniasis Programa Nacional de Leishmaniasis M.S. ANLIS CeNDIE.

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11 AUTORIDADES DEL MINISTERIO DE SALUD PUBLICA DE LA PROVINCIA DE SALTA DR. ALBERTO JORGE DIAZ LEGASPE MINISTRO DE SALUD PUBLICA DRA. SILVIA MONICA MUSSO COORDINADORA GENERAL DE GESTION RIESGO SANITARIO DRA. GLORIA M. DE CHALABE RESPONSABLE DE AREA ENFERMEDADES DERMATOLOGICA DE INTERES SANITARIO DRA. NOEMI SCHANZ ADET BIOQUIMICA DE AREA ENFERMEDADES DERMATOLOGICA DE INTERES SANITARIO Agradecimientos Por su gentil colaboración y asesoramiento en la redacción del presente manual: al Dr. Néstor Taranto y a la Dra. María Celia Mora AÑO 2005