XLIII Congreso Mexicano de Patología Clínica Mérida, 2013 Ventajas de la metodología HPLC en la determinación de HbA1c y su uso para el diagnóstico

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1 XLIII Congreso Mexicano de Patología Clínica Mérida, 2013 Ventajas de la metodología HPLC en la determinación de HbA1c y su uso para el diagnóstico Dra. Maria del Carmen Candia Plata

2 DIABETES MELLITUS 9.2% de la población adulta con diagnóseco previo de diabetes. ENSANUT, 2012 ( htp://www. innsz.mx) Al tener diabetes, la expectaeva de vida se reduce 7 años (Murea y col, 2013). Primera causa de muerte en adultos Sánchez- Barriga, 2010 Tasa 53.2/100,000 Villalpando y col, 2010

3 Control metabólico Revaloración periódica para el diagnóseco oportuno 20 años 10 años 0 10 años 20 Posible inicio del proceso Momento en que se establece el diagnóseco de diabetes. Complicaciones en el 30-50% de los pacientes.

4 La hiperglicemia es el principal factor de riesgo secundario HTAS Elevación de Tg s Hiper- betas HiperHcys Hiper- glicemia Hipo- alfas Abdo- obesidad Complicaciones Estrés oxidamvo Insulino- resistencia Glicemia mg/dl MarPn- Frías et al. An Pediatr (Barc). 2009;70(2):

5 La medición de marcadores indirectos estables, evita el sesgo asociado con las fluctuaciones de la glicemia Hemoglobina α 2 γ 2 (F=0.5%) α 2 β 2 (A=97%) α 2 δ 2 (A2=2.5%) HbA0 HbA1 (GHb) > 93% < 7% Glucosa Hb A1a1 y a2 (0.5%) HbA1b (0.5%) HbA1c (4-6%) Kilpatrick E.S. Glycated haemoglobin in the year J Clin Pathol. 2000;53:

6 Ø Diversos estudios clínicos revelaron una estrecha relación entre las complicaciones tardías de la diabetes y la concentración de HbA1 en sangre. q The Diabetes Control and ComplicaMons Trial Research Group. The effect of intensive treatment od diabetes on the development and progression of long- term complicamons in insulin- dependent diabetes mellitus. N Engl J Med 1993; q White NH, Sun W, Cleary PA, Danis RP, Davis MD, Hainsworth DP, et al. Prolonged effect of intensive therapy on the risk of remnopathy complicamons in paments with type 1 diabetes mellitus: 10 years aier The Diabetes Control and ComplicaMons Trial. Arch Ophthalmol 2008;126: q U.K. ProspecMve Diabetes Study (UKPDS) Group. Intensive blood- glucose control with sulphonylureas or insulin compared with convenmonal treatment and risk of complicamons in paments with type 2 diabetes (UKPDS 33). UK ProspecMve Diabetes Study (UKPDS) Group. Lancet 1998;352: q Stralon IM, Adler AI, Neil HA, et al. AssociaMon of glycaemia with macrovascular and microvascular complicamons of type 2 diabetes (UKPDS 35): prospecmve observamonal study. BMJ 2000; 321: q The ADVANCE CollaboraMve Group. Intensive blood glucose control and vascular outcomes in paments with type 2 diabetes. N Engl J Med 2008;358: q Ohkubo Y, Kishikawa H, Araki E, et al. Intensive insulin therapy prevents the progression of diabemc microvascular complicamons in Japanese paments with non- insulin- dependent diabetes mellitus: a randomized prospecmve 6- year study. Diabetes Res Clin Pract 1995; 28: q Ismail- Beigi F, Craven T, Banerji MA, et al, the ACCORD trial group. Effect of intensive treatment of hyperglycaemia on microvascular outcomes in type 2 diabetes: an analysis of the ACCORD randomised trial. Lancet 2010; 376:

7 A partir de entonces empezó a usarse la HbA1c para estimar el estatus metabólico y monitorear el efecto del tratamiento de los pacientes con diabetes. Ø Buen estimador de la glicemia crónica porque la glicación se produce a lo largo de la vida eritrocitaria. Ø Baja variabilidad biológica intraindividual (<2%). No se afecta significativamente su concentración en periodos de tiempo cortos Ø No se requieren muestras en ayuno ni cronometradas y tiene buena estabilidad preanalítica. Cowie et al, Diabetes Care. 2010;33: Littleet al, J Diabetes Sci Technol ;3(3):

8 La estandarización inició con programas nacionales en NaEonal Glycohemoglobin StardardizaEon Program (NGSP): Sistema HPLC Bio- Rex 70 como el método estándar de referencia y un calibrador hemolisado liofilizado preparado por el Laboratorio de Referencia Central Primario (St. Louis MO). El NGSP como responsable de la calibración y cereficación de métodos para HbA1c en EUA y muchas otras partes del mundo. 2. Mono S Ion Exchange Chromatography, como el método de referencia Sueco. 3. Producción de calibradores de uso común, con valores asignados por la Sociedad de Diabetes Japonesa (HPLC Yosoh; Kyoto Daiichi y luego con el KO500): Reducción del CV interlab. de 12 a 5%.

9 Aislamiento de HbA1c y HbA0 Material de referencia cermficado primario (mezcla de porciones bien definidas de HbA1c y HbA0) Calibración del Sistema de Medición de Referencia Primario (PRMS) Asignación de valores del PMRS a Materiales de Referencia Secundarios (SRMs; sangre total) Uso de los SRMs por los fabricantes, para calibrar sus instrumentos y métodos. Weykamp C, John WC, Mosca A, Hoshimo T, LiTle R, Jeppsson JO, et al. The IFCC reference measurement system for HbA1c: a 6- year progress report. Clin Chem. 2008;54:240-8

10 Método de Referencia IFCC (de orden superior) HbA0 y HbA1c Endoproteinasa Glu- C Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu Gluc-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu HPLC- MS o HPLC- EC Hp glicado Hp no glicado En % (unidad IFCC) Europa, Australia y Japón calibran sus sistemas analíecos de acuerdo con este procedimiento y reportan en mmol/mol. Los laboratorios de USA permanecieron con la calibración NGSP y expresan sus valores en %.

11 ü La comparación de los resultados de HbA1c generados por la red de laboratorios del IFCC, con los de cada una de las redes de EUA, Japón y Suecia, designadas como métodos de comparación (DCMs), mostró que la relación entre cada DCM y el método IFCC es linear. ü En el 2007, IFCC, IDF, ADA y EASD, recomendaron el uso de unidades del SI FCCC. Para su implementación progresiva recomendaron el uso de ecuaciones maestras que relacionan las unidades IFCC con las restantes. Hanas R, Garry J, on behalf of the InternaMonal HbA1c Consensus Commilee Consensus Statement on the Worldwide StandardizaEon of the Hemoglobin A1c Measurement: the American Diabetes AssociaMon, European AssociaMon for the Study of Diabetes, InternaMonal FederaMon of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, and the InternaMonal Diabetes FederaMon. Clin Chem Lab Med. 2010;48(6): Relación entre valores IFCC y NGSP: NGSP- HbA1c = (IFCC HbA1c) % Hoezel et al, Clin Chem. 2004;50:166-74

12 Relación entre valores IFCC y JDS/JSCC: JDS/JSCC HbA1c = (IFCC HbA1c) % Relación entre valores IFCC y Swedish HbA1c: Swedish HbA1c = (IFCC HbA1c) % Hoezel et al, Clin Chem. 2004;50: El valor analíeco del sistema de referencia IFCC, mejoró recientemente usando, como estándares internos, hexapépedos de mayor pureza y deuterados Así, hay tres valores blanco posibles: 1. Valor de concenso. 2. Valor de referencia IFCC. 3. Valor de referencia IFCC LC- ID- MS (el mayor grado de exacetud).

13 En el 2013, es posible elegir métodos cereficados por NGSP y trazables al sistema de referencia IFCC LC- ID- MS, para alcanzar tres objeevos: 1. Control Glicémico de los pacientes; Meta: HbA1c < 7 % < 7.5% en caso de comorbilidades o si el riesgo de hipoglicemia es grande, especialmente en adultos mayores; < 8.5% en niños con DM1 q American Diabetes AssociaMon. Standards of medical care in diabetes. Diabetes Care 2010; 33:S11- S61. q American Diabetes AssociaMon. Standards of medical care in diabetes. Diabetes Care 2013; 36:S11- S66. q Asociación LaMnoamericana de Diabetes. Guías ALAD de diagnósmco, control y tratamiento de la diabetes mellitus Mpo 2, hlp://www.alad- lamnoamerica.org/ (acceso en octubre, 2013). q InternaMonal Diabetes FederaMon, Clinica guidelines task force. Global guideline for type 2 diabetes. hlp://www.idf.org/sites/default/files/idf- Guideline- for- Type- 2- Diabetes.pdf )(accesed, october 2013).

14 Valores meta de HbA1c cuando la esemación se realiza con métodos trazables al sistema de referencia IFCC IFCC NGSP Intervalo de Ref (no diabéecos) mmol/mol 4-6% Meta general de control en diabetes <53 mmol/mol <7% Panteghini & John, Clin Chem Lab Med. 2007;45: Monitoreo y ajuste del tratamiento de los pacientes. Con valores puntuales de HbA1c o mediante la eag

15 Ø Con la HbA1c se puede calcular la glicemia promedio (resultados más comprensibles para el paciente) Cowie et al, Diabetes Care. 2010;33: Littleet al, J Diabetes Sci Technol ;3(3): Fue una aplicación que generó controversia hasta el 2008: Porque las mediciones de glucosa no se habían hecho tan frecuentemente como para obtener un verdadero promedio y muchos de los métodos con los que se habían realizado los estudios de correlación, no habían sido armonizados sobre métodos de referencia. The proposed terminology A1c- derived average glucose is inherently imprecise and should not be adopted. Diabetologia. 2008;51: Consensus statement on the worldwide standardisamon of the HbA1c measurement. Diabetologia. 2007; 50: ).

16 Expresión de la HbA1c como el promedio de la concentración de glucosa Glucosa plasmáeca promedio (mg/dl) A1C (%) ADA, 2011* ALAD, * en 507 adultos (83% Caucásicos). ADA, Asociación de Diabetes Americana ALAD, Asociación LaEnoamericana de Diabetes

17 Traducción de los valores de HbA1c a valores de glucosa plasmáeca promedio (eag) usando la ecuación eag (mg/dl) = (28.7 HbA1c) ; r 2 = 0.84 A1C (%) eag (mg/dl) eag (mmol/l) Diabetes Care 2008;31:1-6 hlp://www.ngsp.org

18 3. Uso de la HbA1c para el diagnóseco de la diabetes Aplicación restringida al caso en el que se use un método certificado. q Punto de corte para el diagnóseco de diabetes: HbA1c > 6.5 InternaMonal Expert Commilee. InternaMonal Expert Commilee report on the role of the A1C assay in the diagnosis of diabetes. Diabetes Care 2009; 32: American Diabetes AssociaMon. Standards of medical care in diabetes. Diabetes Care 2010; 33:S11- S61. InternaMonal Diabetes FederaMon, Clinica guidelines task force. Global guideline for type 2 diabetes. hlp://www.idf.org/sites/default/files/idf- Guideline- for- Type- 2- Diabetes.pdf (Accesed, October 2013): HbA1c < 6.0% es normal. q Medición de la glicemia y HbA1c en una sola muestra sanguínea (ambos deben mostrar valores diagnósecos) (Seino et al. J Diabetes Invest. 2010;1: ).

19 Para medir HbA1c, se usan diferentes métodos 1. Inmunoensayos. 2. Ensayos basados en los cambios de pi. 3. Ensayos basados en la afinidad de la hemoglobina glicada por boronato. 4. Ensayos enzimáecos. ObjeEvo: Elegir un método que permita comparar los resultados con los de otros métodos y otros laboratorios, en cualquier país.

20 Ø En México, muchos laboratorios todavía uelizan métodos no cereficados. En el 2007, la situación era similar a la de Estados Unidos antes de 1996: La imprecisión analítica CV = % (Rojano et al, Bioquimia. 2007; 32(3):91-99). Ø Esto ha impedido la definición de metas clínicas nacionales. Ø Desde el 2006, Qualitat ha trabajado en favor de la calidad analíeca de los procedimientos de laboratorio y actualmente colabora en la mejora conenua del trabajo de laboratorio clínico conforme a la Guía La6noamericana para la Mejoría de Calidad, Bioé6ca y Relevancia Médica.

21 Debe tenerse en mente que los programas certifican métodos, pero no evalúa los métodos por sus interferentes, por lo que debe estudiarse el efecto de las variantes de interés en el método que haya sido elegido. Ø Deben tenerse en mente todos los posibles interferentes, porque el cambio en la concentración de HbA1c en 1% refleja un cambio de 1.4 a 1.9 mmol/l en la concentración de glucosa sanguínea promedio. En consecuencia, un valor de HbA1c falsamente alto o bajo, causado por un interferente, puede cambiar el manejo del paciente. Nasir et al, Int J Diabet Dev C Tries. 2010;30(2): Ø Los métodos para estimar la Hba1c, que pueden detectar interferentes brindan certidumbre.

22 Sobrevida eritrocitaria anormal. Anemias hemolíticas disminuyen la HbA1c. Policitemia la aumenta. Las variantes de hemoglobinas interfieren con la determinación de HbA1c La prevalencia de hemoglobinopatías en México está virtualmente ausente en población nativa, pero es mayor en las costas Mexicanas (6% de HbS en condición heterocigota). Ruiz- Reyes G. Rev Inv Clin. 1998:50(2): El efecto sobre la determinación de HbA1c depende de la variante de Hb presente en la muestra y del método elegido. Little et al, Clin Chem. 2011;57(2):

23 Inmunoensayos AnEcuerpos específicos para el extremo amino terminal de la globina beta (10, 8, 6 ó 4 úlemos aminoácidos de la cadena), inmovilizados en un material inerte. Weikamp et al., J Diabetes Sci Technol. 2009;3(3): El entrecruzamiento produce cambios en la turbidez de la suspensión, que es proporcional a la canedad de anygeno en la muestra. Látex

24 Inmunoensayos Sitio elegido para la producción de anticuerpos. Si una Hb variante no cuenta con este segmento, se altera el reconocimiento

25 Inmunoensayos Variantes de hemoglobinas con N-ter afectado. HbS (β6 Val Glu). HbC (β6 Lys Glu). Hb Graz (β2 His Leu). HbF (Cadenas γ con Gli N-ter que se glican a una tasa menor). Hb Raleigh (Ala N-ter en cadena β, con tendencia a la acetilación y tasa de glicación reducida). Little et al, Clin Chem. 2011;57(2):

26 Inmunoensayos El diseño de estos ensayos es variable, desde la inmunoturbidimetría hasta la inmunoturbidimetria compeeeva incrementada por látex y detección enzimáeca. Hay gran variedad de ensayos aplicables a analizadores (98 cermficados por NGSP en el 2013). Pueden adaptarse fácilmente al laboratorio clínico, pero son altamente inestables y por lo tanto caros. La estabilidad limitada de los reacevos provoca variación de los resultados entre pruebas. Weikamp et al., J Diabetes Sci Technol. 2009;3(3):

27 Otras desventajas: Inmunoensayos Ø Curvas de calibración no lineares (se requiere calibración mulenivel: 4 a 6 calibradores a parer de 0.0%). Ø La Hb total se mide de forma independiente, por un principio analíeco disento que introduce inceredumbre adicional al resultado. Hb total HbA1c Cálculo de la Relación %HbA1c Ø El mayor reto es alcanzar la precisión del HPLC requerido (<<<2.0%) para el control ópemo de los pacientes. Weikamp et al., J Diabetes Sci Technol. 2009;3(3):

28 Inmunoensayos Imprecisión analíeca total Roche INTEGRA Roche INTEGRA Dade DIMENSION RxL 2.25 Trant et al., J Diabetes Sci Technol. 2009;3(3):

29 Ensayos EnzimáEcos. Las muestras sanguíneas son someedas a digeseón proteolíeca. Liberación de Val N- ter, que sirve como sustrato de la fructosil valina oxidasa. El H 2 O 2 producido en la reacción, es medido en una reacción enzimáeca acoplada. El cambio de absorbancia está relacionado con el porcentaje de HbA1c. Reto: La comparabilidad (5 cereficados en el 2011 y 20 en el 2013). Weikamp et al., J Diabetes Sci Technol. 2009;3(3):

30 Boronato. 11 para analizadores, cermficados al 2013 (Bio- Rad - in2ita1c- ; Roche, Med corp, Abol, etc.). Sólo 4 HPLC- Boronato (Trinity Biotech). No es específico para HbA1c. Las fracciones glicadas y no glicadas son cuaneficadas a 415 nm. Los analizadores no han alcanzado suficiente reproducibilidad. El reto del HPLC es la robustez del sistema. No sufre interferencias por las variantes de Hb, ni por la hemoglobina carbamilada. LiTle et al., Clin Chem. 2005;51(1):

31 IE- HPLC. Alto desempeño Equipos automaezados, robustos y con alto rendimiento. Llenan los requerimientos clínicos (calibradores en el rango requerido; linearidad 4-19%). Llenan los requerimientos de interpretación. Se Eenen materiales control y programas integrados para los principales interferentes. Los métodos de comparación designados han sido IE- HPLC: Pico Goldstein (1986) Bio- Rex 70 (1996) Diamat, Bio- Rad (2002)

32 Tiempos de corrida cortos, sin afectación de la resolución de la separación ni la precisión. HPLC de intercambio iónico. 34 cereficados en el Se basa en la interacción diferencial de las disentas fracciones de hemoglobina con grupos aniónicos inmovilizados en un soporte inerte. Muestra con la mezcla de hemoglobinas Cartucho con resina aniónica

33 Cuando se elige IE-HPLC, es necesario inspeccionar bien los cromatogramas y si hay picos aberrantes y hay inconsistencias con relación al cuadro clínico es necesario ampliar la investigación. La coelución de la variante de Hb con la HbA0 = subesemación de la HbA1c. La coelución de la variante de Hb con HbA1c = sobresemación de la HbA1c. Elevación falsa de HbA1c: ü Hb carbamilada (Saudek et at, JAMA. 2006;295: ). ü HbS (LiTle et at, J Diabetes Sci Technol. 2009;3(3): , en el sistema HA8140 (fue subsanado en el 8160).

34 Otras variantes provocan también la falsa disminución de HbA1c en HPLC por intercambio catiónico ü Hb Takamatsu (β120lys Gln) Hb G-Szuhu (β80asn Lys) Moriwaki et al, J Clin Pathol. 2003;53: (HA8110, Rango Ref 4.0% a 5.4%, %CV = 0.2%) Más que debilidad, es una fortaleza: el HPLC puede ser de umlidad para detectar hemoglobinopapas silentes! Nasir et al, Int J Diabet Dev C Tries. 2010;30(2):

35 Ventajas de la medición de HbA1c por HPLC ü Buena especificidad, con resultados rápidos de un volumen importante de pruebas, con instrumentos robustos, de alta eficiencia (automatizados). ü Excelente desempeño analítico con resultados altamente precisos y reproducibles, aún en muestras almacenadas en congelación (-70 C, hasta por 18 días, se presentan cambios, pero mínimos y sistemáticos (<0.35%). Selvin et al, Diabet Med. 2005;22: (Bio-Rad). Selvin et al, J Diabet. 2010;2(2): (Tosh). Weykamp et al., J Diabetes Sci technol. 2009;3(3):

36 Ventajas de la medición de HbA1c por HPLC ü En muchos sistemas no se alteran los resultados por las hemoglobinas inestables ni por la hemoglobina carbamilada. Nasir et al, Int J Diabet Dev C Tries. 2010;30(2): Para ideneficar variantes de hemoglobinas es recomendable usar HPLC o espectrometría de masas : Recomendaciones para el monitoreo clínico de la diabetes mellitus.internamonal Diabetes FederaMon, Clinic guidelines task force. Global guideline for type 2 diabetes. hlp://www.idf.org/sites/default/files/idf- Guideline- for- Type- 2- Diabetes.pdf )(Accesed, October 2013).

37 ü Ventajas de la medición de HbA1c por HPLC Con los esquemas anteriores, la HbF co-eluía con la HbA1c, pero con las condiciones analíticas actuales, los métodos de II separan la HbF (pico bien definido), de manera que se puede estimar su elevación (Littleet al, J Diabetes Sci Technol. 2009;3(3): ) ü Se cuenta con calibradores para cumplir con los acuerdos internacionales y los sistemas HPLC más recientes tienen muy buena linearidad (Bio-Rad, Tosoh, HA-8160): Linearidad entre 4-19%, usando Lyphochek HbA1c Linearity Set (Bio-Rad). ü No hay interferencia por Hb carbamilada (León-Justel et al, Clin Biochem. 2009;42: ).

38 Ventajas de la medición de HbA1c por HPLC Imprecisión analítica (CV) Roche INTEGRA Roche INTEGRA Dade Dimension RxL 2.25 Tosoh Tosoh G (Truan et al, J Diab Sci Technol. Variant II :50(2): ). ü Los sistemas HPLC más recientes tienen una precisión intraensayo muy alta (CV < 1%), con precisión interensayo con CV <<< 2%. León-Justel et al, Clin Biochem. 2009;42:

39 Ventajas de la medición de HbA1c por HPLC ü La HbF afecta significativamente al sistema G7- Tosoh (reduccción del 1.9% que parece haber sido resuelta en el 2013), pero no al Variant-II-Turbo (disminución de 0.2% desde el 2009). ü Se cuenta con materiales controles para detectar las hemoglobinas variantes. Por ejemplo: Lyphochek haemoglobin A2 Control Hb 35% (Bio- Rad Laboratories) León-Justel et al, Clin Biochem. 2009;42:

40 Limitaciones de la medición de HbA1c por HPLC ü La mayoría de las hemoglobinas variantes pueden separarse e identificarse, pero hay problemas ocasionales con aquellas pobremente caracterizadas. ü El HPLC es un instrumento de uso exclusivo, no es un analizador para múltiples propósitos. León-Justel et al, Clin Biochem. 2009;42:

41 Interferencia de los métodos para medir la HbA1c (en el rango de 6-9%), por las hemoglobinas variantes S,C,D y E (heterocigotos) y por la elevación de la HbF Empresa Método Interferencia por Inmunoensayo HbAS HbAC HbAE HbAD HbF Abbol Architecture/Aeroset >10% Bayer A1cNOW No No Beckman Synchron System No No No No Ortho- Clinical Vitros No No No No Point ScienMfic HbA1c on modular P No No No No Roche Cobas Integra Roche Cobas Integra Gen.2 (Tina Quant) No No No No Roche/Hitachi Hitachi (Tina Quant) No No No No Siemens Advia (Nueva versión) No No Siemens DCA 2000/Vantage No No No No Si la HbF >10%

42 Empresa Método Interferencia por HPLC por Intercambio Iónico HbAS HbAC HbAE HbAD HbF Bio- Rad D- 10 (Short) No No No No >10% Bio- Rad D- 10 (extended) No No No No Bio- Rad Variant A1c No No No Bio- Rad Variant II NU No No No Bio- Rad Variant II Turbo 2 No No No* No Arkray- Menarini HA8180V No No No Menarini HA8160 (diabetes mode) No No Menarini HA8160 (TP mode) No No No Tosoh G7 No No NO* Tosoh G8 No No No Afinidad por Boronato Trinity (primus) Boronate affinity HPLC No No No No Si HbF >15% EnzimáMco Diazyme Direct enzymamc A1c No No No No

43 Al 2013, hay 34 HPLC de intercambio iónico cereficados por el NGSP Bio- Rad Arkray Tosoh Drew Jiagsu Meranini Shangai H

44 Gracias por su atención!

45 HPLC de Bio- Rad cereficados (marzo, 2013): Variant II dual A2/F/A1c Variant II dual A1c Variant II HbA1 NU D- 10 dual A2/F/A1c D- 10 A1c Variant II Turbo A1c Variant II Turbo Link HbA1c Variant II Turbo Hba1c Kit- 20 hlp://www.ngsp.org

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