UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE Facultad de Ciencias Veterinarias

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1 UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE Facultad de Ciencias Veterinarias Facultad de Ciencias Agrarias Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos Determinación de células somáticas en leche cruda recepcionada en plantas lecheras, mediante dos métodos de recuento Tesis de grado presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de LICENCIADO EN MEDICINA VETERINARIA German Antonio Melo Poblete Valdivia Chile 1998

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3 A MIS PADRES

4 INDICE Pag. 1. RESUMEN SUMMARY INTRODUCCION MATERIAL Y METODO RESULTADOS DISCUSION BIBLIOGRAFIA ANEXOS AGRADECIMIENTOS... 88

5 1 1. RESUMEN En el presente trabajo se determinó el contenido de células somáticas de leche cruda recepcionada en las plantas lecheras. Los métodos utilizados fueron el Recuento Microscópico Directo (RMD) y el Recuento Celular Electrónico (RCE). Este último, a través de un contador electrónico de partículas Coulter Counter. Fueron analizadas 193 muestras de leche obtenidas de 17 plantas industriales, abarcando desde Chillán (VIII región) hasta Llanquihue (X región). Las muestras fueron tomadas cada 15 días, desde el 1 ero de Junio hasta el 29 de Noviembre de Se determinó el valor promedio, así como el comportamiento a través de las quincenas y regiones. Además se calculó el factor de correlación entre los dos métodos utilizados. Los recuentos celulares por RMD y RCE indicaron un promedio de céls/ml y céls/ml, respectivamente. Además, el 91,2% y el 87,5% de las muestras, han mostrado valores menores a céls/ml, medidas por los métodos antes señalados. Para el método RMD, se determinó diferencias significativas (p<0,05) entre las quincenas 1 a de Junio, 1 a de Agosto, 1 a de Septiembre y 2 a de Octubre. En el caso del método RCE, no se detectó diferencias significativas (p>0,05) entre quincenas. A nivel regional, no existieron diferencias significativas (p>0,05) para los recuentos por ambos métodos. Por región, los recuentos analizados por el método RMD en la VIII región, presentaron diferencias significativas (p<0,05) en tres quincenas. Las otras regiones, al ser tomadas individualmente, no registraron diferencias. Los recuentos analizados quincenalmente entre regiones no mostraron diferencias significativas (p>0,05), sino tan solo entre distintas quincenas de diferentes regiones. Los recuentos celulares, analizados por el método RCE, no presentaron diferencias significativas (p>0,05) dentro de las regiones por quincena. Se obtuvo diferencias significativas (p<0,05), entre los métodos RMD y RCE y a nivel de la X región, específicamente en la 10 a y 11 a quincenas. La correlación obtenida para todas las muestras fue de 0,67 (p<0,05), entre los métodos de recuentos utilizados, la cual fue baja en, comparación con otros estudios realizados. Al analizar las correlaciones por región, la VIII región presentó el valor más alto 0,81 (p<0,05), la IX región un valor de 0,77 (p<0,05) y la X región un valor de 0,54 (p<0,05). Palabras claves: Leche, recuento de células somáticas, recuento microscópico directo, recuento celular electrónico.

6 2 2. SUMMARY The main goal of the research was the determination of the somatics cells content of raw milk, collected in dairy plants located between VIII and X geographic regions. Direct Microscopic Count (DMC) as well as Electronic Cell Count (ECC), by means of a Coulter Counter, were the two analytical methods employed. A total of 193 milk samples from 17 dairy plants were analysed. The dairy industries were sampled every 15 days, from June the l st until the end of November Average values and their behaviour through time and regions were established. Besides, correlations between the two methods were also considered. 91.2% of samples checked by DMC and 87.5% of samples analysed by ECC showed somatic cells counts lower than 500,000 cells/ml, being the average of 364,172 cells/ml and 377,962 cells/ml, respectively. In case of DMC, significant differences (p<0.05) were observed between the fortnights lst of June, lst of August, lst of September and the second half of October. The other method, ECC, did not exhibit significant differences (p>0.05) when fortnights were considered. Analysing data as a whole region, methods did not show significant differences. On the other hand, data collected in VIII region indicated significant difference (p<0.05) when three fifteen days periods were considered. Moreover, in other regions, analysed as individual cases, did not present significant differences as well. The somatic cells count, within the various regions, by means of ECC, did not show significant differences (p>0,05) when periods of 15 days were under observation. Between both methods DMC and ECC, significant differences (p<0.05) were specifically observed on the 10 a and 11 a fortnights of the X region. The correlation coefficient, between both methods, and for all the samples, was 0.67, value considered lower in comparison with other similar researches. VIII region exhibit the highest correlation, 0.81 (p<0.05), followed by IX region, 0.77 (p<0.05) and X region was the geographical area showing the lowest value, 0.54 (p<0.05). Key words: milk, somatic cells count, direct microscopic count, electronic cell count.

7 3 3. INTRODUCCION GENERALIDADES. La producción lechera se ha convertido en una de las actividades con mayor dinamismo dentro del sector agrario nacional. Es así como en 1997, se llegó a un volumen de recepción de leche en planta del orden de los millones de litros, con un incremento anual de un 8,6% en comparación con los millones de litros de 1996 (ODEPA, 1997). Tal aumento en la producción y el consumo de leche en el último tiempo han llevado al incremento de los niveles de calidad de los productos elaborados como consecuencia de la competitividad y de las nuevas demandas de los consumidores. Los actuales niveles de calidad de los productos no sólo se refieren a las metodologías de procesamiento de leche, sino que engloban a toda la cadena productiva que es, en definitiva, la responsable de la calidad de la materia prima, pilar fundamental para la génesis de productos de mayor calidad. Consciente de este hecho es que en 1978 y 1979 el Ministerio de Agricultura establece los Decretos N 271 y N 178, que fijan el control y clasificación de la leche según calidad, a la vez que ratifican lo dispuesto en el decreto N 377 que promulgó el Reglamento Sanitario de los Alimentos y sus posteriores modificaciones sobre las características que deben tener las leches recolectadas para ingresar a planta. Actualmente la industria se encuentra con un nuevo desafío, cual es la apertura de los mercados internacionales. Esto lleva consigo la competencia con productos extranjeros, los cuales tienen estándares de calidad distintos a los nuestros, teniendo la industria que igualarlos o superarlos para poder tener posibilidades reales de competencia con su pares, por lo que se hace necesario actualizar la reglamentación vigente. Algunas de las nuevas normas exigidas son las señaladas por la International Organization Standardization (ISO 9000), junto con el Análisis de Riesgos y Control de Puntos Críticos (HACCP) y los dictámenes de la Comunidad Económica Europea (CEE). Por la falta de renovación en la clasificación y pago de las leches crudas de acuerdo a su calidad higiénica y composicional, establecida en el decreto N 271 y ratificada en el decreto N 178, es que las industrias procesadoras de leche han establecido nuevas formas de pago para sus productores, las cuales entraron en vigencia el 1 de Octubre de La idea general es fomentar aún más la optimización de la calidad de la leche entregada por el productor, mediante bonificaciones y castigos, para disminuir las pérdidas por concepto de rechazo y problemas que deriven en la calidad final del producto.

8 4 Muy conscientes de tal situación y preocupados de su evolución, es que un equipo de investigadores, formado por Erwin Carrasco, Manuel Pinto y Bernardo Fraser, bajo la dirección del primero, han sido apoyados por FONDECYT para la realización del estudio denominado "MODELACION DE LA VARIACION ESTACIONAL Y REGIONAL DE LA LECHE CRUDA EN LAS REGIONES VIII a X" llevado a cabo en el Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos de la Universidad Austral de Chile (Proyecto Fondecyt N ). El objetivo primordial de dicho estudio es la generación de herramientas que faciliten la obtención y el procesamiento de la información acerca de calidad composicional e higiénica de la leche, haciéndola más expedita y oportuna para la acertada toma de decisiones por los integrantes de la cadena productor-consumidor. Adicionalmente, se plantea la hipótesis que el adecuado conocimiento de la realidad nacional en dicho rubro, redundará en una más pronta adaptación del sistema lechero de las regiones señaladas, tanto a las demandas de productividad como de calidad exigidas, que se requieren para competir en los mercados internacionales. Para la ejecución del estudio, se han comprometido numerosas tareas, las cuales pueden ser resumidas en las siguientes: 1.- Determinación de la variación estacional y regional de los siguientes parámetros de la leche cruda: a) Composición b) Propiedades físico-químicas c) Parámetros higiénicos d) Propiedades de aptitud 2.- Modelación de la variación de los parámetros indicados en series cronológicas. 3.- Establecimiento de correlaciones y funciones de clasificación para el pronóstico y/o clasificación por tramos, para el contenido de agua, células somáticas, recuento total, estabilidad térmica y coagulabilidad en función de propiedades físicas. De este modo, la presente tesis se enmarca como parte de este estudio en una de sus primeras etapas, constituyendo una base para análisis posteriores referentes a los recuentos celulares que se han descrito anteriormente. Para poder entender la importancia que tiene hoy en día el concepto de calidad, y específicamente calidad de leche, es que a continuación se realizará una presentación de los aspectos más relevantes que tienen relación con la calidad de leche y su reglamentación vigente.

9 CALIDAD DE LECHE. La calidad se define como el cumplimiento de un conjunto de requisitos e idoneidad para el uso. En el caso de la leche es equivalente a la aptitud para ser utilizada en la elaboración de los diferentes productos lácteos y, por lo tanto, es el usuario quien finalmente define lo que es calidad (Heimlich y Carrillo, 1995). El Ministerio de Salud de Chile (1982), define leche como "el producto de la secreción mamaria normal de vacas sanas, bien alimentadas y en reposo, exenta de calostro", y según la Federación Internacional de Lechería (FIL) es: "el producto de la secreción mamaria normal obtenida por una o más ordeñas, sin ninguna adición o sustracción" (Citado por Casado y García, 1983). Estas definiciones establecen intrínsecamente el concepto de calidad. No obstante, la calidad de la leche cruda ha sido definida por las autoridades de Salud Pública y por el Ministerio de Agricultura. Como primera instancia, la leche debe satisfacer los requisitos establecidos por ambas autoridades. Sin embargo, las plantas requieren leche con especificaciones más exigentes que las que establecen estos reglamentos (Heimlich y Carrillo, 1995). En el nuevo Reglamento Sanitario de los Alimentos (Ministerio de Salud, 1997) se especifican las siguientes características para la leche cruda: a) Presentar caracteres organolépticos (sensoriales) normales. b) Estar exenta de materias extrañas. c) Tener un peso específico: 1,028 a 1,034 a 20 C. d) Poseer un índice crioscópico entre -0,53 y -0,57 "Horvet" ó -0,512 a -0,550 C. e) Tener un ph entre 6,6 a 6,8. f) Tener una acidez entre 12 a 21 ml de hidróxido de sodio 0,1 N/ por 100 ml de leche. g) Tener sólidos no grasos como mínimo 82,5 gramos por litro. h) Estar exenta de sangre y pus. i) Estar exenta de antisépticos, antibióticos y neutralizantes. Los residuos de plaguicidas y otras sustancias nocivas para la salud no deberán exceder los límites establecidos por el Ministerio de Salud, j) Tener un recuento en placa no superior a 1 millón de ufc por ml. En general son estas mismas especificaciones las que componen el decreto N 178 y, de acuerdo al decreto N 271 (Ministerio de Agricultura, 1978), se establecen rangos para clasificar la leche de acuerdo a la calidad microbiológica,permitiendo calificar la leche según su calidad, relacionando la presencia de células somáticas, así como la prueba de reducción del azul de metileno (TRAM) para el recuento de bacterias. Esta clasificación considera tres categorías que son:

10 6 - Clase A: TRAM: igual o mayor a 3 horas. Células somáticas: grado negativo del CMT, no superior a cél/ml. Densidad: igual o mayor a 1,029 gr/ml. (20 C). - Clase B: TRAM: menor de 3 horas y mayor o igual a 1 hora. Células somáticas: grado traza y 1 del CMT o entre y cél/ml. Densidad: igual o mayor a 1,029 gr/ml. (20 C). - Clase C TRAM: menor a 1 hora. Células somáticas: grado 2 y 3 del CMT o superior a cél/ml. Densidad: inferior a 1,029 gr/ml. (20 C). En general, lo que se exige es que la leche sea como aquella que se extrae de un animal sano (sin tratamiento), con los mínimos cambios en sus propiedades sensoriales, químicas y libre de contaminaciones, ya sea por microorganismos o compuestos químicos; además, debe estar exenta de factores que puedan implicar riesgos de Salud Pública o que involucren pérdidas en la elaboración de productos lácteos y, obviamente, no debe estar adulterada por aguado (Heimlich y Carrillo, 1995). La calidad de leche cruda, por lo expresado anteriormente, engloba diversos factores. Dentro de estos deben considerarse dos aspectos básicos: calidad composicional y calidad higiénica Calidad higiénica. La leche, debido a su alto valor biológico y a su composición, es un medio óptimo para el desarrollo de microorganismos, convirtiéndose en un producto altamente perecible e inestable, al igual que otros alimentos de origen animal o vegetal, por modificar rápidamente sus características en el curso del tiempo. Si bien son incuestionables las cualidades nutricionales de la leche y de los productos lácteos, no es menos cierto que, desde su síntesis, en la glándula mamaria hasta su llegada al consumidor, estas cualidades están sometidas a un gran número de factores que hacen peligrar la calidad original. Estos riesgos son la contaminación y multiplicación de microorganismos, la contaminación con gérmenes patógenos, las alteraciones físico-químicas de sus componentes, la absorción de olores extraños, la generación de malos sabores y la contaminación con sustancias químicas como pesticidas, antibióticos, metales, detergentes, desinfectantes, partículas de suciedad, etc. Todos estos, ya sea en forma aislada o en conjunto, conspiran en forma negativa sobre la calidad higiénica y nutricional del producto y, consecuentemente, atentan contra la salud pública y economía de cualquier país (Magariños, 1990).

11 7 La calidad bacteriológica es, sin lugar a dudas, el parámetro de calidad más importante, debido a las implicancias tecnológicas, económicas y de salud humana (Von Baer y Vial, 1976). Según Brito y Molina (1991), la IDF define la "leche de buena calidad higiénica" como aquella que: - Se encuentra libre de toxinas y microorganismos patógenos, así como de residuos químicos e inhibidores. - Presenta un mínimo de microorganismos saprófitos. - Presenta un mínimo de células somáticas. - Presenta adecuadas condiciones organolépticas. La producción de leche con una adecuada calidad higiénica, como debiera ser en todo sistema productivo, resulta sumamente compleja, ya que el producto a manejar es extremadamente delicado, afectándose mucho por la manipulación. En la producción de leche interactúan innumerables factores, y todos, de una u otra manera, se encuentran relacionados (Magariños, 1990). Uno de los factores que más influyen en la calidad higiénica de la leche es, sin duda, la mastitis, y como tal, ha sido fuente de numerosas investigaciones. A continuación se hará una presentación de esta enfermedad y su consecuencias en la producción de una leche de calidad LA MASTITIS COMO UN FACTOR QUE AFECTA LA CALIDAD DE LA LECHE Mastitis y células somáticas. La Federación Internacional de Lechería (IDF, 1971), definió la mastitis bovina como una inflamación de la glándula mamaria, producida principalmente por una infección bacteriana, la cual se caracteriza por los cambios físico-químicos producidos en la leche y por el aumento anormal de células somáticas, en especial leucocitos polimorfo-nucleares (PMN).

12 8 El recuento de células somáticas refleja el grado de mastitis que afecta los cuartos de las vacas de las cuales fue extraída la leche, es decir, el grado de infección e inflamación que manifiestan las glándulas mamarias (Heimlich y Carrillo, 1995). En el período de lactancia, la glándula mamaria es extremadamente sensible a alteraciones, por ejemplo las debidas a infecciones, que pueden producir todos los signos cardinales de la inflamación aguda, tales como rubor, tumefacción, calor, dolor y pérdida de la función. Estos son los signos de una mastitis aguda claramente visibles, pero una subaguda y a veces inflamaciones crónicas, son menos obvias. Una de las respuestas básicas a una infección bacteriana es la infiltración de tejidos por los leucocitos, principalmente PMN, los cuales se considera que juegan un mayor rol en la protección de la glándula mamaria a través de la fagocitosis (Jain, 1976; Paape y col., 1979). La mastitis bovina es una de las afecciones más frecuentes, tanto en las explotaciones lecheras del país como del extranjero. La mastitis de tipo clínica, que se aprecia al examen de la glándula mamaria o la leche, en Chile no representa más del 2% como promedio de los casos registrados en los rebaños (Zurita, 1988a). El verdadero problema lo constituye la mastitis subclínica, donde no se aprecian alteraciones macroscópicas en la glándula ni en la leche, y sólo puede diagnosticarse por métodos especiales (Zurita, 1988a; Gómez, 1991). En nuestro país se estima que más del 70% de las vacas y el 45% de los cuartos mamarios en producción, presentan algún grado de mastitis del tipo subclínica (Zurita, 1988b). La mastitis no sólo afecta cuantitativamente la producción de leche, sino también altera su calidad composicional e higiénica, lo que varía de acuerdo a la severidad y duración de la infección. En la mastitis subclínica, aunque la leche está aparentemente normal, se produce un daño del tejido secretor que trae como consecuencia la disminución de algunos constituyentes normales de la leche (lactosa, materia grasa, caseína), y el aumento de componentes sanguíneos (inmunoglobulinas, seroalbúminas, sodio, cloro), debido a la alteración de los capilares que rodean a los alvéolos del tejido glandular (Casado y García, 1986; Kruze, 1988). Estas modificaciones físico-químicas en la leche modifican la calidad del producto final. Es así como un elevado contenido de ácidos grasos libres produce rancidez, la que dificulta la elaboración de productos fermentados. La disminución de caseína y el ph alcalino, disminuyen la producción de queso y el aumento de sodio y cloruros afectan negativamente la coagulación prolongando el tiempo y costos de elaboración-(kruze, 1988).

13 Factores que influyen en la presentación de mastitis. Existen muchos factores predisponentes y determinantes que influyen en los animales para adquirir esta patología; entre estos están los factores hereditarios como el sistema inmunitario, la productividad, la conformación de la ubre y pezones, así como factores adquiridos tales como enfermedades metabólicas, virales y puerperales, además de parasitismo y problemas de pezuña (Morales, 1993). Adicionalmente se destacan los factores ambientales como son las construcciones (donde influyen el tamaño de los cubículos, el tipo de superficie de los alojamientos y pasillos, el clima y el aseo del establo, las necesidades de espacio, y el comportamiento jerárquico del ganado), la alimentación (por la falta de fibra, la cantidad de energía y proteína, como el aporte de minerales y vitaminas), el ordeño (el aseo de la ubre, el masaje, el sobre o subordeño, la técnica del ordeño, el nivel de vacío, el rendimiento del equipo de ordeño, el número de unidades, el tamaño de los colectores, el aseo del equipo y el estado de las piezas de goma, entre otros) (Morales, 1993). Al respecto Kruze (1994) señala que entre los factores determinantes, el responsable del 90% de los casos de mastitis son los agentes bacterianos. Las vacas lactantes están expuestas a una elevada variedad de bacterias del tipo Gramnegativas y además a muchos potenciales patógenos existentes sobre la piel y mucosas. No obstante, la alta tasa de exposición, las infecciones mamarias por bacterias Gram-negativas son bajas comparadas a infecciones por bacterias Gram-positivas. Esto es debido a la corta duración de la infección por las primeras, las cuales son resueltas usualmente en días o pocas semanas. En promedio, un 1% de los cuartos mamarios de la población de vacas lecheras puede tener infecciones intramamarias con bacterias Gram-negativas, en comparación a una tasa de infección del 35 a 50% para las bacterias Gram-positivas (Giesecke y col., 1994; Paape y col., 1986). Se ha estimado que a ordeñas son necesarias para observar una infección intramamaria por organismos Gram-negativos (Eberhart, 1977). En cambio, la frecuencia de infecciones por organismos Gram-positivos es una en 600 ordeñas (O'Shea, 1985). Sin embargo, las infecciones por bacterias Gram-negativas suman un 35 a 50% de todos los casos clínicos en un rebaño lechero (Eberhart, 1977)..0 McDonald (1979), Philpot (1979) y Kruze (1994) concuerdan, que el 95% de los casos de mastitis son causados por Staphylococcus aurem, Streptococccus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae y Streptococcus uberis, y el porcentaje restante de las infecciones son causadas por bacterias del tipo coliformes, principalmente E. coli, Klebsiella, Aerobacter y otros patógenos ocasionales. En relación al tipo de infección, vacas no infectadas exhiben recuentos bajos de células somáticas, con un promedio de céls/ml, en cambio, en aquellas afectadas por patógenos menores, sus recuentos aumentan a céls/ml, pudiendo alcanzar un valor de céls/ml con infecciones causadas por patógenos mayores (Reneau, 1986).

14 Fisiología celular de la glándula mamaria lactante. El contenido de células somáticas de la leche es afectado por una serie de factores fisiológicos, entre los que se encuentran la raza, edad, etapa de lactancia, manejo del rebaño y factores ambientales (estrés) como excitaciones y altas temperaturas (Reichmuth, 1975). La secreción mamaria bovina contienen varios tipos de leucocitos: polimorfo nucleares (PMN), linfocitos y macrófagos (Lee y col., 1980; Jensen y Eberhart, 1981; McDonald y Anderson, 1981). Según Lee y col (1980), Zurita (1988b) y Butendieck (1995); las células epiteliales representan menos del 2% del número total de células somáticas de la leche de vaca. El número y proporción relativa de cada tipo de leucocito está influenciado por los varios estados fisiológicos y patológicos de la ubre (Watson, 1980). Durante el período de lactancia, la leche de una glándula mamaria bovina normal contiene un promedio de 2,0 x10 5 células somáticas/mi. (Casado y García, 1983; Veisseyre, 1988; Zurita, 1988a; Champagne y Goulet, 1991; Pedraza, 1995) con una composición de aproximadamente 12% de PMN, 60% de macrófagos y un 28% de linfocitos (Lee y col., 1980; Paape y col., 1981). Jensen y Eberhart (1981) y McDonald y Anderson (1981) informaron recuentos celulares de 1,0 x10 5 a 2,8 x10 5 células/ml, alrededor de una semana post-parto con una proporción de macrófagos y PMN de un 37% para ambos. Schultz (1977), señala que hacia el final del período de lactancia, hay normalmente un incremento del número total de células en céls/ml. y en la proporción de PMN (Blackburn, 1966). Durante este período, el número de células/ml asciende a cerca de 6,0 x10 5, consistentes en aproximadamente un 40% de PMN, 30% de macrófagos y 30% de linfocitos (Concha, 1986) Evaluación del contenido celular de la leche. La evaluación del contenido de células somáticas se realiza a través de una serie de métodos. Estos métodos se clasifican de acuerdo a su forma de medición en: - Métodos de medición directa (recuento de partículas). - Métodos de medición indirecta (interacción DNA-agente tensoactivo). Los métodos de medición directa son: Recuento Microscópico Directo (RMD), Recuento Celular Electrónico mediante el contador de partículas Coulter Counter y el Fossomatic. Los métodos de medición indirecta son: California Mastitis Test (CMT), Wisconsin Mastitis Test (WMT), Viscosímetro y DNA-fíltro.

15 11 El Recuento Microscópico Directo (RMD) fue creado por Prescott y Breed, que es el primer procedimiento microscópico para el examen de frotis en leche, con el fin de contabilizar las bacterias y leucocitos presentes en ella (Gordon y col., 1980). Este método se basa en la observación al microscopio de un frotis de leche teñido con el colorante Newman Lampert, con el cual se pueden apreciar el núcleo de los leucocitos (Chile, Instituto de Normalización, 1979a). Este es un método laborioso y no muy preciso, pero es el método de referencia con el que se comparan todos los nuevos procedimientos de recuento de células somáticas (Bremel, 1980). Leidl y col. (1961) indican que existe una serie de factores que hacen variar los valores de los RMD entre los que se encuentran la experiencia del operador con el método, la calidad del frotis y la cantidad de frotis que cuenta. Por estos factores los recuentos pueden tener hasta un 45% de error con un promedio de 15% para leche con menos de cél/ml. El método de Recuento Celular Electrónico, mediante el contador de partículas (Coulter Counter), se basa en la clasificación y recuento de partículas de dimensiones submilimétricas en suspensión en un medio electrolítico, mediante un instrumento electrónico y en base a la variación de resistencia eléctrica del electrolito (Chile, Instituto Nacional de Normalización, 1979b). Este método puede usarse en leche fresca o preservada, tiene gran exactitud y se pueden procesar muchas muestras al día. El problema es su continua estandarización y alto costo inicial, además requiere de técnicos especializados para su operación y mantención (Bremel y col., 1977). Grootenhuis (1975) señala que los factores que generan más errores en el método están en la dilución de la muestra, la calibración del contador electrónico, la homogeneización de la muestra y los disturbios electromagnéticos del aparato. El método de Recuento Celular Electrónico mediante el Fossomatic, consiste en que el DNA de las células somáticas de la muestra de leche, al combinarse con el bromuro de etilo, forman un complejo coloreado, que emite una fuerte fluorescencia con una longitud de onda característica cuando es irradiado mediante una luz azul por una lampara de xenón. La emisión de energía lumínica es detectada electrónicamente, y el resultado es entregado y registrado para cada muestra sucesivamente (Schmidt, 1975). Según Heald y col (1977); este método permite un bajo costo por muestra, se puede procesar gran cantidad de leches al día y es un sistema exacto, por lo tanto recomendable para usarlo en laboratorios centrales.

16 12 El California Mastitis Test (CMT), es un método semicuantitativo para determinar mastitis (Gordon y col, 1980). Este método funciona con un reactivo que es un detergente neutro (alquil aril sulfonato), el que permite adicionar un indicador de ph (púrpura de bromocresol) para evaluar la alcalinidad de la leche. La reacción del detergente con el DNA del núcleo de las células, origina una determinada viscosidad. De acuerdo al grado de viscosidad se registra con símbolos diferentes como N, T, 1, 2, 3, +, e Y. Generalmente, la N significa reacción negativa, la T indica la presencia de recuentos menores a céls/ml, el registro 1 indica presencia de céls/ml o más, un registro 2 indica céls/ml o más y un registro 3 indica sobre céls/ml. El símbolo + muestra que el ph de la leche es 7,0 o alcalina, mientras el símbolo Y (amarillo) determina la acidez de la mezcla. Nageswararao y Calbert (1969), encontraron que la viscosidad y el registro de CMT disminuían gradualmente en forma similar al número de leucocitos vivos. Esto indica que la viscosidad de la reacción CMT es causada por los leucocitos vivos. El efecto se debe a una baja en el complejo DNA-proteína del núcleo del leucocito que es necesario para la formación del gel una vez que este muere, debido a que está expuesto a la acción de las desoxirribonucleasas y proteasas normalmente presentes en leche o liberadas de las células muertas (Nageswararao y Calbert, 1969). Otro método indirecto de medición de células somáticas es el viscosímetro, que se basa en la adición de un reactivo específico (alquil aril sulfonato de sodio, solución al 2% de ingrediente activo) a la muestra de leche, con el cual se forma un gel en presencia de células somáticas. La viscosidad del gel se cuantifica mediante una bolita de acero que se desplaza por gravedad dentro del tubo del viscosímetro (Chile, Instituto de Normalización, 1979b). La edad y temperatura de almacenamiento de la muestra de leche influyen en los registros del viscosímetro, lo cual indica que el método debe usarse principalmente en muestras de leche fresca para evitar errores en los recuentos (Duirs y Cox, 1977) OBJETIVOS. De acuerdo a lo mencionado anteriormente, los objetivos del presente trabajo son: a ) Determinar para la leche cruda recepcionada en silos o estanques de almacenamiento de las plantas industriales los valores de los recuentos de células somáticas por los métodos de medición directa Recuento Celular Electrónico (RCE) y el método Recuento Microscópico Directo (RMD). b ) Determinar valores promedio de referencia. c ) Establecer posibles diferencias significativas a través del tiempo entre las diferentes zonas. d) Establecer la correlación entre los métodos.

17 13 4. MATERIAL Y MÉTODOS MUESTRAS. Para el presente estudio se recolectaron 193 muestras de leche cruda de 17 industrias procesadoras de leche, ubicadas entre la zona de Chillan en la VIII región hasta la zona de Llanquihue en la X región. La toma de muestras se realizó cada 15 días para cada industria, de acuerdo a un calendario preestablecido (Anexo 37), a partir del 1 ero de Junio de 1996, concluyéndose el 29 de Noviembre de Obtención y envío de la muestra. Para la obtención de la muestra se instruyó a cada encargado de la recepción de la leche en las respectivas plantas, de manera tal que las muestras fueran representativas de las leches almacenadas el día del muestreo y tomadas de la forma más aséptica posible para evitar la contaminación externa. Las leches crudas fueron obtenidas desde los estanques o silos para leche que poseen las distintas industrias para almacenar la leche cruda antes que ingrese al pasteurizador. En la recolección se utilizaron 6 botellas estériles de 1 litro para cada planta. Para el envío se utilizó una caja térmica (Coleman) con refrigerantes (freeze-pack) para que la muestra conservara una temperatura baja (4 C aproximadamente), y así evitar la proliferación bacteriana. No se utilizó ningún preservante para no alterar la composición de la muestra para otros análisis. Las muestras de leche se enviaron por distintos medios de transporte desde la industria de origen hasta el Laboratorio de Microbiología del Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos de la Universidad Austral de Chile, Valdivia, donde se realizó el análisis. El tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y la llegada al laboratorio fue de 24 horas aproximadamente Procesamiento de la muestra. La muestra ingresada al laboratorio, era identificada y se procedía a registrar los datos como origen, día del muestreo y botellas enviadas.

18 14 Posteriormente se realizaba el trasvasije del contenido de las botellas hacia un matraz de 5 litros estéril que se agitaba 25 veces, momento en el cual se registraba la temperatura. La operación era realizada en una campana de flujo laminar o cerca de un mechero. El trasvasije aseguraba la adecuada mezcla de la muestra. Del matraz con la muestra homogeneizada se obtenía una alícuota de 250 ml. para los análisis microbiológicos. El resto de leche se utilizaba para otros análisis y contramuestras. La forma de obtención de la muestra y los análisis, se basaron en el Manual de Microbiología de Magariños (1978), que describe la manera de realizar todas las técnicas analíticas, que están acorde tanto con las normas nacionales como internacionales para cada análisis ANALISIS Métodos de análisis. Los métodos de recuento de células somáticas consistieron en: Recuento Microscópico Directo (RMD) y Recuento Celular Electrónico (RCE) mediante el aparato Coulter Counter Para el método de Recuento Microscópico Directo de células somáticas se utilizó el establecido en la Norma Chilena 1746 que es oficial para la clasificación de leche (Chile, Instituto de Normalización, 1979a). El Recuento Celular Electrónico de células somáticas, fue ejecutado mediante el Coulter Counter, basado en lo establecido en la Norma Chilena 1763.c79 oficial para clasificación de leche (Chile, Instituto de Normalización, 1979b). El contador electrónico de partículas fue un Coulter Counter modelo Z BI calibrado para un diámetro de partículas entre 4,5 a 5 micrones Obtención de volúmenes. De la alícuota para microbiología se procedía a obtener los volúmenes para las distintas pruebas, todo realizado en campana de flujo laminar o mechero para evitar la contaminación externa.

19 15 Antes de obtener los volúmenes, se agitaba la alícuota unas 25 veces para su homogeneización, luego se obtenía 10 ml. para la prueba de células somáticas por el método de Recuento Electrónico de Partículas y 0.1 ml. para el método de Recuento Microscópico Directo Resultados Procesamiento. Los datos obtenidos de todos los análisis descritos anteriormente fueron procesados en la base de datos computacional Microsoft Excel versión 5.0 para Windows Análisis estadístico. Los resultados obtenidos fueron procesados estadísticamente en los programas computacionales Statistica versión 4.2 para Windows y Graph Pad Prism versión 2.00 para Windows. Se realizaron análisis de varianza paramétricos (análisis de varianza de una vía) y no paramétricos (Kruskal Wallis) según los resultados de la prueba de normalidad (Smirnov Kolmogorov) y de homogeneidad de varianza (Levene). Para establecer entre quienes existían diferencias significativas, se realizó la prueba de comparación múltiple de Dunn's y la prueba de Tukey, según correspondiera. Además, se efectuaron la prueba de T y la prueba de correlación para los datos obtenidos, comparando los diferentes métodos. Se consideró un nivel de confianza de 5%.

20 16 5. RESULTADOS RECUENTO DE CÉLULAS SOMÁTICAS Recuento de células somáticas por el método Recuento Microscópico Directo. El procesamiento de las 193 muestras de leche cruda analizadas por el método Recuento Microscópico Directo (RMD), marcaron un valor promedio de céls/ml, el que se aprecia en la tabla 1, la cual, a su vez, muestra la desviación estándar y los valores extremos obtenidos mediante el antes señalado método. Tabla 1. Valores mínimo, máximo, promedio y desviación estándar de los recuentos de células somáticas analizados por método Recuento Microscópico Directo (RMD), de 193 muestras de leche cruda de estanque o silos de 17 plantas industriales de la VIII a la X región. Valores obtenidos de anexo 1. Recuento Microscópico Directo RMD (céls/ml) Mínimo Máximo Promedio D. estándar Como se aprecia en la tabla, el total de muestras analizadas presentaron recuentos que variaron entre y céls/ml (Tabla 1), la distribución de todos los recuentos se presenta en los siguientes gráficos (1 y 2), los cuales enmarcan los recuentos en rangos de y céls/ml, respectivamente. La finalidad de agrupar los datos, de acuerdo a intervalos, es para obtener una mejor visión de los recuentos, asi como para tener una referencia de las clasificaciones que se utilizan en el extranjero de los recuentos celulares para el pago por calidad de leche.

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