IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE CANNABINOIDES EN MARIHUANA POR HPTLC Y CONFIRMACIÓN GC/MS

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1 IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE CANNABINOIDES EN MARIHUANA POR HPTLC Y CONFIRMACIÓN GC/MS Katherinne Alcamán Pantoja Perito Químico Sección Análisis de Ilícitos Santiago, 19 de Mayo de 2015.

2 Droga Chile. ilícita de mayor consumo en Marihuana: Sumidad florida desprovista de semillas y tallo de la cual no se ha extraído la resina. Aumento del consumo en 11 puntos porcentuales (Decimo estudio nacional de consumo de drogas en población escolar, SENDA 2013) Marco ley que sanciona el tráfico de estupefacientes y psicotrópicos. Esquema de planta Cannabis sativa L. Fuente:

3 Toxicodinamia: Receptores: CB1 (SNC) y CB2 (Periféricos). Principales cannabinoides: Delta-9-tetrahidrocannabinol (Δ-9-THC), cannabidiol (CBD) y cannabinol (CBN). Estructuras químicas de delta-9-tetrahidrocannabinol, cannabinol y cannabidiol. Fuente: Manual para el análisis de productos de cannabis, ONU 2009.

4 Efectos y Riesgos asociados a su consumo: - Alteraciones al SNC - Sistema Respiratorio Percepción de la realidad y tiempo Ansiedad, psicosis - Sistema Cardiovascular - Sistema Reproductor Cuadro amotivacional Bloqueo impulsos nerviosos Neurodegeneración

5 Técnicas de Screening Prueba colorimétrica Fast Blue Análisis Microscópico Pelos glandulares y cistólicos con cannabinoides Prueba Fast Blue positiva para cannabinoides Fuente: Gentileza Laboratorio Sección Análisis de Drogas, ISPCH. Análisis Cualitativo y Cuantitativo - Cromatografía (GC/FID; GC/MS; TLC; HPTLC) - Espectroscopía (UV; FT-IR) Esquema pelo cistolico de cannabis Fuente: Toxicología de la Drogadicción, Manuel Repetto, 1985.

6 Ventajas Análisis de varias muestras simultáneamente. Impurezas de la muestra quedan retenidas en la placa. Bajo costo. Desventajas Dependiente de los insumos. Esquema de un HPTLC marca Camag Fuente:

7 Parámetros: Selectividad Precisión Linealidad y rango Exactitud Limite de Detección (LOD) Robustez Limite de Cuantificación (LOQ) Incertidumbre

8 Manual de Métodos Recomendados para el Análisis de Cannabis en Laboratorios de Drogas, ONU Equipos: HPTLC: Aplicador de muestra automático, Cámara de Desarrollo Múltiple Automático (AMD), Revelador por inmersión y Espectrofotodensitómetro. Todos los equipos marca Camag. GC/MS: Cromatógrafo de Gas, con detector de espectrómetro de masas tipo cuadropolo y autosampler. Todos los equipos indicados de marca Agilent Material de referencia: Material de referencia de cannabinol y cannabidiol de pureza mayor al 98% marca Sigma Aldrich y delta-9-tetrahidrocannabinol en ampolla disuelto en etanol de pureza mayor al 98% marca Cerilliant.

9 Fase Estacionaria: Placa sílica gel F x10 cm Fase Móvil: n-hexano/éter dietílico (80:20) Longitud de onda de Detección: 206 nm Ancho de Banda: 6 mm 3 µl pool estándares Volumen de Inyección 5 µl spike Distancia recorrida: 6 cm 1 µl muestra real Activación de la placa: Sumergida en metanol y 30 minutos a 80 C

10 Placa Sílica Gel

11 Elección de la Matriz: Té Chino Adelgazante - Compuesto llamado RIMONABANT. - Antagonista de los receptores cannabinoides CB1, que actúa sobre el centro regulador del apetito. - Falso positivo para Fast Blue. - Pelos glandulares similares a cannabis. - No posee cannabinoides y tampoco genera absorbancia a la misma longitud de onda que los analitos en estudio.

12 Método de extracción Extracción sólido -líquido 100 mg de muestra Aforo a 10 ml con acetonitrilo Sonicar durante 30 minutos

13 Selectividad Densitograma de un blanco, utilizando como matriz té adelgazante. Densitograma muestra fortificada concentración 1,5% (p/v) y volumen de inyección 5 µl

14 Densitograma en 3 dimensiones, en color lila y verde la curva de calibración en duplicado y de color anaranjado las muestras fortificadas Espectros UV superpuestos para cada analito

15 Linealidad y rango - Curva de calibrado de 8 puntos. - Concentraciones: 0,5% p/v; 0,75% p/v; 1% p/v; 1,5% p/v; 3,5% p/v; 5,5% p/v; 7,5% p/v; y 9,5% p/v. -Análisis de varianza por regresión lineal. CBN THC CBD

16 Linealidad Superposición de Curvas de Calibrado Área Promedio CBD 1000 Área Promedio CBN Área Promedio THC Curvas de calibración de 8 puntos para THC, CBN y CBD

17 Robustez - Degradación de los analitos: Analizando la misma placa durante 3 días. -Uso de 3 placas diferentes: Merck GLP elaboración 2008 Merck fecha elaboración 2013 Distinto proveedor y tamaño Placas de silica gel marca MERCK Fuente:

18 Robustez -Uso de 3 placas diferentes: Conc. Prom. en % p/v CBN (%p/v) CBD (%p/v) 9-THC (%p/v) Merck 1 GLP 1,657 1,426 1,718 Merck 2 1,631 1,289 1,617 Otro proveedor - Fase móvil en distinta proporción: 0,080 0,045 0,048 n-hexano/ Éter dietílico 90:10 n-hexano/ Éter dietílico 80:20 n-hexano/ Éter dietílico 70:30

19 Parámetro LOD/LOQ THC 0,7 / 2,3 %p/v CBN 0,3 / 1,2 %p/v CBD 0,3 / 0,9 %p/v Repetibilidad C.V = 0,1% Reproducibilidad C.V = 3,8% Exactitud Recuperación de 99,5%

20 Totalidad de las muestras presenta cannabinoides. - Tiempo retención THC 5,4 min - Tiempo retención CBN 6,5 min Té adelgazante no presenta cannabinoides.

21 Se analizó un total de 15 muestras reales provenientes de decomisos de distintas lugares. Según Naciones Unidas el año 2009, la hierba de cannabis contaba con un porcentaje de THC entre el 0,5 y 5%. Un tercio de las muestras analizadas supera el porcentaje de THC estimado por la ONU. Promedio: 4,7 % THC

22 Código Muestra CBN (%p/v) CBD (%p/v) 9-THC (% p/v) M1-2 7,339 N/D 3, M1-1 3,124 N/D 0, M1-1 0,791 N/D 6, M1-1 N/D N/D 4, M1-1 0,529 N/D 5, M1-2 N/D N/D 1, M1-1 0,848 N/D 3, M3-3 N/D N/D 1, M2-3 0,984 N/D 3, M1-3 3,015 N/D 2, M1-1 3,178 N/D 3, M1-1 1,537 N/D 1, M1-1 5,098 N/D 10, M1-1 N/D N/D 9, M1-1 2,740 N/D 12,557 Muestra Control 3,5% p/v 3,482 3,399 3,301

23 Recuento 15 Promedio 4,66 Desviación Estándar 3,69 Coeficiente de Variación 79,25% Mínimo 0,82 Máximo 12,55

24 Se implementó una metodología analítica para la identificación y cuantificación de cannabinoides: THC, CBD y CBN mediante cromatografía en capa fina de alto rendimiento con posterior confirmación mediante cromatografía gaseosa con detector masas. Se determinó que la metodología analítica es precisa, exacta y robusta para los factores estudiados, además presenta límites de detección y cuantificación adecuados para los análisis requeridos. Se determinó un método de extracción óptimo para las muestras de marihuana obtenidas por decomisos, tratándose de un método sencillo y reproducible. Se estableció un método cromatográfico que permite la confirmación de los analitos estudiados en las muestras analizadas, obteniendo una corrida cromatográfica de 24 minutos que separa a los 3 compuestos de interés. Se estableció que en Chile es posible encontrar marihuana que supera las concentraciones de THC estimadas por la ONU el año 2009, encontrándose una incautación que supera el 12% de dicho cannabinoide. Herramienta esencial para el análisis de preparados de cannabis con potencial efecto terapéutico.

25 Gracias