Identificación Molecular asistida de especies de los géneros Lithophyllum Lithothamnion

Transcripción

1 Identificación Molecular asistida de especies de los géneros Lithophyllum y Lithothamnion (Corallinophycidae, Rhodophyta) y verificación del barcode gap. Introducción El género Lithothamnion Heydrich es un género con amplia distribución, es capaz de desarrollarse en aguas frías igual que aguas templadas y se observa con menor crecimiento en regiones tropicales (Johansen 1981, Cardinal et al. 1979), por otra parte varias especies del género Lithophyllum Philippi pueden encontrarse en varios tipos de sustrato (Woelkerling & Campbell 1992) esto le permite dispersarse y desarrollarse normalmente en diferentes ambientes. Actualmente las evaluaciones taxonómicas de especies formadoras de rodolitos en el Océano Pacífico Este, han mostrado el amplio rango de distribución de ambos géneros; Riosmena-Rodríguez et al. (1999) en su estudio taxonómico reportó a L. margaritae como la especie más común dentro del Golfo de California con más de 60 localidades registradas; por otra parte Robinson et al. (2013) reportaron a Lithothamnion muelleri como una especie ampliamente distribuida desde Washington hasta Costa Rica. Sin embargo la información molecular sugiere que en ambas especies más de una entidad taxonómica puede estar involucrada (Schaeffer et al. 2002, Hernández Kantún et al. In press, Robinson et al. datos no publicados). Trabajos recientes han mostrado que la identificación y asignación de nombres específicos para las algas coralinas solo es confiable cuando se compara la información molecular de los especímenes tipo (Gabrielson et al. 2011). Estas dificultades en la identificación de las algas coralinas se deben principalmente a la plasticidad morfológica que poseen en general las algas rojas, dando como resultado la presencia de diversidad criptica la cual solo puede ser demostrada bajo la luz de la información molecular (Bittner et al. 2011). En los últimos años el barcoding se ha convertido en una herramienta fundamental para catalogar la gran diversidad de las algas rojas; algunos marcadores han sido evaluados: Robba et al evaluó el marcador COI como código de barras para las algas rojas, sin embargo utilizaron muy pocos especímenes del orden Corallinales (solamente dos especies del género Corallina), recientemente Sherwood et al. 2010, evaluó los marcadores COI, el fragmento Y del gen LSU y el marcador UPA presentando datos considerables del orden Corallinales (67 números acceso en GenBank) sin embargo muy pocos datos de la familia Hapalidiaceae (1 acceso). Adicionalmente Broom et al probó el uso del marcador psba y SSU para la reconstrucción filogenética. Adicionalmente Hernández-Kantún et al. in press, enfocándose en las especies formadoras de rodolitos del Golfo de California y de las costas Europeas propuso el uso del marcador mitocondrial cox2-3 como un código de barras eficaz para las algas coralinas, revelando este marcador como una estrategia novedosa para revelar la diversidad criptica y variación filogeográfica de las especies. Tomando en consideración las evaluaciones previas de los marcadores moleculares y los diferentes patrones evolutivos del grupo de las algas coralinas el presente trabajo tiene la intención de evaluar los barcode gaps, probando el potencial de los marcadores psba y cox1 como códigos de barras utilizando especímenes colectados en un amplio rango de distribución en las costas del Continente Americano. Objetivo del presente estudio El objetivo de la presente propuesta de investigación está enfocado en dos géneros de algas coralinas Lithophyllum y Lithothamnion debido a que ambos presentan una amplia

2 distribución en el Continente Americano. Con el presente trabajo esperamos: i) incrementar el conocimiento de la diversidad de especies de ambos géneros a lo largo de las costas del continente Americano, ii) evaluar la precisión de los marcadores psba y cox1 y evaluar los barcode gaps en nuestros grupos de datos. iii) Proveer información molecular de especímenes tipo de las entidades taxonómicas que han sido registradas en la literatura en las áreas donde nuestros ejemplares han sido colectados Material y métodos Colecta e identificación de los especímenes Las muestras de algas coralinas fueron colectadas mediante snorkel o buceo SCUBA en arrecifes, islas y en pozas de marea en diferentes regiones a lo largo de las costas del Continente Americano; muchas de ellas parecen pertenecer a los géneros Lithothamnion y Lithophyllum. Los especímenes fueron secados después de haber sido colectados y conservados en silica gel para su posterior análisis molecular, dichos especímenes serán identificados al nivel taxonómico más bajo posible después de la observación de las características vegetativas y reproductivas realizando laminas permanentes que serán preparadas siguiendo la metodología descrita por Riosmena-Rodríguez et al Especímenes tipo De acuerdo con Gabrielson et al información molecular de los especímenes tipo es necesaria para asignar correctamente los nombres específicos para las algas coralinas, por lo tanto hemos realizado una revisión bibliográfica de la literatura publicada en las regiones donde nuestros ejemplares han sido colectados; con el objetivo de encontrar las entidades hipotéticas de los géneros Lithothamnion y Lithophyllum, requeriremos estos materiales tipo a los herbarios UC, PC, TRH, CO y L donde muchos de ellos han sido almacenados; estos ejemplares serán procesados utilizando la misma metodología para extracción de ADN, PCR y secuenciación que las colecciones modernas. Trabajo Molecular El trabajo molecular será desarrollado en el Ryan Institute, Universidad Nacional de Irlanda, Galway, del 22 de Mayo al 2 de Agosto del 2013; un total de 94 especímenes que parecen ser congénericos con Lithothamnion y Lithophyllum están disponibles para realizar trabajo taxonómico y molecular. Extracción de ADN, amplificación mediante PCR y secuenciación. La extracción de ADN se realizara a partir de tejido de algas coralinas el cual será removido de la superficie de las plantas libres de epifitas, raspando la superficie del alga con pinzas o con un pequeño taladro manual, utilizando un microscopio de disección; el ADN será extraído utilizando el método descrito por Broom et al. 2008; utilizando el kit de extracción NucleoSpin 96 Tissue kit (Macherey-Nagel, GmbH and Co. KG, Germany) el locus psba será amplificado y secuenciado utilizando los primers psbaf1 (5 ATGACTGCTACTTTAGAAAGACG 3 ) y psbar2 (5 TCATGCATWACTTCCATACCTA 3 ) (Yoon et al 2002) y el locus cox1 sera amplificado y secuenciado utilizando los primers para la región del código de barras en algas rojas: GazF1 (5 TCAACAAATCATAAAGATATTGG 3 ) y GazR1 (5 ACTTCTGGATGTCCAAAAAAYCA 3 ) (Saunders 2005). El mix de PCR será preparado

3 siguiendo las condiciones estandarizadas manejadas en el laboratorio del ISRG en el Ryan Institute NUIG. Los productos de PCR serán cuantificados visualmente en geles de agarosa 1.5% (1.2 g agarosa +80 ml TBE 0.5%); cuando se visualicen bandas claras en el gel, los productos de PCR serán purificados utilizando el kit de purificación (Pure Link PCR K , K ) después del proceso de purificación los productos de PCR serán enviados al servicio de secuenciación GATC Biotech (hhtp:// Análisis de los datos (cox1 y psba) Las secuencias forward y reverse serán alineadas y editadas utilizando el programa Bioedit (Hall 1999); solamente las secuencias con calidad alta serán utilizadas en el análisis. El alineamiento final y la variación entre las especies será analizada utilizando el método de Neighbor Joining (NJ) utilizando el programa SeaView (Gouy et al. 2010) con 100 pseudoreplicas de bootstrap, Las secuencias serán depositadas en la base de datos GenBank ( Objetivos específicos Evaluar la gran diversidad de las especies formadoras de rodolitos (Corallinophycidae, Rhodophyta) utilizando información taxonómica y molecular. Proporcionar información molecular (loci psba y cox1) de especímenes tipo de las entidades taxonómicas hipotéticas reportadas en las regiones donde se han colectados nuestros especímenes. Evaluar la precisión de los loci psba y cox1 como código de barras par las algas coralinas. Verificar el barcode gap con los grupos de datos de cada marcador molecular Resultados esperados Los resultados obtenidos de la presente propuesta de investigación serán presentados en dos artículos científicos; debido a que los patrones de diversificación y distribución de ambos géneros parece estar diferenciados y en orden de presentar información biogeogragráfica clara y comprensible acerca de la distribución de las especies y los nombres específicos validos utilizados para ambos géneros, consideramos que nuestra información deberá ser publicada por separado, el primero presentara la información de las especies del genero Lithophyllum mientras que el segundo presentara la información de las especies del genero Lithothamnion. Los títulos provisionales para ambos trabajos son: 1) Molecular assisted identification of Lithophyllum (Corallinophycidae, Rhodophyta) using barcorde regions. 2) Molecular assisted identification of Lithothamnion (Corallinophycidae, Rhodophyta) using barcorde regions

4 Calendario de actividades 22 al 31 de Mayo del 2013 Extracción de ADN de especímenes tipo de los herbarios TRH, PC, UC, L, CO. (30 especímenes) 1-9 Junio del 2013 Amplificación mediante PCR y secuenciación de especímenes tipo cox1 and psba de Junio del 2013 Extracción de ADN de muestras del Golfo de California (25 especímenes) Junio del 2013 Amplificación mediante PCR y secuenciación de especímenes del Golfo de California cox1 y psba Junio del 2013 Extracción de ADN de especímenes del Golfo de México (34 especímenes) 1-7 Julio del 2013 Amplificación mediante PCR y secuenciación de especímenes del GOM cox1 y psba 8-14 Julio del 2013 Extracción de ADN de especímenes de Argentina (27 especímenes) Julio del 2013 Amplificación mediante PCR y secuenciación de especímenes de Argentina cox1 y psba Julio del 2013 Extracción de ADN de especímenes de Chile (8 especímenes) 29 Julio al 2 de Agosto del 2013 Amplificación mediante PCR y secuenciación de especímenes de Chile cox1 y psba.

5 Referencias Bittner, L., Payri, C. E., Maneveldt, G. W., Couloux, A., Cruaud, C., De Reviers, B. & Le Gall, L Evolutionary history of the Corallinales (Corallinophycidae, Rhodophyta) inferred from nuclear, plastidial and mitochondrial genomes. Mol. Phylogenet. Evol. 61: Broom, J.E.S., D.R. Hart, T.J. Farr, W.A. Nelson, K.F. Neil, A.S. Harvey y Wm.J. Woelkerling Utility of psba and nssu for phylogenetic reconstruction in the Corallinales based on New Zealand taxa. Molecular Phylogenetics and Evolution 46: Cardinal, A., Caboich, J. & Gendron, L Les Corallinacées (Rhodophyta, Cryptonemiales) des cotes du Québec. 2. Lithothamnium Philippi emend. Adey. Cah. Biol. Mar. 20: Dawson, E. Y Marine red algae of Pacific Mexico, Part 3 Cryptonemiales, Corallinaceae subf Melobesioideae. Pacific Naturalist. 2: Galicia-García, C. & A. Morales-García Investigaciones sobre macroalgas realizadas en el Sistema Arrecifal Veracruzano. In: Granados-Barba, A., L. Abarca-Arenas & J. M. Vargas-Hernández (eds.). Investigaciones Científicas en el Sistema Arrecifal Veracruzano. pp Gabrielson, P.W., K.A. Miller y P.T. Martone Morphometric and molecular analyses confirm two distinct species of Calliarthron (Corallinales, Rhodophyta), a genus endemic to the northeast pacific. Phycologia. 50(3): Gouy M., Guindon S. & Gascuel O. (2010) SeaView version 4 : a multiplatform graphical user interface for sequence alignment and phylogenetic tree building. Molecular Biology and Evolution 27(2): Hall, T.A BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. No. 41, 97: Johansen, W.H Bosiella, a genus of articulated corallines (Rhodophyceae, Cryptonemiales) in the eastern Pacific. Phycologia. 10: Mendoza, M.L Estudio morfogenético, reproductivo, sistemático, y biogeográfico de algunos Lithothamnion (Corallinaceae) de las costas de la Isla Grande de Tierra del Fuego. Gayana, Bot., 45 (1-4): Riosmena-Rodríguez, R., Woelkerling, Wm. J. & Foster, M. S Taxonomic reassessment of rhodolith-forming species of Lithophyllum (Corallinales, Rhodophyta) in the Gulf of California, Mexico. Phycologia 38: Robba, L., S.J. Russell, G.L. Barker and J. Brodie Assessing the use of the mitochondrial cox1 marker for use in DNA barcoding of red algae (Rhodophyta). American Journal of Botany. 93: Robinson, N.M., Hansen, G.I., Fernández-García, C., & Riosmena-Rodríguez, R A Taxonomic and distributonal study of the rhodolith-forming species Lithothamnion muelleri (Corallinales, Rhodophyta) in the Eastern Pacific Ocean. Algae. 28: Schaeffer, T.N., Smith, J.G., Foster, M.S. & DeTomaso, A Genetic Differences between two growth-forms of Lithophyllum margaritae (Rhodophyta) in Baja California Sur, Mexico.J. Phycol Sherwood, A.R., Sauvage, T., Kurihara, A., Conklin, K.Y. & Presting, G.G A comparative analysis of COI, LSU and UPA marker data for the Hawaiian

6 Florideophyte Rhodophyta: implications for DNA barcoding of red algae. Cryptogamie, Algol. 31: Taylor, W.R Pacific Marine Algae of the Allan Hancock Expeditions to the Galapagos Islands. A. Hancock Pac. Exped. 12: I-IV, pls. Woelkerling, Wm. J. & Campbell, S.J An account of southern Australian species of Lithophyllum (Corallinaceae, Rhodophyta). Bull. Br. Mus. Hist. 22: Yoon, H.S., Hackett, J.D., Bhattacharya, D., A single origin of the peridinin- and fucoxanthin-containing plastids in dinoflagellates through tertiary endosymbiosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, Dr. Rafael Riosmena Rodríguez Universidad de Baja California Sur B.C.S, México Director Dr. Svenja Heesch Irish Seaweed Research Group Ryan Institute NUI Galway Asesor Principal Ph.D. Candidate.Jazmín Hernández Kantún Irish Seaweed Research Group Ryan Institute NUI Galway Co-Asesor