11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : C12N 15/12, C12N 9/12
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- Manuel Fernández Agüero
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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : C12N 1/12, C12N 9/12 C12N 1/62, C12N 1/19 C12N 1/21, C12N / C12N 1/63, A61K 39/00 C07K 14/00, C12P 21/08 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: kfecha de presentación: k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Dominio externo de c-erbb-2:gp7. k Prioridad: US 3899 k 73 Titular/es: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT Berlin, DE k Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Stuart, Susan G.; Monahan, John J.; Langton, Beatrice Claudia; Hancock, Miriam E. C.; Chao, Lorrine A. y Bluford, Peter ES T3 k Fecha de la publicación del folleto de patente: Aviso: k 74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid
2 Dominio externo de C-erbB-2:GP7. DESCRIPCION 1 Esta invención se sitúaenloscamposdelaingeniería bioquímica y de la inmunoquímica. Más particularmente, esta invención se refiere a moléculas de ADN recombinante expresadas en organismos anfitrión apropiados, así comoa nuevas proteínas y fragmentos polipeptídicos de las mismas que pueden ser producidos de manera recombinante, sintéticamente, o por otros medios, tales como la fragmentación de proteínas y polipéptidos producidos biológicamente. Las moléculas de ADN recombinante de esta invención están caracterizadas por el ADN que codifica proteínas y polipéptidos del dominio externo del oncogén c- erbb-2, los cuales son denominados en la presente memoria glicoproteína 7 (gp7). Las proteínas y polipéptidos serológicamente activos, inmunógenos y/o antígenos, son útiles como reactivos para la detección inmunológica de gp7 en los fluidos corporales de pacientes de cáncer, lo que permite al diagnosticador realizar valoraciones importantes sobre el estado y prognosis de los pacientes, y útiles también para la producción de anticuerpos y para la purificación por afinidad. Son clave para esta invención ensayos diagnósticos diseñados para detectar gp7 en fluidos corporales de mamíferos. Las proteínas y polipéptidos expresados o bien producidos sintética o biológicamente de esta invención son útiles además como vacunas para intensificar las respuestas inmunológicas de pacientes de cáncer frente a la actividad tumorígena, y de pacientes de cáncer recuperados frente a la amenaza tumorígena subsiguiente. Aún más, estas proteínas gp7 y polipéptidos de gp7 son terapéuticamente útiles para amortiguar la actividad tumorígena de células que expresan c-erbb-2. Los mecanismos de la malignidad en células de mamífero han sido objeto de una intensa investigación, y continúan siéndolo. Uno de los campos más prometedores es la elucidación de cómo se activan y se desactivan los oncogenes. Se ha demostrado que diversos oncogenes desempeñan un papel importante en la génesis del cáncer. Las proteínas codificadas por oncogenes funcionan de manera anormal, y parecen desempeñar un papel en la generación de la orden de transformación de una célula normal en una célula cancerosa. Los oncogenes fueron detectados primeramente en retrovirus, y después se han encontrado equivalentes celulares de los oncogenes víricos. A principios de la década de 1970 se identificó por primera vez en el virus del sarcoma de Rous (RSV), que provoca cáncer en los pollos de gallina, un gen retrovírico responsable de una rápida oncogénesis; este gen fue denominado src, como abreviatura de sarcoma. En 197 se halló que el gen src vírico (v-src) tiene una copia casi idéntica en todas las células del pollo; el equivalente celular de v-src es c-src. Desde entonces han sido aislados a partir de retrovirus un cierto número de oncogenes que provocan, entre otras enfermedades, carcinoma, sarcoma, leucemia o linfoma en pollos de gallina, otras aves, ratas, ratones, gatos o monos. En cada caso, se ha hallado que el oncogén está estrechamente relacionado con un gen normal dentro del animal anfitrión, y codifica una proteína oncogénica similar a una proteína normal. También se han descubierto oncogenes en tejidos humanos y animales. Cuando los genes del ADN de diversos tipos de células tumorales son introducidos por transfección en células cultivadas normales, las transforman en células cancerosas. Estos oncogenes son también copias virtuales de proto-oncogenes. Cualquiera que sea el mecanismo específico que convierte un proto-oncogén en un oncogén,el oncogén produce su efecto a través de la proteína que codifica. Parece que los productos de los proto-oncogenes, de los cuales se derivan los oncogenes, desempeñan papeles que son críticos en la regulación del crecimiento y diferenciación celular, y en el desarrollo embrionario. Las proteínas transformadoras puede ejercer sus profundos efectos en las células porque trastornan estos procesos celulares fundamentales. Se sabe que la actividad enzimática que cataliza la adición de una molécula de fosfato a un aminoácido (fosforilación) es importante en el control de la función de la proteína. Las enzimas que fosforilan proteínas son denominadas proteína-cinasas (del griego kinein, mover ). Casi un tercio de todos los oncogenes conocidos codifican proteína-cinasas específicas para restos de tirosina. Cuando se añaden factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) a un cultivo de células que no están en división, estimulan a las células para que se dividan. El EGF y el PDGF envían su señal fijándose a receptores específicos para proteínas, que se encuentran incluidos en la membrana plasmáticade la célula. Cuando se aisló la proteína de receptor para EGF, se halló que estaba asociada con actividad de tirosina-cinasa, la cual es estimulada cuando una molécula de EGF se une al receptor. Después se demostró que el receptor de PDGF tenía una función enzimática similar. Tres grupos de investigadores han identificado proto-oncogenes humanos con actividad de tirosinacinasa: Semba y otros, PNAS(USA), 82: 6497 (1984) (denominaron al gen c-erbb-2); Coussens y 2
3 1 otros, Science, 2:1132 (198) (denominaron al gen HER2); y King y otros, Science, 229:974 (198) (denominaron al gen MAC117). Schecter yotros,science, 229:976 (198) han descrito un gen de rata relacionado (denominado neu). Se ha observado multiplicación del gen y/o traducción incrementada de la expresión del gen en células tumorales y en líneas celulares [véase, por ejemplo, Fukushige y otros, Mol. Cell. Biol., 6:9 (1986), en donde se observó la multiplicación y expresión elevadas (marn) del gen en la línea celular gástrica MKN-7; Coussens y otros, supra, en donde se observó una elevada transcripción del gen en líneas celulares procedentes de un hepatoblastoma, un sarcoma de Ewing, un rabdomiosarcoma, dos neuroblastomas, y un tumor de Wilms; Semba y otros, supra, en donde se observó que el gen estaba multiplicado en un adenocarcinoma de glándula salival humana; King y otros, supra, en donde se observó multiplicación en una línea celular de carcinoma mamario; Yokota y otros,lancet, I:76 (1986), en donde se observó multiplicación del gen en adenocarcinomas de mama, de riñón y de estómago; y Tal yotros,cancer Res., 48:117 (1988), en donde se encontró multiplicación esporádica del gen en adenocarcinomas de diversos tejidos]. El receptor de c-erbb-2 está estrechamente relacionado con el receptor de EGF, pero es distinto. Al igual que en el caso del receptor de EGF, la proteína de c-erbb-2 posee un dominio extracelular, un dominio transmembránico que incluye dos grupos de repetición ricos en cisteína, y un dominio de cinasa intracelular; pero la proteína de c-erbb-2 tiene un peso molecular de dalton (18 kd) mientras que el receptor de EGF tiene un peso molecular de aproximadamente 170 kd [Schechter y otros,nature, 312:13 (1984)]. Hunter, Sci. Am., 1: 70 a 77 (1984), postula que la proteína de c-erbb-2 (gp18) imita la acción de tirosina-cinasa del receptor de EGF, pero de una manera no regulada. Se pueden dividir las tirosina-cinasas en dos grupos funcionales: aquellas en las cuales el producto del gen c-src es un prototipo, y aquellas que funcionan como receptores en la superficie celular. Se han identificado al menos doce tirosina-cinasas de mamífero asociadas con factores de crecimiento celular o con sus receptores. Tres de estos oncogenes comparten una intensa homología con factores de crecimiento [c-sis con factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), hst e int2 con factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)]. Otros comparten una intensa homología con los receptores de factor de crecimiento [c-erbb con el factor de crecimiento epidérmico (EGF), fms con el receptor de factor estimulante de colonias (CSF-1)], para los cuales se han identificado ligandos. Los siete restantes, concretamente eph, c-erbb-2, c-kit, met, ret, c-ros, y trk, pueden ser receptores con ligandos, pero hasta la fecha no se han identificado los ligandos. Existen ahora pruebas crecientes de que algunas células se hacen tumorígenas a causa de alteraciones en sus receptores de la superficie celular. Estas alteraciones pueden consistir en reorganizaciones genéticas, mutaciones puntuales, o multiplicaciones de genes al nivel de ADN, de ARN, o de proteína [Drebin yotros,oncogene, 2:387 (1988); Bargmann yotros,cell, :649 (1986); Der, Clin. Chem., 33:641 (1987)]. Aunque algunos de los receptores antes citados están presentes sobre la superficie de células normales, se ha demostrado que la hiperexpresión de ciertos oncogenes tiene correlación con la actividad tumorígena; tal es el caso de c-erbb-2. Se ha observado ahora que el oncogén c-erbb-2, que es capaz de transformar células hacia la malignidad, está presente a niveles muy altos en algunos tumores [Zhou y otros, Cancer Research, 47:6123 (1987); Berger yotros, Cancer Research, 48:1238 (1988); Kraus yotros, The EMBO Journal, 6(3): (1987); y Slamon y otros, Science, 2:177 (1987)]. La expresión del oncogén c-erbb-2, y su localización en la membrana externa de las células, parecen estar estrechamente relacionadas con el cáncer [Kraus y otros, id; Slamon yotros,id; Drebin yotros,cell, 41:69 (198); y Di Fiore yotros,science, 237:178 (1987)]; de hecho, puede ser la causa principal en el desarrollo del cáncer, al menos en algunos casos [Muller y otros,cell, 4: (1988)]. Parece que la hiperexpresión de la proteína de c-erbb-2 sobre la superficie de células normales hace que se transformen o en cualquier caso actúen como células tumorales [Drebin yotros,supra; Di Fiore yotros,supra; yhudziak yotros,pnas (USA), 84:719 (1987)]. Además, se ha encontrado que pacientes con altos niveles de expresión del oncogén c-erbb-2 presentan muy mal pronóstico clínico [Slamon yotros,science, 2:177 (1987)]. Esta correlación entre la hiperexpresión de c-erbb-2 y un mal pronóstico puede proporcionar información con valor tanto para el diagnóstico como para el pronóstico [Kraus yotros,the EMBO Journal, 6: (1987); y Slamon yotros,id]. Se puede tomar una decisión acerca del grado de terapia clínica requerida por el paciente, basándose en la capacidad de detectar la hiperexpresión del oncogén c-erbb-2 o de su proteína. Se pueden emplear anticuerpos para detectar c-erbb-2 expresado en tejidos tumorales mediante la evaluación de cortes de tejido o mediante la histopatología. La metodología ha demostrado que se pueden lograr indicaciones útiles para el pronóstico [van de Vijver y otros.,mol. and Cell Biol., 7:19 3
4 1 (1987); Zhou yotros,cancer Res., 47:6123 (1987); Berger yotros,cancer Res., 48:1238 (1988); Kraus yotros,supra (1987); y Slamon yotros,supra]. No obstante, se dan muchos casos en los cuales no hay tejido fácilmente disponible, o bien casos en los cuales no es deseable o no es posible extraer tejido de los tumores. Por tanto, existe en la técnica médica la necesidad la necesidad de ensayos diagnósticos rápidos y precisos, que sean convenientes y no traumáticos para los pacientes. La invención reivindicada en la presente invención satisface esta necesidad proporcionando ensayos diagnósticos no invasivos para detectar la hiper-expresión de c-erbb-2 en mamíferos. Smith y otros, Science 238:1704 (1987), han publicado que un exceso de receptor membránico soluble (antígeno CD4) bloquea la capacidad de infección de HIV-1. Se han producido formas secretadas solubles de CD4 mediante la transfección de células de mamífero con vectores que codifican versiones de CD4 que carecen de sus dominios transmembránicos y citoplásmicos. Se ha informado de que el CD4 soluble producido se fija a la glicoproteína de envoltura de HIV-1 (gp1) con una afinidad y especificidad comparables con las del CD4 intacto. Weber y Gill, Science 224:294 (1984), han informado de que células de carcinoma epidermoide humano A431 en cultivo producen una proteína soluble de kd de la cual han determinado que está relacionada con el dominio de la superficie celular del receptor de EGF. Los mismos investigadores han determinado también que la proteína soluble de receptor, de kd, no se derivaba del receptor intacto fijado a la membrana, sino que era producido por la célula de manera separada. Hearing y otros, J. Immunol., 137(1):379 (1986), han demostrado que la inmunización de ratones con un antígeno purificado específico contra melanoma de ratón confirió resistencia frente a una exposición posterior a células de melanoma de ratón en un anfitrión singénico. Bernards yotros,pnas (USA), 84:684 (1987), han demostrado que cuando se ha utilizado para inmunizar ratones un virus recombinante de la viruela vacuna que expresa el dominio externo, el dominio de anclaje transmembránico y aproximadamente aminoácidos del dominio intracelular del oncogén de rata equivalente al oncogén c-erbb-2 humano, el oncogén neu, el mismo ha conferido protección frente a una exposición posterior a células tumorales que expresan neu. Se subraya el hecho de que el ectodominio (dominio externo) de la proteína neu de rata es un determinante sumamente inmunogénico en ratones portadores de tumor (estirpe NFS). Aaronson y otros, en la solicitud del NTIS (National Technical Information Service) titulada A Human Gene Related to but Distinct from EGF Receptor Gene (USSN 6-836,414; presentada el de marzo de 1986), describe la clonación, el aislamiento y la caracterización parcial de un gen humano relacionado con v-erbb que es un miembro de la familia de genes que codifican tirosina-cinasas, y que está multiplicado en un carcinoma mamario humano. Se ha determinado que este gen es c-erbb-2. La mencionada solicitud describe como objetos de la misma el proporcionar lo siguiente: anticuerpos dirigidos contra el producto de proteína codificado por dicho gen, y un equipo para diagnóstico que contiene dichos anticuerpos para la detección de carcinomas; productos codificados por el gen; clones de cadn que son capaces de expresar la proteína en un sistema de vector heterólogo; células transformadas u organismos transformados, capaces de expresar el gen; y sondas de ácido nucleico y/o equipos de reactivos de anticuerpos, capaces de detectar dicho gen o producto de proteína. Esta solicitud sugiere además el uso terapéutico de anticuerpos específicos contra el producto génico que han sido conjugados a una toxina, y sugiere que si existe un ligando para el gen relacionado con v-erbb-2, éste podría ser empleado también como un agente para establecer dianas. Cline y otros describen, en la patente de EE.UU. n 4,699,877 (presentada el de noviembre de 1984), métodos y composiciones para detectar la presencia de tumores, en los cuales se ensaya una muestra fisiológica en busca del producto de expresión de un oncogén. Di Fiore y otros, Science 237:178 (1987), señalan que una amplia variedad de tumores humanos contienen un gen erbb-2 multiplicado o hiperexpresado. Para establecer que no se requiere ninguna interacción ligando-receptor para la transformación a causa de la proteína erbb-2, Di Fiore y otros han elaborado construcciones en las cuales se han eliminado secuencias que codifican los 621 aminoácidos NH 2 -terminales (del dominio externo). Los hallazgos de estos investigadores sugieren que el truncamiento NH2-terminal si acaso, incrementó la actividad transformadora de la proteína erbb-2 (en la página 180). Aboud-Pirak yotros,j. Natl. Cancer Inst. 80():1 (1988), informan de que anticuerpos monoclonales dirigidos contra el dominio extracelular del receptor de EGF disminuyeron la formación in 4
5 vitro de clones de células de carcinoma epidermoide oral humano. Cuando se añadieron los anticuerpos anti-receptor de EGF junto con cisplatino, se demostró que el efecto antitumoral de estos agentes era sinérgico in vivo. 1 Berger y otros, Cancer Research, 48:1238 (1988), han informado de que trece de 1 muestras de ADN ( %) procedentes de tumores de mama humanos primarios contenían copias múltiples del gen c-erbb-2, y han observado que existía una correlación estadísticamente significativa entre la expresión de la proteína de c-erbb-2 y los parámetros utilizados en la prognosis del cáncer de mama (estado nodal y grado en la escala nuclear). Berger y otros señalan que estudios recientes han demostrado que el c-erbb-2 está multiplicado hasta en 33 % de los tumores de mama primarios examinados [King yotros,supra; Slamon yotros,supra; van de Vijver yotros,supra; yventer yotros,lancet 2:69 (1987)] y hasta en % de líneas de células humanas de cáncer de mama [Kraus y otros,supra]. Slamon yotros,supra (1987); han demostrado que la multiplicación del gen c-erbb-2 estaba correlacionada, en pacientes con cáncer de mama, con la presencia de tumores en los nódulos linfáticos axilares, con el estado de receptores de estrógeno, y con el tamaño del tumor primario. En este estudio, se halló que c-erbb-2 estaba multiplicado en una cuantía de 2 a más de veces en % de los 189 cánceres de mama humanos primarios investigados. Slamon y otros concluyeron que la multiplicación del gen c-erbb-2 era un factor pronóstico significativo tanto para la supervivencia global como para el intervalo entre recidivas en el caso de pacientes con cáncer de mama. Los pacientes con múltiples copias del gen en el ADN de sus tumores tuvieron un peor desenlace de la enfermedad, con intervalos más cortos entre recidivas y una supervivencia global más corta. Slamon yotros,cancer Cells 7/Molecular Diagnostics of Human Cancer, página 371 (Cold Spring Harbor Lab. 1989), han informado de que el análisis de la secuencia de diversos clones de ADN procedentes de tumores de cáncer de mama humanos indica que puede ocurrir que, al contrario que en el gen neu de rata, las mutaciones en el dominio transmembránico no sean un requisito absoluto para la alteración del producto génico. En lugar de ello, los datos son consistentes con una alteración que implique la hiperexpresión de un producto normal. Drebin y otros, Cell 41:69 (198), han informado de que un anticuerpo monoclonal contra gp18 de neu provoca que células NIH 3T3 transformadas con neu reviertan a un fenotipo no transformado, como queda evidenciado por la pérdida de la capacidad para el crecimiento independiente de anclaje. Drebin y otros, Oncogene, 2:387 (1988), han demostrado que anticuerpos monoclonales reactivos frente a dominios de gp18 presentes en la superficie externa de la célula pueden inhibir directamente el crecimiento tumoral in vitro e in vivo. Masuko y otros, Japn. J. Cancer Res. 80: (1989), describen una IgM monoclonal murina generada contra células humanas NIH3T3 transfectadas con gen c-erbb-2, que era reactiva frente a diversas líneas celulares de tumores epiteliales que incluyen líneas celulares de cáncer de estómago, de cáncer de colon y de cáncer de hígado, pero no frente a ninguna línea celular no epitelial. Yarden y Weinberg, PNAS (USA) 86:3179 (1989), utilizando como sistema modelo el oncogén neu, han desarrollado diversas aproximaciones experimentales para la detección de ligandos hipotéticos para oncogenes codificadores de tirosina-cinasas transmembránicas que poseen estructuras que recuerdan a las de receptores de factores de crecimiento. Se sugiere en este trabajo un candidato a ligando de la oncoproteína codificada por neu, segregada por fibroblastos tras la transformación por oncogenes ras. Los siguientes artículos proporcionan una descripción general de los oncogenes, del empleo de anticuerpos monoclonales como fármacos terapéuticos, e información acerca del oncogén c-erbb-2: Der, Clin. Chem. 33():641 (1987); Bishop, Science 2: (1987); Henrik y Westermark, Cell 37:9 (1984); Duesberg, Science 228:669 (198); Shively, J. Clin. Immunoassay, 7(1):112 (1984); van de Vijver, Oncogenes 2:17 (1988); y Hunter, Sci. Am. 1:70 (1984). Sumario de la invención Se proporcionan métodos y composiciones para identificar tumores malignos que hiperexpresan c- erbb-2. La invención aquí reivindicada se basa en la detección de la glicoproteína del dominio externo (gp7) codificada por el gen c-erbb-2, o de partes de la misma, en los fluidos biológicos de mamíferos portadores de una carga tumoral. La invención proporciona ensayos diagnósticos específicos para detectar y cuantificar gp7 en los fluidos biológicos de mamíferos, y por tanto para detectar tumores, cuantificar su crecimiento, y proporcionar valiosa información para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad
6 neoplásica. Un nivel elevado de gp7 en los fluidos corporales de un anfitrión, es decir, por encima del nivel base de fijación normal, es indicativo de una hiperexpresión de c-erbb-2 (en la Figura se muestra un nivel base de fijación ilustrativo, con un valor de 1,68%, para una serie de sueros humanos normales). 1 La supervivencia de un paciente con enfermedad neoplásica, tal como adenocarcinoma de mama o de ovario, entre otros cánceres asociados con la multiplicación de c-erbb-2, puede ser determinada mediante el ensayo de un fluido biológico del paciente en busca de la presencia de gp7 o de partes de la misma. Esta invención proporciona además ensayos para detectar y cuantificar anticuerpos contra proteínas gp7/polipéptidos de gp7 en los fluidos corporales de pacientes. Los resultados de estos ensayos, especialmente en conjunción con los resultados de ensayos de esta invención que determinan el nivel de proteínas gp7/polipéptidos de gp7 en los fluidos corporales de un paciente, proporcionan información importante para el diagnóstico y seguimiento del estado del paciente, para decidir un curso de tratamiento, y para realizar un pronóstico. Aún más, esta invención proporciona ensayos para detectar y cuantificar el nivel del ligando putativo de gp7 en los fluidos corporales de un paciente. De manera similar, esta información, especialmente en conjunción con los resultados de los ensayos aquí proporcionados que detectan y cuantifican el nivel de proteínas gp7/polipéptidos de gp7 y de anticuerpos contra los mismos en los fluidos corporales de un paciente, tiene importancia para el diagnóstico y el pronóstico, y es útil en el seguimiento del estado del paciente y para decidir un curso de tratamiento. Tal como se ha indicado más arriba en la sección de Antecedentes, se ha hallado que la multiplicación de c-erbb-2 se correlaciona tanto con una probabilidad reducida de supervivencia a largo plazo como con un intervalo acortado hasta la recidiva en la enfermedad. Los ensayos de esta invención son útiles tanto en el período preoperatorio como en el postoperatorio. Se puede tratar más enérgicamente a pacientes que manifiesten esta multiplicación de c-erbb-2, incluso en estadios relativamente tempranos de la enfermedad, a fin de incrementar sus probabilidades de supervivencia. Además, la presencia de gp7 en un fluido corporal de un paciente tras una operación destinada a extirpar un tumor puede indicar metástasis que requieran una intervención inmediata, por ejemplo la quimioterapia sistémica o la radioterapia. La presente invención satisface la necesidad a la que se ha hecho antes referencia acerca de ensayos no invasivos para diagnóstico y para pronóstico, con el fin de detectar tumores que hiperexpresen c-erbb-2. Esta invención está orientada además a nuevas proteínas y polipéptidos codificadas o codificados por la secuencia de ADN de dominio externo del oncogén c-erbb-2 (en lo que sigue, el gen de gp7) y a la introducción mediante ingeniería bioquímica del gen de gp7 en vectores de expresión adecuados; a la transformación de organismos anfitriones con tales vectores de expresión;y a la producción de proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, por medios recombinantes, sintéticos o biológicos de otro tipo. Estas proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 pueden estar glicosilados o no, preferentemente glicosilados, y pueden ser purificados hasta lograr una pureza sustancial de acuerdo con losmétodos descritos en la presente memoria. Esta invención se refiere además a polipéptidos yproteínas de gp7 que han sido preparados sintética o biológicamente. Un uso para estas proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 se encuentra en las vacunas. Además, las vacunas que proporcionan eficazmente epítopes de gp7 al sistema inmunitario pueden comprender membranas celulares enriquecidas, que hiperexpresen gp7 ó gp18. Estas membranas pueden estar derivadas de anfitriones recombinantes transformados para hiperexpresar c-erbb-2, preferentemente aquellos que hiperexpresan c-erbb-2 en una forma que presenta un dominio interno truncado, o bien pueden estar derivadas de líneas de células cancerosas humanas. Son adicionalmente útiles como vacunas los anticuerpos anti-idiotípicos proporcionados por esta invención. Otro uso para estas proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 se encuentra en agentes terapéuticos que amortiguan la actividad tumorígena, bien sea solos o bien en combinación con agentes quimioterapéuticos. Aún otro uso adicional para estas proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 consiste en detectar el ligando putativo de c-erbb-2 en ensayos de fijación por afinidad. Si se detecta así el ligando en fluidos biológicos de mamíferos, puede ser purificado después mediante el empleo de las proteínas gp7 y los polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, de esta invención; por ejemplo se pueden emplear las proteínas gp7 y los polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 en un procedimiento para purificar el ligando producido mediante ingeniería genética. 6
7 1 Esta invención se refiere además a proteínas o polipéptidos fusionados, que comprenden una proteína gp7 o un polipéptido que manifiesta epítopes de gp7, y unido a los mismos una secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido que no resultan inmunogénica para las personas, y que típicamente no es reactiva frente a anticuerpos presentes en los fluidos corporales humanos. Un ejemplo de una proteína o polipéptido semejante lo constituye el alfa-péptido de la beta-galactosidasa. Se encuentran incluidos en la presente invención, además, aquellas proteínas o polipéptidos fusionados, recombinantes, que son sustancialmente puros y no se encuentran en la naturaleza. Esta invención se refiere además a moléculas de ADN purificadas y aisladas que comprenden el gen de gp7 o fragmentos del mismo, que codifican un polipéptido que manifiesta epítopes de gp7. Otro aspecto de esta invención se refiere a anticuerpos contra estas proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7. Aún otro aspecto adicional de esta invención lo constituyen anticuerpos anti-idiotípicos para estos anticuerpos contra proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7. Aún otro aspecto adicional de esta invención se refiere a ensayos diagnósticos para gp7 que utilizan las proteínas gp7 y los polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, gp7 de esta invención, producidos de manera sintética o biológicamente por cualquier otro medio, y/o anticuerpos para los mismos. La invención proporciona también equipos de reactivos para poner en práctica estos análisis, los cuales equipos de reactivos comprenden anticuerpos contra proteínas gp7 o polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, y/o anticuerpos contra el dominio externo intacto de c-erbb-2 ( intacto indica en esta memoria que la gp7 está expresada sobre la superficie de las células. Estos análisis pueden adoptar la forma de ensayos en fase sólida, pero no están limitados a ello, sino que también pueden tener un formato de fase líquida y pueden estar basados en ELISAs, ensayos con partículas, ensayos radiométricos o fluorométricos, bien sea sin amplificación o amplificados, empleando la tecnología de avidina/biotina, por ejemplo. La invención proporciona además anti-idiotipos contra anticuerpos monoclonales que reconocen proteínas gp7/poli-péptidos que manifiestan epítopes de gp7, los cuales pueden sustituir a las proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 en los ensayos diagnósticos de esta invención. La Figura 1 muestra un cromatograma de inmunoafinidad de proteína de dominio extracelular de c-erbb-2 (gp7) recombinante expresada por células CHO. Se cargó el sobrenadante de CHO concentrado en una columna de inmunoafinidad de 0, x,0 cm con un caudal de 0,2 µl/minuto. Después se lavó con PBS la columna a un caudal de 0, µl/minuto hasta que la absorbancia a 280 nm (A280 nm) del efluente de la columna alcanzó la línea de base. El material fijado específicamente fue eluido con un gradiente escalonado, que se indica con la flecha, de glicina-hcl 0 mm, ph=2,, con un caudal de 0,2 µl/minuto. La Figura 2 muestra un SDS-PAGE de fracciones de la columna de inmunoafinidad de gp7 de c- erbb-2 producida de manera recombinante, tal como se ha descrito antes en el párrafo acerca de la Figura 1. Se prepararon muestras de cada fracción en tampón para muestras de Laemmli, y se desarrollaron en un gel de poliacrilamida al %. El gel fue teñido con azul de Coomasie R-2. La Figura 2 muestra una tinción tipo Western. Se desarrolló un gel idéntico al desarrollado en la Figura 2A, y se transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa de 0,22 µm las proteínas separadas. Se sondeó la membrana empleando anticuerpo policlonal de conejo preparado contra un fragmento recombinante de gp18 expresado en E. coli (anticuerpo 92A). El anticuerpo específicamente fijado fue visualizado mediante el empleo de conjugado de peroxidasa de rábano anti-conejo, de cabra, y sustrato Indophane (Vio-medics, Worcester, MA, EE.UU.). Las pistas fueron cargadas de la manera siguiente: pista 1: sobrenadante de CHO concentrado; pista 2: patrones de peso molecular pre-teñidos (Bethesda Research Laboratoires, Gaithersburg, MD, EE.UU.); y pistas 3-7: fracciones 1- de la columna de inmunoafinidad (según se indica en la Figura 2A). La Figura 3 muestra un mapa de restricción parcial del vector clonante, pfrsv. Este vector contiene una unidad de transcripción puesta en marcha por una región primitiva de promotor y origen de SV, así como la gran secuencia intercalada de antígeno T de SV (corte y empalme de -marn) y la región primitiva del sitio de poliadenilación. Un segundo cassette de transcripción contiene un gen DHFR mutante, el marcador seleccionable dominante que codifica la resistencia a metotrexato (MTX). 7
8 El fragmento c-erbb-2sec de 2,2 kb fue subclonado en el único sitio EcoRI situado aguas abajo del primer origen/promotor de SV, a fin de generar pfrsv-c-erbb-2sec. 1 La Figura 4 muestra un SDS-PAGE en el cual las pistas fueron cargadas de la manera siguiente: pistas 1 y 9: patrón; pistas 2-6: un fragmento soluble de c-erbb-2 expresado por transfectantes c-erbb-2 de NIH3T3 compite con gp7 en cuanto a la fijación a TAb 2 anti-c-erbb-2; pistas 2-6: se incubaron cantidades crecientes de lisado celular procedente de NIH3T3-c-erbB-2, durante 7 horas, con µg de TAb 2 anti-c-erbb-2, seguido de incubación durante horas de 0 µl de sobrenadante marcado in vitro recogido de células CHO que expresan gp7; pista 7: lisado de clon CHO que expresa gp7 marcado in vivo inmunoprecipitado con mab de mieloma de ratón, testigo no específico emparejado por isotipo, (IgG1); pista 8: lisado de gp7 de CHO inmunoprecipitado con TAb 2. La Figura muestra la radioinmunoprecipitación de gp7 a partir de sobrenadantes de cultivos celulares. Pistas 1 y 12: marcadores de peso molecular; pistas 3-6: sobrenadante de células SKBR3 concentradas 12x y precipitadas con policlonal de conejo pista 3; pista 4: progenitor de hibridoma anti-c-erbb-2 murino A-29; pista : monoclonal anti-c-erbb-2 murino TAb 2; pista 6: monoclonal de receptor anti- EGF murino Amersham; pistas 7-: sobrenadante de células 3T3 transformadas con el oncogén c-erbb-2 concentrado 6x; no se concentró el medio lo suficiente para visualizar una señal precipitable. La Figura 6 muestra la radioinmunoprecipitación de sobrenadantes de líneas celulares positivas y negativas con respecto a c-erbb-2. Pistas 1 y 12: marcadores de peso molecular; pistas 2 y 4: sobrenadante de MDA4 concentrado 12x y precipitado con TAb 2; pistas 3 y : el mismo sobrenadante precipitado con anticuerpo anti-receptor de EGF Amersham; pistas 6 y 7: sobrenadante concentrado 12x procedente de cultivos MDA468 precipitado con TAb 2 y anticuerpo anti-receptor de EGF, respectivamente; pistas 8 y 9: no tienen relación; pistas y 11: sobrenadante testigo procedente de células 3T3 transfectadas, concentrado 12x y precipitado con TAb2 y anticuerpo anti-receptor de EGF. La Figura 7 muestra curvas patrón de proteínas gp18 y gp7 parcialmente purificadas en el ensayo IRMA en emparedado, empleando TAb 9 como anticuerpo de captura y TAb 6 como anticuerpo secundario radiomarcado. El ensayo es capaz de detectar tanto la proteína c-erbb-2 completa parcialmente purificada procedente de células NIH3T3 transfectadas, como la proteína de dominio externo purificada a partir del sobrenadante de células CHO transfectadas. El ensayo es aproximadamente 0 veces más sensible cuando se utiliza como patrón el gp7 parcialmente purificado. La Figura 8 muestra la detección de un antígeno diseminado en sueros de ratones carentes de sistema inmune, portadores de tumores inducidos por células NIH3T3 transfectadas por c-erbb-2, cuando son analizados en el ensayo IRMA en emparedado TAb 9/6. Todos los sueros fueron ensayados a una dilución 1: (vol./vol.), y la fijación de base de un combinado pretumoral de sueros en este ensayo es 1,7 %. La curva patrón que emplea la proteína gp7 para este ensayo es comparable a la mostrada en la Figura 7. Son detectables señales en ratones con tamaños de tumor de 0 a mm 3,ycontinúan aumentando hasta que los tumores alcanzan a.000 mm 3. La Figura 9 muestra el análisis de sueros de ratones carentes de sistema inmune, procedentes de ratones portadores de tumores inducidos por células NIH3T3 transfectadas con el gen c-erbb-2, y tratados bien con TAb 2, bien con PBS, o bien con IgG1, y analizados en el ensayo IRMA en emparedado TAb 9/6. Los sueros proceden de diversas fechas de extracción de sangre a lo largo de un mes de duración del experimento, y son analizados a una dilución 1:. En el momento en que son analizados sus sueros, los ratones han recibido 2-8 tratamientos (0-0 µg/tratamiento) con TAb 2, o bien con un MAb reactivo con el dominio externo de c-erbb-2, o bien con IgG1, o bien con PBS. En el ensayo se analizan seis sueros pretumorales, y se determina la fijación media. Se determina el valor umbral de base en la prueba como la media de los sueros pretumorales + 2 desviaciones típicas por encima de esta media, o sea, 2,2 %. Los ratones tratados con PBS diseminaron una cantidad de antígeno que se sitúa significativamente por encima de la línea base para volúmenes de tumor de mm 3 (n=7), mientras que los ratones tratados con TAb 2 diseminaron escaso antígeno detectable con el mismo volumen de tumor (n=). Con volúmenes de tumor mayores, la capacidad de detección de antígeno diseminado está aún suprimida en sueros de ratones tratados con TAb (n=9), en comparación con sueros de ratones tratados con PBS (n=8). La Figura muestra los resultados del análisis para doce sueros humanos de voluntarios normales en el ensayo IRMA en emparedado TAb 9/6, con una dilución 1: (vol./vol.). Empleando estos sueros, se determinó un nivel de fijación base de 1,68 % (media + dos desviaciones típicas). 8
9 1 La Figura 11 muestra los resultados del análisis para series de extracciones de sangre de veinte pacientes con cáncer de mama, en el ensayo IRMA TAb 9/6, con una dilución 1:. Las series de muestras fueron tomadas a lo largo del curso de la enfermedad y de la terapia. Para los pacientes 1-4 se tomó la muestra [a] en el momento del primer diagnóstico, un día antes de la extirpación quirúrgica del tumor. Para los pacientes -, la muestra [a] fue tomada varios días después de la extirpación quirúrgica del tumor, y para los pacientes 11-, la muestra [a] fue tomada en el momento del primer acontecimiento de recidiva o en acontecimientos de recidiva posteriores. El resto de las muestras [b-f] (4 ó para cada paciente) fueron tomadas a intervalos diversos a lo largo del curso de la terapia, y no se corresponden con un estado particular de la enfermedad o con una respuesta particular a la terapia. El valor umbral de base para este ensayo era 1,68 %. La Figura 12 muestra las curvas de valoración de tres sueros humanos de pacientes con cáncer de mama en el ensayo IRMA TAb 9/6, comparadas con el patrón gp7 y con un suero humano normal. Todos los sueros fueron ensayados a una dilución 1:, y el valor umbral de base para el ensayo fue 1,6 %. Para el paciente 19a, la muestra de suero fue extraída cuando el paciente 19 presentó metástasis aproximadamente un año y medio después de que se le hubiese extirpado el tumor primario. El paciente 19 murió unaño y medio después de que se tomase esta muestra. La muestra de suero 7e fue extraída del paciente 7 tras el primer fracaso, con metástasis hepáticas y en la médula ósea, siete meses después de que se hubiera diagnosticado el tumor primario. El paciente 7 murió seis días después de que se tomase esta última muestra. La muestra de paciente 4f fue extraída tras el primer fracaso, con metástasis hepáticas y nodales, dos años después de que se hubiera diagnosticado el tumor primario. El paciente 4 murió seis meses después de que tomase esta muestra [f]. La Figura 13 muestra los resultados de ensayos competitivos en los cuales se determina la capacidad de diversos lisados celulares para competir con la fijación de TAb 1 a un lisado de células NIH3T3 transfectadas con el gen c-erbb-2. Cada una de las líneas SKOV3, BT474 y NIH3T3 t hiperexpresó la proteína gp18, y los lisados de estas líneas compiten con una concentración creciente de proteína. Un lisado de NIH3T3 testigo no presentó competencia. La Figura 14 muestra los resultados de un ensayo competitivo en el cual un sobrenadante de una línea celular CHO transfectada con la porción gp7 del gen c-erbb-2 compite contra un lisado de células NIH3T3 t en cuanto a la fijación de TAb 1. El sobrenadante de células CHO no transfectadas no presentó competencia. La Figura 1 muestra resultados de análisis que indican que suero de ratones carentes de sistema inmune, procedentes de animales portadores de tumores inducidos por células NIH3T3 transfectadas con c-erbb-2 son capaces de competir contra un lisado de células NIH3T3 t en cuanto la fijación de TAb 1. Los sueros de los ratones 2-4, con tamaños de tumor superiores a 1.0 mm 3, son capaces de competir, mientras que el suero del ratón 1 y una mezcla de sueros pretumorales no compiten en el ensayo. La Figura 16 muestra las secuencias nucleotídicas y de aminoácidoscompletas del gen c-erbb-2 (Coussens y otros, supra). El dominio externo gp7 comprende la región desde aproximadamente el aminoácido número 22 (serina; ser-22) hasta aproximadamente el aminoácido número 63 (serina; ser-63) (ambos aminoácidos están marcados con círculos negros encima de ellos). El concepto que subyace a las múltiples facetas de esta invención es el descubrimiento de que las células que hiperexpresan c-erbb-2 diseminan el dominio externo de c-erbb-2 (gp7) en los fluidos corporales del mamífero anfitrión. Los Ejemplos 1, 4, y 6 subrayan los indicios que condujeron a este hallazgo. Se encontró un derivado soluble de c-erbb-2 (gp7) en los sobrenadantes de células que expresaban gp7, transformadas de manera estable; se halló que la proteína tenía un peso molecular de aproximadamente 7kD, y que competía con una proteína presente en el lisado de células NIH3T3 t (células que expresan c-erbb-2) (Ejemplo 1). Los Ejemplos 4, y 7 detallan respectivamente la detección del antígeno diseminado, con características de fijación por afinidad del dominio externo de c-erbb-2, en los sueros de ratones carentes de sistema inmune portadores de tumores inducidos por células NIH3T3 transfectadas con c-erbb-2 (NIH3T3 t ), en sobrenadantes de cultivos tumorales humanos, y en sueros humanos procedentes de pacientes con cáncer de mama. Este descubrimiento ha despejado el camino para el desarrollo de nuevos métodos y composiciones para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades neoplásicas en seres humanos y otros mamíferos. Ensayos En la presente memoria se proporcionan ensayos para detectar y cuantificar tres diferentes entida- 9
10 1 des en los fluidos corporales de mamíferos, preferentemente seres humanos, siendo estas entidades las siguientes: proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7; anticuerpos contra proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7; y el ligando putativo de c-erbb-2. Cada uno de los ensayos proporciona información importante acerca del estado de la enfermedad del paciente, y son individualmente útiles para ensayar discriminantemente mamíferos en busca de enfermedades neoplásicas, diagnosticar enfermedades neoplásicas, seguir el progreso de la enfermedad, y para pronosticar el curso de la enfermedad y decidir protocolos de tratamiento apropiados. Sin embargo la correlación de los resultados para uno o más de estos ensayos, preferentemente los resultados de los tres ensayos, proporcionan el mejor perfil del estado morboso de un paciente. Por ejemplo, puede ocurrir que un paciente presente un tumor de gran tamaño y sin embargo el nivel de gp7 del paciente puede ser relativamente bajo. Esta bajo valor de la lectura puede ser debido a la generación por parte del paciente de anticuerpos contra las proteínas gp7/polipép-tidos que manifiestan epítopes de gp7, y no a un pequeño tamaño del tumor. Otro ejemplo de cómo la correlación de los datos proporciona una visión más amplia del estado del paciente se refiere a la relación del ligando putativo para gp7. Puede ocurrir que un paciente presente un nivel elevado de proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, circulantes, pero no padezca enfermedad neoplásica si dicho paciente no está produciendo el ligando putativo; si no existe ligando, el receptor para c-erbb-2 en la superficie de la célula no puede ser estimulado por el mismo para comenzar el crecimiento descontrolado. Por tanto, la relación de ligando a gp7 es significativa dentro del modelo según el cual un complejo de ligando/receptor es el mecanismo por el cual el proto-oncogén es activado a oncogén. Determinación de proteínas/polipéptidos de gp7 que manifiestan epítopes de gp7, en fluidos corporales de mamíferos Se proporcionan ensayos diagnósticos no invasivos para detectar proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, en fluidos corporales de mamíferos, preferentemente de seres humanos, y cuantificar en los mismos el nivel de dichas proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7. La expresión proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 es empleada en este contextocomoelantígeno diana presente en los fluidos corporales, ya que, en el seno de los fluidos corporales de un paciente, la proteína gp7 diseminada puede ser escindida en diversos fragmentos que constituyen proteínas (cuando tienen más de aminoácidos) y polipéptidos (con menos de aminoácidos). Estos ensayos proporcionan medios valiosos para realizar el seguimiento del estado de las enfermedades neoplásicas. Además de mejorar la precisión del pronóstico, el conocimiento del estado de la enfermedad permite que el médico que atiende al paciente individual elija la terapia más apropiada para el mismo. Por ejemplo, se puede tratar rigurosamente, usualmente por medio de quimioterapia sistémica y/o radioterapia, a los pacientes con elevada probabilidad de recidiva. Cuando existe una menor probabilidad de recidiva se pueden elegir terapias menos agresivas. Debido al profundo sufrimiento causado en el paciente por los regímenes terapéuticos más agresivos, sería deseable distinguir con un alto grado de certeza a aquellos pacientes que requieran estas terapias agresivas. La presente invención es útil para realizar ensayos discriminantes entre una amplia variedad de enfermedades neoplásicas, que incluyen tanto tumores sólidos como cánceres hematopoyéticos. Las enfermedades neoplásicas ilustrativas incluyen carcinomas, tales como adenocarcinomas y melanomas; tumores mesodérmicos, tales como neuroblastomas y retinoblastomas; sarcomas, tales como osteosarcomas, sarcoma de Ewing, y diversas leucemias; y linfomas. Presentan particular interés tumores de mama, de ovario, del tracto gastrointestinal, incluyendo en particular el colon y el estómago, de hígado, de la glándula tiroides, de la glándula prostática, cerebrales, de páncreas, del tracto urinario (inclusive la vejiga), y de las glándulas salivales. Presentan un interés aún más particular tumores de la glándula prostática, de ovario y de mama. Aún más específicamente, se han estudiado ampliamente adenocarcinomas de mama y de ovario, y han confirmado la hiperexpresión de c-erbb-2. Los fluidos corporales que presentan un interés particular para la determinación de gp7 de acuerdo con la invención incluyen suero, semen, exudado mamario, saliva, orina, citosoles, plasma, y fluido cerebroespinal. Para realizar los ensayos discriminantes de acuerdo con la invención, el suero es un fluido corporal preferido. A partir del conocimiento de la estructura del dominio externo del oncogén c-erbb-2 (gp7), se pueden generar diversos anticuerpos monoclonales o policlonales que reconozcan específicamente esta proteína.
11 1 Puesto que gp7 es liberada única y específicamente de la superficie de tumores asociados con la multiplicación de c-erbb-2, y puede existir libremente en los fluidos biológicos de mamíferos, es posible detectar y cuantificar los niveles de esta proteína. Utilizando técnicas actuales de detección de anticuerpos que pueden cuantificar la fijación de anticuerpos monoclonales preparados de manera específica contra el dominio externo del oncogén c-erbb-2, se puede determinar la cantidad de dominio externo presente en los fluidos de pacientes de cáncer. Este ensayo puede ser utilizado para detectar tumores, cuantificar su crecimiento, y ayudar al diagnóstico y al pronóstico de la enfermedad en seres humanos. Los ensayos implican el empleo de anticuerpos monoclonales o policlonales que pueden estar marcados adecuadamente con el fin de detectar y cuantificar gp7 en fluidos corporales de mamíferos. El objeto de la invención es proporcionar métodos y composiciones para evaluar la probabilidad de la presencia de células malignas dentro de un grupo de células normales dentro del anfitrión, o bien en células recientemente extraídas del anfitrión. Un método preferido implica, como primer paso, obtener una cantidad purificada del dominio externo del oncogén c-erbb-2 y emplearlo como inmunógeno para generar anticuerpos monoclonales en ratones u otros anfitriones adecuados. Los anticuerpos monoclonales deben reaccionar específicamente con epítopes de gp7. De manera alternativa, podrían utilizarse como fuente de antígeno células intactas completas que expresasen c-erbb-2 en la superficie de su membrana. Posiblemente se podrían generar numerosos anticuerpos monoclonales que reconociesen diferentes epítopes del dominio externo, y se podrían emplear estos anticuerpos monoclonales, bien fuera individualmente o en combinación, como un cóctel para aumentar la especificidad y sensibilidad de un ensayo. Además de emplear como inmunógeno el dominio externo completo, para generar anticuerpos monoclonales específicos también se pueden emplear fragmentos de esta proteína, o bien proteína generada por técnicas de ADN recombinante. Del mismo modo también se podrían utilizar como fuente de inmunógenos polipéptidos que manifiesten epítopes de gp7 correspondientes a diversas secuencias dentro de la secuencia del dominio externo. En todos los casos, los anticuerpos generados poseerían una especificidad tal que tendrían un reactividad cruzada muy limitada con otras proteínas presentes tanto en la superficie de células tumorales como en la superficie de células no tumorales. Por ejemplo, no reaccionarían con el receptor de EGF que está presente en la superficie de muchas células normales. El ensayo diagnóstico en sí implicaría típicamente obtener una pequeña cantidad de fluido corporal, preferentemente suero, del anfitrión humano. A continuación se puede cuantificar la presencia del dominio externo de c-erbb-2 en el suero empleando diversos ensayos diagnósticos basados en anticuerpos, bien definidos. Estos ensayos pueden ser tinciones tipo Western, ELISAs (ensayos con inmunosorbente ligado a enzima), ensayos RIA (radioinmunoensayos), o ensayos en emparedado con dos anticuerpos, todos ellos utilizados comúnmente en la industria del diagnóstico. En todos los casos, la interpretación de los resultados está basada en la asunción de que el anticuerpo o combinación de anticuerpos no va a reaccionar cruzadamente con otras proteínas o fragmentos de proteína presentes en el suero, que no estén relacionados con c-erbb-2. Estos métodos están basados en el hecho de que la presencia del dominio externo de c-erbb-2 está estrechamente correlacionada con la presencia de un tumor, tal como se ha esbozado antes en el apartado Antecedentes. Estos ensayos pueden ser utilizados para detectar la presencia de un tumor, detectar el crecimiento continuado de un tumor, y detectar la presencia de metástasis cancerosas, así como para confirmar la ausencia o la eliminación de todo el tejido tumoral después de una intervención quirúrgica, quimioterapia contra el cáncer, o radioterapia. Pueden ser empleados también para realizar el seguimiento de la quimioterapia contra el cáncer, y vigilar la reaparición de tumores. El Ejemplo 3 detalla el formato de un método diagnóstico preferido de esta invención - un ensayo radioinmunométrico (IRMA) en doble emparedado. Evidentemente, también están disponibles muchos otros formatos para la detección de gp7 en fluidos corporales, que incluyen por ejemplo ensayos con inmunosorbente ligado a enzima (ELISA). Es representativo de un tipo de ensayo ELISA un formato en el cual se reviste una placa de microvaloración con anticuerpos contra proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, o bien anticuerpos contra células completas que expresan c-erbb-2 (es decir, contra gp7 intacta), y preferentemente lo hiperexpresan, y se añade a la misma una muestra del suero del paciente. Después de un período de incubación que permite que todos los antígenos se fijen a los anticuerpos, se lava la placa y se añade otro conjunto de anticuerpos anti-gp7 que están unidos a una enzima, se incuba para permitir que tenga lugar la reacción, y después se lava de nuevo la placa. Después de esto se añade a la placa de microvaloración sustrato del enzima, y se incuba durante un período de tiempo que permita que la enzima actúe sobre el sustrato, y se mide la absorbancia del preparado final. Un gran cambio de la absorbancia indica un resultado positivo. Resulta también evidente para un especialista en la técnica de los ensayos diagnósticos que se pueden utilizar anticuerpos contra proteínas gp7 y/o polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, con el fin de detectar y cuantificar la presencia de gp7 en los fluidos corporales de pacientes. En una de tales realizaciones se emplea un inmunoensayo competitivo en el cual se marca la proteínagp7y/oelpo- 11
12 1 lipéptido que manifiesta epítopes de gp7, y se añade un fluido corporal para competir en la fijación de la gp7 marcada, contra anticuerpos específicos contra proteína gp7/polipéptido que manifiesta epítopes de gp7. Este tipo de ensayo podría ser empleado para detectar proteína gp7/polipéptido que manifiesta epítopes de gp7. En otra realización se puede emplear un ensayo inmunométrico en el cual se emplea un anticuerpo contra una proteína gp7 o un polipéptido que manifiesta epítopes de gp7, marcados. En un ensayo de este tipo, la cantidad de anticuerpo marcado que se acompleja con el anticuerpo fijado a antígeno es directamente proporcional a la cantidad de gp7 presente en el fluido corporal. Por medios bien conocidos en la técnica, en particular el procedimiento de Kohler y Milstein publicado en Nature, 6: (197), se pueden obtener anticuerpos monoclonales para ser empleados en los ensayos de esta invención. Estos métodos de diagnóstico pueden ser configurados como equipos de reactivos para determinar gp7 en fluidos corporales de mamíferos, preferentemente de seres humanos, pudiendo comprender estos equipos de reactivos anticuerpos, poli- y/o monoclonales, contra proteínas gp7 y/o contra polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, y/o contra anticuerpos contra células completas que expresan c-erbb-2 (es decir, contra gp7 intacta). Estos equipos de ensayo para diagnóstico pueden comprender además otro conjunto de anticuerpos, poli- y/o monoclonales, para un formato tipo emparedado, en el cual dicho segundo conjunto de anticuerpos está adecuadamente marcado. Una vez que se han preparado anticuerpos que poseen una especificidad adecuada, se encuentran disponibles una amplia variedad de métodos de ensayo inmunológicos para determinar la formación de complejos anticuerpo-antígeno específicos. En las publicaciones científicas y de patentes se encuentran descritos numerosos ensayos de fijación competitiva y no competitiva de proteína, y se encuentran disponibles comercialmente un gran número de pruebas de este tipo. Los inmunoensayos ilustrativos que son adecuados para detectar el antígeno en el suero incluyen los descritos en las patentes de EE.UU. números 3,791,932; 3,817,837; 3,839,13; 3,8,72; 3,8,78; 3,83,987; 3,867,17; 3,879,262; 3,901,64; 3,9,074; 3,984,33; 3,966,3; 4,034,074; y 4,098,876. Los anticuerpos empleados en estos ensayos pueden estar o no marcados. Los anticuerpos no marcados se pueden utilizar en la aglutinación; los anticuerpos marcados pueden ser empleados en una amplia variedad de pruebas, y utilizando también una amplia variedad de marcas. En algunas técnicas resultará útil marcar el antígeno o un fragmento del mismo, en lugar del anticuerpo, y estudiar la competencia por el anticuerpo entre el antígeno marcado y el antígeno presente en la muestra. En esta situación es común habitual proporcionar equipos que contienen la combinación de antígeno marcado o fragmente de antígeno marcado, y anticuerpo, en cantidades que procuran una sensibilidad y precisión óptimas. En otras situaciones es deseable disponer de un soporte sólido al cual estén fijados bien sea el antígeno o bien el anticuerpo. Un antígeno poliepitópico puede actuar como puente entre el anticuerpo fijado a un soporte y un anticuerpo marcado presente en el medio de ensayo. De manera alternativa, se puede estudiar la competencia entre el antígeno marcado y cualquier antígeno presente en la muestra por una cantidad limitada de anticuerpo. Los medios de detección adecuados incluyen el empleo de marcas tales como radionúclidos, enzimas, marcas fluorescentes, marcas quimioluminiscentes, sustratos o cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, partículas y colorantes. Estos reactivos marcados pueden ser empleados en una diversidad de ensayos bien conocidos, tales como radioinmunoensayos, inmunoensayos con enzima, por ejemplo ELISA, e inmunoensayos fluorescentes. Véanse por ejemplo las patentes de EE.UU. números 3,766,162; 3,791,932; 3,817,837; y 4,233,2. Determinación de anticuerpos contra proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 Tal como se ha indicado antes, el nivel de anticuerpos contra proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 en el seno de los fluidos corporales de un paciente es un parámetro importante dentro de los ensayos discriminantes en busca de enfermedades neoplásicas, en el seguimiento y en el pronóstico del curso de la enfermedad, y en la decisión de un curso de tratamiento. Una prueba representativa para la detección de tales anticuerpos es un ensayo competitivo en el cual se precipita proteína gp7 o polipéptido que manifiesta epítopes de gp7, por anticuerpos presentes en el suero de un paciente, en combinación con anticuerpos monoclonales que reconocen proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7. Un técnico especializado podría adaptar cualquiera de los formatos que se han bosque- 12
13 jado y a los cuales se ha hecho referencia en el capítulo anterior, para detectar anticuerpos anti-gp7 a fin de cuantificar los anticuerpos contra gp7. 1 Determinación del ligando putativo de c-erbb-2 Un ensayo para detectar y cuantificar el nivel del ligando putativo del receptor de c-erbb-2 resulta similarmente útil para el diagnóstico y exploración rápida en busca de enfermedades neoplásicas, y para el seguimiento y pronóstico del curso de la enfermedad y la elección de los programas de tratamiento. Un ensayo de este tipo resultaría especialmente útil en combinación con uno de los anteriores ensayos para proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, y anticuerpos contra los mismos, y más preferentemente en combinación con estos dos ensayos. Un formato representativo para un análisis de este tipo en busca del ligando de c-erbb-2, que utiliza proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, implica el unir proteínas/polipéptidos de gp7 que manifiestan epítopes de gp7, purificados, con preferencia sustancialmente puros, a una superficie de material plástico u otro soporte sólido, bien sea a través de su propia fijación a esta superficie, o através de una captura con anticuerpo anti-gp7. Utilizando un ensayo competitivo de ligando marcado con una cantidad desconocida de ligando sin marcar, e instrumentación diagnóstica habitual, se puede cuantificar la concentración de este último en base a su fijación a las proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7. Formatos alternativos, marcas alternativas, y en general cualesquiera otras modificaciones que se encuentren dentro del ámbito de conocimiento de los especialistas en la técnica tal como ha sido bosquejado en lo que antecede con relación a los ensayos para proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, se aplican de manera similar a los ensayos para detectar y cuantificar el ligando putativo para c-erbb-2. Anticuerpos anti-idiotípicos contra anticuerpos contra proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 Se encuentran comprendidos también dentro del alcance de esta invención anticuerpos anti-idiotípicos contra anticuerpos contra proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7. En cada uno de los análisis que se han bosquejado en lo que antecede, se pueden reemplazar las proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 por dichos anticuerpos anti-idiotípicos. Aún más, y tal como se señala en el apartado de Vacunas, estos anticuerpos anti-idiotípicos pueden ser empleados como agentes inmunogénicos. Los anticuerpos anti-idiotípicos contra anticuerpos contra proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 son preparados esencialmente tal como se ha bosquejado antes en el capítulo Métodos: Preparación de anticuerpos monoclonales contra c-erbb-2, efectuando la inmunización inicial con el anticuerpo anti-gp7 apropiado, en lugar de con las células NIH3T3 t. En este método se sigue de manera similar el protocolo de fusión. El procedimiento de discriminación consiste en un ensayo discriminante primario en cuanto a fijación al anticuerpo monoclonal anti-gp7 originalempleado para la inmunización, y un ensayo discriminante secundario que comprende un ensayo competitivo, por ejemplo un ensayo radiométrico, en el cual la proteína gp7 o el polipéptido que manifiesta epítopes de gp7, apropiada, compite con los anticuerpos anti-idiotípicos producidos en la fusión, para fijarse al anticuerpo monoclonal anti-gp7 original, marcado radiactivamente. Equipos de reactivos Los ensayos bosquejados en lo que antecede pueden estar configurados en forma de equipos de reactivos. Estos equipos de reactivos pueden comprender anticuerpos contra proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, y/o anticuerpos contra gp7 intacta (es decir, presente en la superficie de células que expresan c-erbb-2). Estos anticuerpos pueden ser poli- y/o monoclonales. Además, estos equipos de reactivos pueden comprender proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, solos o en combinación con los anticuerpos antes mencionados. Tal como se ha indicado antes, en estos equipos de reactivos las proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 pueden ser reemplazadas por anticuerpos anti-idiotípicos contra anticuerpos anti-gp7. Sería ilustrativo un equipo de reactivos para determinar el ligando putativo, en el cual se han aplicado como revestimiento sobre una superficie proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, o 13
14 1 bien han sido capturados sobre la misma, o bien han sido aplicados como revestimiento sobre una superficie anticuerpos anti-idiotípicos contra anticuerpos anti-gp7. De manera alternativa, este tipo de análisis puede ser formulado como un ensayo competitivo, tal como ha sido bosquejado antes. Naturalmente, estos análisis no están limitados a ensayos en fase sólida, sino que pueden realizarse en un formato en fase líquida, y pueden estar basados en ensayos de inmunosorbente unido a enzima (ELISAs), ensayos con partículas, ensayos radiométricos o fluorométricos, bien sea sin amplificación o amplificados, empleando la tecnología de avidina/biotina, por ejemplo. Preparación de proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 Las proteínas gp7 y los polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, de esta invención, pueden ser preparados de diversas maneras. Un método preferido para preparar proteínas de gp7 utiliza técnicas recombinantes. Más adelante, en el Ejemplo 1, se describe un método recombinante representativo de esta invención. Las proteínas gp 7 y los polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, de esta invención, pueden ser preparados de manera sintética o bien biológicamente, es decir, escindiendo por métodos enzimáticos y/o químicos proteínas y polipéptidos más largos. Estos métodos sintéticos y biológicos están descritos con detalle más adelante, en el capítulo Producción sintética y biológica de proteína gp7 y de porciones polipeptídicas de la misma. Estos métodos son los preferidos para preparar polipéptidos de gp7. Clonación de la secuencia de gp7 o de fragmentos de la misma El plásmido pfrsv-c-erbb-2sec, construido de acuerdo con el Ejemplo 1, es sólo representativo de las muchas moléculas de ADN recombinante posibles que pueden ser preparadas de acuerdo con esta invención. Dependiendo de las endonucleasas de restricción empleadas, se puede clonar, expresar y emplear de acuerdo con esta invención toda la secuencia del dominio externo de c-erbb-2, o bien parte de la misma. Las enzimas de restricción útiles de acuerdo con esta invención pueden incluir enzimas que escinden ADN de manera tal que el fragmento de ADN generado contenga porciones de la secuencia de gp7. Considerando debidamente los factores expuestos en la presente memoria, los especialistas en la técnica pueden seleccionar endonucleasas de restricción apropiadas, sin salir del alcance de la invención. PSV7186 es un vehículo de clonación representativo empleado en el Ejemplo 1. No obstante, para clonar el ADN de gp7 se pueden emplear satisfactoriamente una amplia variedad de combinaciones de anfitrión y vehículo de clonación. Por ejemplo, los vehículos de clonación útiles pueden incluir secuencias de ADN cromosómicas y no cromosómicas, y secuencias de ADN sintéticas tales como diversos plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo pbr322, otros plásmidos de E. coli y sus derivados, plásmidos con un abanico de anfitriones más amplio, tales como RP4, ADNs de fago tales como los numerosos derivados del fago lambda, por ejemplo NB989, y vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADNs de fago tales como plásmidos, que han sido modificados para emplear secuencias de control de expresión de ADN de fago. Los anfitriones útiles pueden ser eucariotas o procariotas, preferentemente eucariotas, e incluyen anfitriones bacterianos tales como las cepas de E. coli CAG6, JM3, N48, X1776, X2282, HB1, y MRC1, y cepas de Pseudomonas, Bacillus subtilis, y otros bacilos, levaduras y otros hongos, anfitriones animales y vegetales tales como células animales o vegetales en cultivo, células de insecto, y otros anfitriones. Los anfitriones preferidos de acuerdo con la invención son células de levadura, células de mamífero en cultivo, preferentemente células de mono y células de ovario de hámster chino (CHO). Preferentemente, las células de mono pertenecen a la línea celular COS7; preferentemente, las células CHO pertenecen a la línea celular CHO-(dxb11). Naturalmente, puede ocurrir que no todos los anfitriones sean igualmente eficaces. Considerando debidamente los principios expuestos en la presente memoria, los especialistas en la técnica pueden realizar la selección de la combinación particular de anfitrión y vehículo de clonación, sin salir del alcance de esta invención. Además, dentro de cada vector específico se pueden seleccionar diversos lugares para la inserción del ADN de doble cadena aislado. Estos sitios son denominados usualmente de acuerdo con la enzima de restricción o endonucleasa que los escinde. Por ejemplo, en pbr322 el sitio PstI está situado en el gen de la penicilinasa, entre los tripletes de nucleótido que codifican los aminoácidos 181 y 182 de la proteína de la penicilinasa. 14
15 1 El sitio particular elegido para insertar en el vehículo de clonación el fragmento de ADN seleccionado, a fin de formar una molécula de ADN recombinante, viene determinado por diversos factores. Estos factores incluyen el tamaño y la estructura de la proteína o polipéptido que deben ser expresados, la susceptibilidad de dicha proteína o polipéptido deseados frente a la degradación endoenzimática debida a componentes de la célula anfitrión y frente a la contaminación por sus proteínas, las características de expresión tales como la localización de los codones de inicio y de parada, y otros factores que serán reconocidos por los especialistas en la técnica. Ninguno de estos factores controla en absoluto por sí solo la elección del sitio de inserción para una proteína o polipéptido particular, sino que el sitio elegido representa un compromiso entre estos factores, y no todos los sitios pueden ser igualmente eficaces para una proteína dada. Naturalmente, debe entenderse que la secuencia nucleotídica o fragmento de gen insertado en el sitio de restricción seleccionado dentro del vehículo de clonación puede incluir nucleótidos que no formen parte del gen estructural real para la proteína deseada, o bien pueden incluir sólo un fragmento de este gen estructural. Sólo se requiere que, cualquiera que sea la secuencia de ADN insertada, el anfitrión transformado produzca una proteína o polipéptido que manifieste epítopes de gp7. La molécula de ADN recombinante que contiene el gen híbrido puede ser empleada para transformar un anfitrión de manera tal que permita que este anfitrión (transformante) exprese el gene estructural o un fragmento del mismo, y produzca la proteína o polipéptido codificados por el ADN híbrido. También se puede emplear la molécula de ADN recombinante para transformar un anfitrión de manera tal que permita que este anfitrión, al replicarse, produzca moléculas de ADN recombinante adicionales, como una fuente de ADN de gp7 y de fragmentos del mismo. La elección de un anfitriónapropiado para cualquiera de estos usos viene controlada por diversos factores ya reconocidos en la técnica. Estos factores incluyen, por ejemplo, la compatibilidad con el vector elegido, la toxicidad de los co-productos, la facilidad de recuperación de la proteína o polipéptido deseados, las características de expresión, la seguridad biológica, y el coste. No se puede llevar a cabo en absoluto la elección de anfitrión para una molécula de ADN, proteína o polipéptido particulares, tomando en cuanta sólo uno cualquiera de estos factores. En lugar de ello, se debe lograr un equilibrio entre estos factores, teniendo en cuenta que puede ocurrir que no todos los factores sean igualmente eficaces a la hora de expresar una molécula de ADN recombinante particular. Expresión de proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 En los casos en donde la célula anfitrión es una procariota tal como E. coli, las células competentes capaces de acoger el ADN son preparadas a partir de células cosechadas tras la fase de crecimiento exponencial y son tratadas posteriormente por el método del cloruro cálcico (CaCl 2 ), mediante procedimientos bien conocidos. La transformación puede ser llevada a cabo también después de formar un protoplasto de la célula anfitrión. Cuando el anfitrión empleado es una eucariota, pueden emplearse el método de transfección de ADN en forma de precipitado con fosfato cálcico, procedimientos mecánicos convencionales tales como la microinyección, la inserción de un plásmido encapsulado en eritrocitos anfitriones o en liposomas, el tratamiento de células con agentes tales como lisofosfatidil-colina, o el empleo de vectores víricos. El nivel de producción de una proteína o polipéptido está gobernado por dos factores principales: el número de copias de su gen, o de la secuencia de ADN que lo codifica, que existen dentro de la célula, y la eficacia con la cual estas copias del gen o de la secuencia son transcritas y traducidas. Las eficacias de transcripción y de traducción (que en su conjunto constituyen la expresión) dependen a su vez de las secuencias nucleotídicas situadas normalmente al principio de la secuencia codificadora deseada. Estas secuencias nucleotídicas, o secuencias de control de la expresión definen, entre otras cosas, el lugar en el cual la ARN-polimerasa interacciona para iniciar la transcripción (la secuencia de promotor) y en la cual se fijan los ribosomas e interaccionan con el marn (el producto de la transcripción) para iniciar la traducción. No todas estas secuencias de control de la expresión funcionan con igual eficacia. Por tanto, resulta ventajoso separar las secuencias codificadoras específicas para la proteína deseada, de las secuencias nucleotídicas adyacentes a las mismas, y fusionarlas en lugar de ello a secuencias de control de la expresión conocidas, con el fin de favorecer niveles más altos de expresión. Una vez que se ha conseguido esto, el nuevo fragmento de ADN obtenido mediante ingeniería genética puede ser insertado en un plásmido multicopia o en un derivado de bacteriófago con el fin de incrementar el número de copias presentes dentro de la célula, y mejorar así el rendimiento de la proteína expresada. 1
16 1 Pueden emplearse diversas secuencias de control de la expresión. Estas secuencias incluyen las secuencias de operador, de promotor, y de fijación e interacción con el ribosoma (que incluyen secuencias tales como las secuencias Shine-Dalgarno) del operón de lactosa de E. coli ( el sistema lac ), las secuencias correspondientes del sistema de triptófano-sintetasa de E. coli ( el sistema trp ), una fusión de los promotores trp y lac ( el sistema tac ), las regiones principales de operador y de promotor del fago 1 (O L P L yo R P R ), y la región de control de la proteína de cubierta del fago λ. Los fragmentos de ADN que contienen estas secuencias son escindidos por medio de enzimas de restricción, separándolos del ADN aislado a partir de fagos transductores que son portadores de los operones lac o trp, o bien a partir del ADN de los fagos λ ó fd. A continuación se manipulan estos fragmentos con el fin de obtener una población limitada de moléculas, de manera tal que las secuencias controladoras esenciales puedan ser enlazadas muy próximas al codón de iniciación de la secuencia codificadora, o yuxtapuestas al mismo. Después se inserta el producto de fusión en un vehículo de clonación a fin de transformar los anfitriones apropiados, y se mide el nivel de producción de antígeno. Así se pueden seleccionar células que proporcionen la expresión más eficaz. De manera alternativa se pueden emplear vehículos de clonación portadores del sistema de control lac, trp o λ P L unido a un codón de iniciación, y pueden ser fusionados a un fragmento que contiene una secuencia que codifica una proteína gp7 o un polipéptido que manifiesta epítopes de gp7, de manera tal que el gen o secuencia son traducidos correctamente desde el codón de iniciación del vehículo de clonación. Producción sintética y biológica de proteína gp7 y de porciones polipeptídicas de la misma que manifiestan epítopes de gp7 Las proteínas gp7 y los polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, de esta invención, pueden ser preparados no sólo por medios recombinantes sino también por medios sintéticos y por otros medios biológicos. Constituye un ejemplo de dichos otros medios biológicos para preparar el polipéptido o proteína deseados, el someter a proteólisis selectiva una proteína gp7 o un polipéptido de gp7 de mayor tamaño que contenga la secuencia de aminoácidos deseada. Por ejemplo, el polipéptido o proteína de mayor tamaño puede ser escindido con reactivos químicos o bien con enzimas. La formación sintética del polipéptido o proteína requiere sintetizar químicamente la cadena de aminoácidos deseada, por métodos bien conocidos en la técnica. La porción de un polipéptido o proteína de mayor tamaño que contiene la secuencia de aminoácidos deseada puede ser escindida por cualquiera de los siguientes procedimientos: (a) Digestión de la proteína o polipéptido de mayor tamaño mediante enzimas proteolíticas, en especial aquellas enzimas cuyo sustrato da específicamente como resultado la escisión de la proteína o polipéptido en lugares inmediatamente adyacentes a la secuencia de aminoácidos deseada. (b) Escisión de la proteína o polipéptido por medios químicos. Los enlaces particulares entre aminoácidos pueden ser escindidos por reacción con reactivos específicos. Los ejemplos incluyen: los enlaces en los que interviene metionina son escindidos por medio de bromuro de cianógeno; los enlaces de asparaginil-glicina son escindidos por medio de hidroxilamina; los enlaces disulfuro entre dos residuos de cisteína son escindidos por reducción, por ejemplo con ditiotreitol. (c) una combinación de cambios proteolíticos y químicos. Evidentemente, y tal como se ha indicado más arriba, debe ser posible también clonar una pequeña porción del ADN que codifica el péptido sintético, dando como resultado la producción del péptido por parte del anfitrión unicelular. Una vez obtenidos, las proteínas y polipéptidos producidos biológica o sintéticamente pueden ser purificados mediante filtración en gel, intercambio iónico, o mediante cromatografía de líquidos a alta presión. La síntesis química de polipéptidos está descrita en las siguientes publicaciones: Merrifield y otros, J. Am. Chem. Soc. 8: (1963); Kent yotros, Synthetic Peptides in Biology and Medicine, páginas 29 y siguientes, compilado por Alitalo y otros (Elsevier Science Publishers 198); Haug, ABL -47 (enero/febrero 1987); Andrews, Nature 319:429-4 ( de enero de 1986); Kent, Biomedical Polymers , compilado por Goldberg y otros (Academic Press 1980); Mitchell yotros, J. Org. Chem. 43: (1987); Tam yotros,tet. Letters (1979); Mojsov yotros,j. Org. Chem. :- (1980); Tam yotros,tet. Letters (1981); y Kent yotros,proceedings of the IV International Symposium on Methods of Protein Sequence Analysis (Brookhaven Press 1981). El procedimiento en fase sólida de Merrifield, tal como se describe en las publicaciones antes mencionadas, puede ser empleado para construir la secuencia apropiada de L-aminoácidos desde el aminoácido 16
17 1 del extremo carboxilo hacia el aminoácido del extremo amino. Comenzando con el aminoácido del extremo carboxilo apropiado, unido a una resina apropiada por medio de un enlace químico a un grupo clorometilo, grupo benzohidrilamina, u otro grupo reactivo de la resina, se añaden uno a uno los aminoácidos empleando para cada uno el siguiente procedimiento: (a) se lava con cloruro de metileno la peptidil-resina; (b) se neutraliza la resina mezclándola durante minutos a temperatura ambiente con diisopropiletilamina (u otra base impedida) al % (v/v) en cloruro de metileno; (c) se lava con cloruro de metileno la resina; (d) se activa una cantidad de aminoácido igual a seis veces la cantidad molar de la cadena peptídica en construcción, combinándolos con un número de moles mitad de una carbodiimida, por ejemplo diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida, durante minutos a 0 C, para formar el anhídrido simétrico del aminoácido. El aminoácido empleado debería ser suministrado originalmente como su derivado con N-α-butiloxicarbonilo, con cadenas laterales protegidas con ésteres bencílicos (ácidos aspártico y glutámico), éter bencílicos (serina, treonina, cisteína, tirosina), grupos benciloxicarbonilo (lisina) u otros grupos protectores empleados habitualmente en la síntesis de péptidos; (e) se hace reaccionar con la peptidil-resina el aminoácido activado, durante 2 horas y a temperatura ambiente, lo cual da como resultado la adición del nuevo aminoácido al extremo de la cadena peptídica en construcción; (f) se lava con cloruro de metileno la resina; (g) se elimina el grupo N-α-(butiloxicarbonilo) del amino-ácido más recientemente añadido, haciéndolo reaccionar con ácido trifluoroacético al % (v/v) en cloruro de metileno durante minutos a temperatura ambiente; (h) se lava la resina con cloruro de metileno; (i) se repiten los pasos (a) a (h) hasta que se termina de construir la secuencia peptídica requerida. A continuación se separa el péptido de la resina y simultáneamente se eliminan los grupos protectores de cadena lateral, mediante reacción con ácido fluorhídrico anhidro que contiene % (v/v) de anisol. Posteriormente se puede purificar el péptido mediante filtración en gel, intercambio iónico, cromatografía de líquidos a alta presión, u otros medios adecuados. Se puede realizar la síntesis química sin resina en fase sólida, en cuyo caso las reacciones de síntesis son llevadas a cabo enteramente en solución. Por lo demás, las reacciones y el producto final son idénticos. Las técnicas de síntesis química de péptidos incluyen el empleo de sintetizadores automáticos de péptidos, que emplean aminoácidos protegidos comercialmente disponibles; estos sintetizadores incluyen, por ejemplo, los modelos 90 y 90 de Biosearch (San Rafael, CA, EE.UU.), el modelo 4 de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA, EE.UU), y el modelo 90 de MilliGen (una división de Millipore Corp.). Además, se pueden sintetizar manualmente hasta aproximadamente polipéptidos a la vez empleando el aparato Ramp (Rapid Automated Multiple Peptide Synthesis) de Dupont. Los polipéptidos sintéticos de acuerdo con esta invención comprenden uno o más epítopes de gp7. Es posible sintetizar estos polipéptidos uniendo la secuencia de aminoácidos que define un epítopo (que puede constar de aproximadamente tres a aproximadamente once aminoácidos, más usualmente de aproximadamente cinco a aproximadamente once aminoácidos) a un mínimo de tres aminoácidos que flanquean uno de los lados del mismo. Los tres aminoácidos de uno de los lados pueden ser los mismos aminoácidos que existen en la secuencia de la gp7 natural, o bien pueden ser otros aminoácidos. Anticuerpos contra gp7 Los anticuerpos contra las proteínas gp7 y contra los polipéptidos recombinantes, sintéticos o naturales, que manifiestan epítopes de gp7, de esta invención, tienen utilidad no sólo para pruebas diagnósticas, sino también para la purificación por afinidad de proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, y para el uso terapéutico. Tal como se ha indicado antes en el capítulo Antecedentes, se ha demostrado que los anticuerpos contra c-erbb-2 inhiben el crecimiento tumoral in vitro e in vivo [Drebin yotros,supra (198)]. 17
18 Vacunas 1 Se apreciará fácilmente que las proteínas gp7 y los polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, de esta invención, pueden ser incorporados en vacunas capaces de inducir inmunidad protectora contra enfermedades neoplásicas y un efecto amortiguador sobre la actividad tumorígena. Se pueden sintetizar los polipéptidos o bien se pueden preparar de manera recombinante o bien de otra manera biológica, para comprender una o más secuencias de aminoácidos que corresponden a uno o más epítopes de gp7, sea en forma monómera o en forma multímera. A continuación se pueden incorporar estos polipéptidos en vacunas capaces de inducir inmunidad protectora contra gp7. Las técnicas para potenciar la antigenicidad de tales polipéptidos incluyen la incorporación en una estructura multimérica, la fijación a un vehículo proteico sumamente inmunogénico, por ejemplo hemocianina de lapa de California (keyhole limpet hemocyanin, KLH), o toxoide de difteria, y la administración en combinación con coadyuvantes o cualesquiera otros potenciadores de la respuesta inmunitaria. Se apreciará igualmente que también son útiles como vacunas anticuerpos anti-idiotípicos contra anticuerpos contra proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, pudiendo ser formulados de manera similar. Se puede obtener una secuencia de aminoácidos que corresponda a un epítopo de gp7, bien sea en forma monómera o multímera, por medios de síntesis química o mediante purificación a partir de fuentes biológicas, que incluyen microorganismos genéticamente modificados o sus medios de cultivo [véase Lerner, Synthetic Vaccines, Sci. Am. 248(2):66-74 (1983)]. El polipéptido puede ser combinado en una secuencia de aminoácidos con otros polipéptidos, inclusive fragmentos de otras proteínas, como ocurre, por ejemplo, cuando es sintetizado como una proteína de fusión, o bien puede estar unido a otros polipéptidos antigénicos o no antigénicos, de origen sintético o biológico. La expresión correspondiente a un epítope de una gp7 debe ser entendida como inclusiva de la posibilidad práctica de que, en algunos casos, las variaciones de la secuencia de aminoácidos de proteínas y polipéptidos presentes en la naturaleza puedan ser antigénicos y conferir inmunidad protectora contra las enfermedades neoplásicas y/o presentar efectos anti-tumorígenos. Las variaciones posibles de la secuencia incluyen, sin limitación, sustituciones de amino-ácidos, extensiones, eliminaciones, truncamientos, interpolaciones, y combinaciones de las mismas. Estas variaciones se encuentran dentro del alcance que se contempla en la invención siempre que la proteína o polipéptido que las contenga sea inmunogénico, y losanticuerpos originados por esta proteína o polipéptido presenten reacción cruzada con proteínas gp7 y polipéptidos que manifiesten epítopes de gp7, presentes en la naturaleza, en un grado suficiente para proporcionar inmunidad protectora y/o actividad anti-tumorígena cuando sean administrados como vacuna. Tales composiciones de vacuna estarán combinadas con un medio fisiológicamente aceptable, que incluye diluyentes y vehículos inmunológicamente aceptables, así como coadyuvantes habitualmente empleados tales como coadyuvante completo de Freund, saponina y alumbre. La administración se llevará a cabo con cantidades inmunológicamente eficaces de las proteínas gp7 y/o de los polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, preferentemente en cantidades que proporcionan dosis unitarias de 0,01 a,0 microgramos de proteína gp7 y/o polipéptido que manifiesta epítopes de gp7, por kilogramo de peso corporal del sujeto receptor. Las dosis protectoras totales pueden abarcar de 0,1 a aproximadamente 0 microgramos de antígeno. Las vías de administración, la dosis de antígeno, y el número y frecuencia de las inyecciones, son aspectos de optimización que se encuentran dentro del ámbito de la pericia ordinaria en la técnica. Uso terapéutico de proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 Las proteínas gp7 y los polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, de esta invención, pueden ser utilizados además terapéuticamente en el tratamiento de enfermedades neoplásicas, bien sea solos o en combinación con fármacos quimioterapéuticos. El hecho de que el dominio externo de c-erbb-2 sea diseminado en los fluidos corporales como una molécula intacta conduce por sí mismo a los usos terapéuticos. Un exceso de gp7 que no esté fijadoalacélula puede competir e interferir con la fijación del ligando putativo para c-erbb-2 al receptor para el oncogén presente en la superficie de la célula, de una manera análoga a la del receptor de CD4 y la proteína de cubierta gp1 de HIV-1, tal como se ha bosquejado antes en el capítulo Antecedentes [Smith yotros,supra (1987)]. Pueden ser mecanismos alternativos para explicar los efectos terapéuticos de proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, el que eviten o interrumpan la interacción receptor/receptor entre células que expresan c-erbb-2, una interacción que facilita la tumorigenicidad. 18
19 1 Estos métodos terapéuticos comprenden la administración a pacientes de material del dominio externo de c-erbb-2, fragmentos del mismo, o péptidos derivados de parte de su secuencia. Se puede esperar que niveles circulatorios elevados de proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, reduzcan o supriman el crecimiento tumoral tal como se ha descrito más arriba. Las proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, pueden ser administradas en una cantidad terapéuticamente eficaz, dispersadas en un vehículo líquido no tóxico, fisiológicamente aceptable. Las vías de administración y las dosis pueden ser similares a las indicadas en el capítulo Vacunas anterior. Definiciones En la presente memoria, el término gp7 se define con el significado de una glicoproteína que tiene un peso molecular aproximado de 7 kilodalton (kd), y que constituye el dominio externo de la glicoproteína de aproximadamente 18 kd (gp18) que es c-erbb-2. El término gp7 está definido con exactitud por sus secuencias de nucleótidos y de aminoácidos que se muestran en la Figura 16; el dominio externo de gp7 comprende la región desde aproximadamente el aminoácido número 22(serina;ser-22) hasta aproximadamente el aminoácido número 63 (serina; ser-63) (estos aminoácidos están marcados con círculos negros por encima de los mismos en la Figura 16), y la secuencia nucleotídica correspondiente. La secuencia de aminoácidos representa la versión no glicosilada de gp7, de la cual se esperaría que tuviese un peso molecular aproximado de 69 kd (Coussens y otros, supra). Se incluyen dentro del alcance del término gp7 glicoproteínas producidas de manera recombinante por levaduras y eucariotas superiores que presentan diversos grados de glicosilación, lo cual afecta al peso molecular de la proteína producto; por ejemplo tal como se indica en el Ejemplo 1 a continuación, en células CHO establemente transformadas que expresaban gp7 se produjo una pequeña cantidad de gp90. En la presente memoria, la expresión gp7 intacta se define con el significado del dominio externo de gp7 expresado sobre la superficie de una célula. Por tanto, la gp7 intacta estará aún unida a la célula a través de la región transmembránica. Un polipéptido es una cadena de aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos, y en la presente memoria se considera que está compuesto por aminoácidos o menos. En la presente memoria se define una proteína como un polipéptido compuesto por más de aminoácidos. En la presente memoria, la expresión proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 se define con el significado de proteínas y polipéptidos que están codificados por la secuencia de ADN del dominio externo de gp7 tal como se muestra en la Figura 16 (nucleótidos que codifican desde aproximadamente ser-22 hasta aproximadamente ser-63) o por fragmentos de dicha secuencia de ADN de gp7. En la presente memoria, la expresión proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7 se interpreta en el sentido de incluir proteínas y polipéptidos que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos y sustancialmente la misma actividad biológica que las proteínas gp7 y polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7. Se entenderá que, a causa de la degeneración del código genético, esto es, que más de un codón codifica un aminoácido [por ejemplo, los codones TTA, TTG, CTT, CTC, CTA y CTG codifican todos ellos el aminoácido leucina (L)], variaciones en la secuencia nucleotídica de la Figura 16 en la cuales se reemplace un codón por otro podrían producir una proteína o polipéptido sustancialmente equivalente de acuerdo con esta invención. Todas estas variaciones en la secuencia nucleotídica de gp7 están incluidas dentro del alcance de esta invención. Se entenderá también que la secuencia de ADN de gp7 tal como se muestra en la Figura 16 representa sólo la estructura exacta de la secuencia nucleotídica presente en la naturaleza. Se espera que se puedan encontrar secuencias nucleotídicas ligeramente modificadas o bien que se pueda modificar mediante técnicas conocidas en la técnica para que codifique proteínas y polipéptidos inmunogénicos y/o antigénicos con actividad serológica similar, y estas secuencias nucleotídicas y proteínas/polipéptidos son considerados equivalentes para los fines de esta invención. Se considera que el ADN que posee codones equivalentes se encuentra dentro del alcance de la invención, al igual que secuencias de ADN sintéticas que codifican proteínas/polipéptidos homólogos o sustancialmente homólogos respecto de la secuencia de ADN de gp7, y al igual que secuencias de ADN que hibriden con las secuencias que codifican proteínas gp7/polipéptidos que manifiestan epítopes de gp7, y aquellas secuencias que, salvo por la degeneración del código genético, hibridarían con dichas secuencias de gp7. Se encuentran además dentro del alcance de la invención secuencias de ADN que son complementarias respecto a las secuencias de ADN a las que se hace referencia en la presente memoria. Se considera que estas modificaciones y variaciones de las 19
20 secuencias de ADN, tal como se indican en la presente memoria, dan como resultado secuencias que son sustancialmente iguales a la secuencia de gp7 o a porciones de la misma. 1 Típicamente, estas secuencias nucleotídicas relacionadas son sustancialmente iguales, lo cual cae dentro de la definición de sustancialmente homólogas. Además, se observará que la secuencia de aminoácidos de gp7 puede ser modificada mediante técnicas genéticas. Se pueden eliminar o sustituir uno o más aminoácidos. Puede ocurrir que estos cambios en los aminoácidos, especialmente si ocurren en una región que no se encuentre dentro de un epítopo del polipéptido, no produzcan ningún cambio apreciable en la actividad serológica, antigénica y/o inmunogénica de la proteína o polipéptido. La proteína o polipéptido resultante tendrá sustancialmente la misma secuencia de aminoácidosy sustancialmente la mismaactividad biológica, y se encontrará dentro del alcance de la invención. Preferentemente, cuando se administran las proteínas/polipéptidos de gp7 junto con agentes quimioterapéuticos, estos agentes son agentes alquilantes. Los fármacos quimioterapéuticos preferidos para el método son cisplatino, carboplatino y mefalán. Abreviaturas En esta solicitud se emplean las siguientes abreviaturas: ATCC - Colección americana de cultivos de tejidos BCA - ácido bicinconínico BSA - seroalbúmina bovina CHO - ovario de hámster chino DAB - tetrahidrocloruro de diaminobencidina DHFR - dihidrofolato-reductasa DMEM - medio de Eagle modificado por Dulbecco EDTA - ácido etilendiaminotetraacético EGF - factor de crecimiento epidérmico EGFr - receptor de factor de crecimiento epidérmico EGTA - ácido etilenglicol-bis(β-aminoetiléter)-n,n,n,n -tetraacético ELISA - ensayo con inmunosorbente marcado con enzima FACS - clasificación de células activada por fluorescencia FBS - suero fetal bovino FITC - isotiocianato de fluoresceína HAT - hipoxantina-aminopterina-timidina HBSS - solución salina equilibrada de Hank HEPES - ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanosulfónico HPLC - cromatografía de líquidos de alta presión HRP - peroxidasa de rábano picante IRMA - análisis radioinmunométrico MEM - medio esencial mínimo MTT - bromuro de 3-(4,-dimetiltiazolil-2-il)-2,-difeniltetrazolio MTX - metotrexato
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