GENÉTICA DEL CÁNCER ÍNDICE: Pedro C. Lara Jiménez (1), Domingo Navarro Bosch (2) y Marta Lloret Sáez Bravo (1)

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1 Biocáncer 1, 2004 GENÉTICA DEL CÁNCER Pedro C. Lara Jiménez (1), Domingo Navarro Bosch (2) y Marta Lloret áez Bravo (1) (1) ervcio de Oncología Radioterápica. Hospital General de Gran Canaria Dr. Negrín (2) Laboratorio de Fisiología Centro de Ciencias de la alud Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Instituto Canario de Investigación del Cáncer (ICIC) ÍNDICE: 1. REUMEN 2. ONCOGENE Proto-oncogenes y Oncogenes Mecanismos de activación oncogénica Tipos de oncogenes Niveles de actuación de los oncogenes 3. GENE UPREORE Gen del retinoblastoma Gen P53 Genes de susceptibilidad de desarrollar cáncer de mama y ovario Gen del tumor de Wilms Poliposis colónica adenomatosa Gen MCC Gen DCC Oncogenes asociados a neurofibromatosis 1. REUMEN A lo largo de la vida, las células pueden ir acumulando mutaciones como consecuencia de la exposición a agentes químicos, radiaciones, virus, etc. i bien la mayoría de esas alteraciones genéticas, no tienen repercusiones futuras, a veces estas mutaciones producen alteraciones en la maquinaria genética que conducen a la célula y a sus descendientes a una proliferación descontrolada. El cáncer es, por tanto, la consecuencia de una proliferación incontrolada de células con anomalías en su material genético. Las células aberrantes que escapan a los mecanismos que tiene el -1-

2 Pedro Carlos Lara Jiménez organismo para evitar la enfermedad, no son eliminadas por apoptosis y perpetúan las anomalías en su descendencia. La carcinogénesis es un proceso complejo en el que se piensa que están implicados numerosos genes. Existen determinados genes cuya expresión conduce en un momento dado, generalmente a través de la síntesis enzimática, a la supervivencia o muerte celular. Los genes cuya expresión promueven la supervivencia y la prolilferación celular se denominan oncogenes, y aquellos que la inhiben e inducen la apoptosis se les denomina genes supresores (figura 1). En la actualidad se conocen decenas de genes diferentes, que están asociados a tipos tumorales específicos. Aunque los oncogenes son fundamentales en este proceso, sólo se han detectado en un 15-30% de los tumores humanos. in embargo, las alteraciones en los genes supresores son muy frecuentes. De hecho el 50% de los tumores muestran alteraciones de p53. Como ya hemos visto en otro capítulo de esta obra, el ciclo celular está regulado por factores externos que se unen a receptores celulares específicos, dando lugar a la "transducción de la señal", mediante la cual se activan determinadas proteínas nucleares. Este proceso se lleva a cabo mediante proteínas tirosina quinasas y ras. Las mutaciones que modifiquen la expresión de una o más de estas proteínas, alterarán el ciclo celular favoreciendo la carcinogénesis. BAX DAÑO EN EL DNA BCL2 P53 WAF1/CIP1 MDM-2 Ciclina E CDK2 PCNA-DNA polimerasa δ G1 KI67 APOPTOI M G2 Figura 1. Relación de p53 con genes reguladores de apoptosis y proliferación celular. -2-

3 2. ONCOGENE 2.1 Proto-oncogenes y Oncogenes Los proto-oncogenes son genes incluidos en el genoma humano que regulan el crecimiento y la diferenciación celular. us proteínas se expresan en diferentes momentos del ciclo y son imprescindibles para su regulación. En principio, el término proto-oncogén puede ser confuso, ya que implica de forma errónea que estos genes existen con el único fín de expresar un fenotipo tumoral, cuando realmente su función es esencial para la regulación del ciclo celular. Determinados cambios estructurales y/o funcionales en los proto-oncogenes contribuyen a la malignización de la estirpe celular, convirtiéndolos en oncogenes. Estos oncogenes originarán proteínas con expresión/función alterada que favorecerán el crecimiento y/o la invasividad tumoral. La investigación de estos genes, ha ido asociada a los avances que se han realizado en biología molecular sobre los genes transformantes de los virus. De esta manera se descubrió la relación entre el virus del papiloma humano y cáncer de cérvix, VHB y cáncer hepático, o VEB y linfoma de Burkitt y el carcinoma nasofaríngeo, entre otros. Los oncogenes sólo precisan estar mutados en un alelo, para que se produzca la sobreexpresión de una proteína dada y esta ejerza su acción promotora. En cambio, en los genes supresores es necesario que estén mutados los dos alelos, de forma que el gen no se exprese de ninguna manera (si uno de los alelos permaneciera inalterado podría producir la proteína supresora normal). Este es el motivo por lo que a los primeros se les conoce como oncogenes dominantes y a los últimos oncogenes recesivos. 2.2 Mecanismos de activación oncogénica El paso/activación de protooncogén a oncogén se puede producir por diferentes mecanismos: Translocación: cuando una parte de un cromosoma se liga a otro. El resultado es un híbrido de cromosoma, detectable en el cariotipo. Esto da lugar a una alteración en la transcripción del DNA. Mutaciones puntuales: sustitución de un par de bases por otro par en una secuencia de DNA, por ejemplo G:C por A:T. Amplificación: las células eucariotas están formadas por un genoma diploide, es decir, tienen dos copias de cada gen. En determinadas cirucunstancias una de las copias puede multiplicarse miles de veces, aumentando su tasa de expresión, dando lugar a la amplificación del gen. Es uno de los mecanismos más habitualmente implicados en la carcinogénesis. -3-

4 Pedro Carlos Lara Jiménez Mutagénesis por inserción: producida por la inserción del ADN del virus en el genoma del huésped. 2.3 Tipos de oncogenes Retrovirales: En una infección retroviral, el virus se integra en el cromosoma de la célula infectada, previa conversión de su ARN en cadena doble de DNA en el citoplasma. e ha comprobado que la inserción del provirus, además, modifica la expresión de la región del cromosoma donde se inserta. i el locus es un proto-oncogén, la inserción puede condicionar cambios en la expresión del mismo, contribuyendo a la carcinogénesis. El virus del sarcoma de Rous es un ejemplo típico. Este virus posee cuatro genes: gag (codifica antígenos específicos del grupo viral), pol (codifica una polimerasa inversa), env (codifica glucoproteínas de la envuelta viral) y src (tirosín-kinasa). Este último es el causante de la transformación oncogénica y su mecanismo de acción es la activación de una proteínkinasa y la transmisión de señales en la célula. Entre los retrovirus que inducen cáncer en humanos están el HTLV-1 asociado al síndrome leucemia/linfoma de células T del adulto, y el HTLV-2 asociado a enfermedades proliferantes malignas de células T. Virus ADN: e integran en el genoma del huésped de forma permanente. Pueden expresar de esta manera genes como E1A y E1B que inactivan p53 y prb y también estimular la ciclina A y E. Algunos ejemplos son el Ag E1A de los adenovirus, el Ag T del V-40, y la proteína E6 en el HPV. e han constatado tres tipos de virus con importancia oncogénica clínica: los herpesvirus, como el virus de Ebstein-Barr en relación con linfoma Burkitt y el carcinoma nasofaríngeo, los hepadnavirus, como el virus de la hepatitis B en relación con el hepatocarcinoma -4-

5 Genética del Cáncer los papilomavirus (HPV) en relación con el carcinoma de cervix, anorrectales, esófago y piel. Oncogenes detectados por transferencia génica: Destaca en este grupo la familia de genes Ras: H-ras, K-ras, N-ras. Es el ejemplo típico de activación oncogénica por mutación puntual. Están implicados en la transducción de señales desde la membrana al núcleo. Relacionados con el cáncer de colon y pulmón. En este último el K-ras es predictor del pronóstico del tumor. Otros genes implicados son neu, met y trk que codifican receptores de factores de crecimiento, y también hst y ks3 que son factores de crecimiento fíbroblástico. Oncogenes detectados por anomalías cromosómicas: Pueden producirse por dos tipos de alteraciones en los cromosomas: Translocaciones: la primera en describirse fue la del cromosoma Philadelphia (9,22) (q34,q 11), que está presente en el 95% de los pacientes con leucemia mieloide crónica. El protooncogén c-abl se trasloca desde el cromosoma 9, banda q34, hasta el cromosoma 22, banda q11. En el 75% de los linfomas Burkitt se produce también una translocación que contiene el oncogén c-myc al locus de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas - t(8,14) (q24.13, q32.33). Otra posibilidad son las translocaciones de los genes de las cadenas ligeras lambda y kappa de los cromosomas 22 y 2, respectivamente, hacia el cromosoma 8. Como resultado, en todos los casos tenemos la disregulación de c-myc y el aumento de proliferación celular. Delecciones: la pérdida de parte del ADN se ha asociado a diferentes tumores. Es el caso de los retinoblastomas en los que se produce delección de la banda 14q del cromosoma 13, y del tumor de Wilms (banda 13p, cromosoma 11). -5-

6 Pedro Carlos Lara Jiménez Factores de crecimiento Existe evidencia del comportamiento de determinados factores de crecimiento y receptores celulares, en circunstancias apropiadas, como oncogenes. Entre ellos están: factor de crecimiento derivado de las plaquetas (FDGF) actúa como el oncogén v-sis. receptor de un factor de crecimiento epidérmico (EGFR) como v-erbb. receptor para M-CF y CF-1 como v-fms. receptores de crecimiento de la familia de las tirosinquinasas como los oncogenes Neu, met, trk. Al estimularse tanto los receptores como los factores de crecimiento, se incrementan las señales de replicación celular. 2.4 Niveles de actuación de los oncogenes Los oncogenes codifican proteínas que van a actuar siguiendo el esquema de funcionamiento de los genes normales de los que derivan, interviniendo en la regulación de las rutas de señalización de la proliferación celular. Esto es: Como factores de crecimiento: En condiciones normales éstos se unen a receptores en la membrana celular que a su vez interaccionan con quinasas citoplasmáticas que transmiten y amplifican un estímulo al interior de la célula. Un ejemplo es el protooncogén c-sis que codifica el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-b) que es un potente agente mitogénico del tejido conectivo. Cuando c-sis está mutado se convierte en el oncogén v-sis, induciendo una proliferación celular incontrolada. Como receptores de factores de crecimiento: on receptores de membrana. Los más estudiados son los receptores con actividad tirosina quinasa, entre ellos la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF). El gen que codifica el receptor del EGF es el -6-

7 Genética del Cáncer c-erb B2. El receptor normal es una proteína transmembrana con un dominio intracelular que es una tirosina quinasa, que se activa cuando se une el EGF a la porción exterior del receptor. Esta activación desencadena una serie de reacciones que culminan en la mitosis. El gen mutado, v-erb B2, produce un receptor que permanece activado sin que exista EGF, por lo que la célula es estimulada a crecer y dividirse constantemente de manera incontrolada. Como transductores citoplasmáticos de señales: La transmisión de la señal en el interior de la célula hasta el núcleo, se realiza mediante una serie de reacciones en cascada en las que interaccionan proteínas, dando lugar a numerosas fosforilaciones (mediadas por quinasas), defosforilaciones e hidrólisis de GTP. En esta cascada de reacciones van a intervenir, por tanto, distintas quinasas así como enzimas que generarán segundos mensajeros (camp, cgmp, inositoles fosfatos...). Las quinasas dependientes de ciclinas o CDKs son proteínas capaces de fosforilar otras proteínas gracias a su actividad quinasa, favoreciendo la transmisión de la señal al núcleo. Numerosas ciclinas (D, E, B, A) se encuentran elevadas en distintas fases del ciclo y promueven también la progresión del ciclo celular. Niveles elevados de ciclinas y/o sobreexpresión de CDKs se han podido demostrar en numerosos tumores humanos. Diversas proteínas como las derivadas de protooncogenes de la familia ras (K-ras, H-ras, N-ras) actúan como GTPasas bloqueando el paso de GTP a GDP. Cuando aparecen mutadas estas proteínas (v-k-ras por ejemplo) se favorece el crecimiento celular de forma incontrolada al permitirse la hidrólisis de GTP. Numerosos tipos tumorales humanos presentan el gen ras alterado. Otras proteínas que amplifican la señal hacia el núcleo son src y abl, cuyo oncogén activado estimula la proliferación celular incontrolada. Como factores de transcripción: Estos actúan sobre un segundo grupo de genes involucrados en la proliferación celular, entre los que se encuentran los oncogenes nucleares c-myc, c-fos y c-jun. Algunos factores de transcripción son RF, I y NF-kB, que están inactivos en las células quiescentes y tras la activación mitógena se activan uniéndose a c-fos, c-jun y c-myc. La proteína c-myc funciona como un factor de transcripción que cuando está mutada (v-myc) se expresa sin control induciendo una proliferación persistente. -7-

8 Pedro Carlos Lara Jiménez 3. GENE UPREORE Ya hemos comentado que en la regulación de la proliferación celular intervienen genes que estimulan el proceso, denominados protooncogenes, y genes que controlan el ciclo celular evitando el crecimiento excesivo, a los que denominamos genes supresores. Los genes supresores inhiben el crecimiento celular en condiciones normales. Cuando se produce una mutación en estos genes, sus proteínas no se expresan o dan lugar a proteínas no funcionantes, favoreceriendo la aparición del proceso de carcinogénesis, al no existir un control de la proliferación celular. Para que estos genes supresores adquieran su capacidad oncogénica, necesitan sufrir mutaciones independientes en ambos alelos, de manera que pierdan completamente su capacidad funcional. Como consecuencia, el crecimiento celular queda sin regulación, produciéndose una proliferación descontrolada que puede conducir a la formación de tumores. Es decir, la alteración se manifiesta con carácter recesivo. También puede ser heredada esta alteración en la línea germinal, lo que explicaría el carácter hereditario de determinados tumores, cuya frecuencia es elevada en una misma familia. En este caso, uno de los alelos ya se hereda alterado, por lo que sólo se necesita una mutación en el otro alelo, para que se manifieste la enfermedad. Los mecanismos por los cuales se puede alterar la expresión de los genes supresores son similares a los descritos para los oncogenes. on numerosos los genes oncosupresores estudiados, entre los más conocidos tenemos p53, retinoblastoma (RB), DCC, MCC, APC, NF1, NF2 y WT Gen del retinoblastoma Fue el primer gen en el que se descubrió su relación con el cáncer. Este gen se encuentra en el cromosoma 13 banda q14. Codifica una proteína nuclear, prb, cuya función es la de bloquear el ciclo celular ante una lesión del DNA. prb se une al factor de transcripción E2F, impidiendo la progresión del ciclo celular. La actividad de prb es dependiente de fosforilación/defosforilación, de manera que quinasas y ciclinas que activen su fosforilación van a inhibir su función, mientras que los que inducen su defosforilación van a favorecer su acción de bloqueo del ciclo celular. Entre los activadores de la fosforilación de prb están los complejos ciclina D-CDK4/6 y ciclina E-CDK2. i se produce una mutación en el gen RB (por mutación puntual, por delección, por sustitución) se favorecerá la proliferación incontrolada de la célula. No sólo la mutación provoca este efecto, sino que en presencia de infección viral por HPV, éste produce una proteína, E7, que se une a la proteína del gen RB bloqueando su unión a E2F, impidiendo también la detención del ciclo celular en casos de alteración del DNA. De esta manera, la célula continuará proliferando de manera incontrolada con un DNA alterado (figura 2). -8-

9 Genética del Cáncer Lesión del DNA Lesión del DNA +HPV + + E7 E6 prb E2F p53 E7 prb E2F E6 p53 Inhibición crecimiento celular Progresión de crecimiento celular anómalo Figura 2. Alteración en el funcionamiento de p53 y prb mediado por las proteínas E6 y E7 del HPV La alteración de la función de prb la podemos encontrar en pacientes con retinoblastoma, osteosarcoma, tumores de vejiga, próstata, mama, microcítico de pulmón, cérvix y algunas leucemias. El porcentaje es diferente según la localización tumoral, lo que nos indica que en algunos tumores en los que está presente casi en el 100% de los casos (retinoblastomas y microcíticos) su papel es primordial, mientras que en otros en los que sólo aparece en un 30% (mama, vejiga) la alteración de la función de prb es sólo parte del complejo proceso de carcinogénesis. 3.2 Gen P53 e trata de un gen supresor que se encuentra en el brazo corto del cromosoma 17 banda 13, y codifica una proteína nuclear de 53 Kd. La función del P53 en estado normal es la de regulación del ciclo celular ante un daño del DNA, por lo que se le ha denominado "guardián del genoma". Cuando el DNA se daña, el P53 se acumula en el núcleo, y es capaz de detener el ciclo celular en G1 (check point) antes que se duplique el DNA e iniciar su reparación. P53 va a inducir la síntesis de proteínas inhibidoras de los complejos ciclina-cdks, bloqueando el ciclo celular. i se repara la lesión el ciclo continúa, pero si no se repara se induce la apoptosis de la célula mediante la expresión de genes como bax. La alteración de la proteína P53 produce inestabilidad genómica, siendo las células incapaces de evitar la proliferación o activar la apoptosis, cuando está comprometida la integridad del ADN, de manera -9-

10 Pedro Carlos Lara Jiménez que son capaces de acumular las mutaciones para completar la carcinogénesis (figura 3). Las mutaciones del P53 se encuentran en aproximadamente la mitad de los tumores humanos malignos. on fundamentalmente mutaciones por sustitución, en las que se cambia un aminoácido. El P53 aparece mutado en el 70% de los carcinomas colorrectales, el 50% de los carcinomas de pulmón y el 40% de los carcinomas de mama. Es signo de mal pronóstico y se suele relacionar con diseminación y metástasis. RADIACION IONIZANTE DAÑO EN EL DNA P53 GADD45 WAF1/CIP1 P21 P21 Ciclina E CDK2 PCNA-DNA polimerasa δ G1 KI67 M G2 Figura 3 La pérdida de función de P53 también puede ser por delecciones como en los sarcomas, o por inactivación de la proteína como en el carcinoma de cervix. En este último, los virus HPV 16 y 18 producen la proteína E6, que promueve la proteolisis de la proteína P53 con pérdida de la función de la misma. Mutaciones de la línea germinal en P53 pueden dar lugar a consecuencias espectaculares como el síndrome de Li-Fraumeni, en el que los individuos de una familia pueden padecer diversos sarcomas, tumores cerebrales, leucemias y carcinomas suprarrenocorticales, entre otros tumores. Tiene una herencia autosómica dominante. En este síndrome un alelo está inactivado en la línea germinal, por lo que sólo requiere una mutación somática en el alelo restante para que aparezca un tumor. i existe un gen susceptible en el futuro de ser tratado con terapia génica, ése es el P53. Al no encontrarse el gen o estar mutado simplemente se tendría que introducir ese fragmento en las células -10-

11 Genética del Cáncer del organismo, para que pueda realizar su función como regulador negativo de la proliferación. Además sirve como "dosímetro molecular" al observarse su mutación tras la actuación persistente de carcinógenos. 3.3 Genes de susceptibilidad de desarrollar cáncer de mama y ovario Entre un 5-10% de estos tumores se originan por mutaciones hereditarias en dos genes: BRCA-1: se localiza en el cromosoma 17q. e conocen hasta 63 mutaciones germinales que conllevan un riesgo elevado de padecer cáncer de mama y también de ovario, sobre todo en relación con edad precoz (45%) y con historia familiar (90% de los casos). No se detectan en cánceres de mama esporádicos. En los varones aumenta ligeramente la incidencia de cáncer de próstata. BRCA-2: localizado en el cromosoma 13q. Presenta mutaciones en el 40% de los cánceres de mama de aparición precoz. u presencia, por tanto, confiere un riesgo elevado de padecer cáncer de mama, aunque tiene menos relación con el cáncer de ovario que la alteración de BRCA-1. La inhibición de la expresión de dichos genes en líneas celulares sugiere su papel como genes supresores de tumores. 3.4 Gen del tumor de Wilms Este tumor pediátrico afecta a 1/ niños. Existen dos tipos: WT-1: se asocia a aniridia, retraso mental y anomalías genitourinarias. El gen responsable se encuentra en el cromosoma 11p13 y presenta mutaciones en sus dos alelos. WT-2: presenta anomalías en el cromosoma 11p15 y da lugar al llamado síndrome de Becwith-Weidemann, que no tienen ninguno de los síntomas previos. Ambos genes se lesionan por delecciones. -11-

12 Pedro Carlos Lara Jiménez 3.5 Poliposis Colónica Adenomatosa Es una enfermedad que ocurre en 1/ personas. El gen responsable es el APC, que se encuentra situado en el cromosoma 5q21. Presenta mutaciones, como delecciones, sustituciones de aminoácidos y pérdidas de heterozigotidad (LOH). Este gen se expresa en distintos tejidos, pero sólo produce tumores de colon. e utiliza como marcador de riesgo para cáncer de colon familiar. 3.6 Gen MCC (Mutated in Colon Cancer) Es un gen que se encuentra también en el cromosoma 5q21. e han observado mutaciones en este gen en el cáncer de colon esporádico. 3.7 Gen DCC (Deleted in Colon Cancer) Este gen se encuentra en la banda 18q21. La proteína que codifica el DCC tiene propiedades de adhesión celular, por lo que al estar alterado se aumenta su capacidad de adhesión y/o invasión. En un 70% de los carcinomas colorrectales aparecen pérdidas alélicas en la banda 18q21, asociándose en estos casos a una mayor tasa de metástasis y menor esperanza de vida. En estos casos se emplea una quimioterapia más agresiva. Al tratarse de una delección del gen estos pacientes serían candidatos a terapia génica incorporando la región de DNA que falta. 3.8 Oncogenes asociados a neurofibromatosis En algunos casos el descubrimiento de genes relacionados con algún cáncer ha servido para conocer el control normal del crecimiento celular. Un buen ejemplo es la neurofibromatosis tipo 1 o Enfermedad de Von Recklinghausen. e pudo descubrir así un gen en el cromosoma 17 q, que cuando mutaba producía un fenotipo clínico de manchas café con leche, neurofibromas, nódulos de Lisch en el iris (hamartomas) y predisposición para los neurofibrosarcomas, feocromocitoma y gliomas. La transmisión es autosómica dominante. El gen responsable se denominó NF-1 y su proteína, la neurofibromina, es un regulador negativo del proto-oncogén ras. La neurofibromina es una proteína activadora de la GTPasa que normalmente actúa convirtiendo ras desde su forma activa (unida a GTP) a su forma inactiva (unida a GDP). Cuando está alterada su función, se produce un crecimiento celular descontrolado, ya que ras queda en posición de encendido (activa). La mutación que se ha observado en NF1, es una mutación dominante acompañada de la pérdida del alelo que queda, similar a la observada en RB y algunos casos de P53. i se produce la mutación en ambos alelos del gen la célula comienza su crecimiento descontrolado. En la neurofibromatosis tipo 2 o bilateral del acústico, el gen responsable es el NF-2. Este gen se localiza en el cromosoma 22, y parece estar relacionado con la unión de proteínas de membrana, -12-

13 Genética del Cáncer siendo su función oncosupresora. En el 50% de los casos su alteración se produce debido a la aparición de nuevas mutaciones. Esta enfermedad tiene una transmisión autosómica dominante, con un 95% de probabilidad de desarrollar schwannomas bilaterales acústicos. 4. BIBLIOGRAFÍA: 1. Gómez Gómez L, González Barón M. Genes supresores de tumores, capítulo 6, pp En Oncología Clínica, fundamentos y patología general. Editado por González Barón M, Ordoñez A, Feliu J, Zamora P, Espinosa E y De Castro J. 2ª edición. McGraw-Hill Interamericana de España áez de Castresana, González Barón M. Oncogenes, capítulo 5, pp En Oncología Clínica, fundamentos y patología general. Editado por González Barón M, Ordoñez A, Feliu J, Zamora P, Espinosa E y De Castro J. 2ª edición. McGraw-Hill Interamericana de España tratton M. Mechanisms of activation and inactivation of dominant oncogenes and tumour suppressor genes, capítulo 2, pp En Molecular Biology for Oncologists. 2ª edición. Editado por Yarnold JR, tratton M y McMillan TJ. Publicado por Chapman y Hall, Trent R. Genetic Changes in Cancer, capítulo 4, pp En Cancer Facts, editado por Bishop J. Harwood Academic Publishers. The Neetherlands, Lacal JC. Estrategias para el diseño de nuevos antitumorales específicos contra células malignas alteradas por oncogenes. Revista Venezolana de Oncología, suplemento 1998 (1). 6. Lacal JC, Carnero A. Regulation of Ras proteins and their involvement in signal transduction pathways (Review). Oncology Reports, 1994, 1: pp