METODOS DE ANALISIS BIOMEDICOS

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1 METODOS DE ANALISIS BIOMEDICOS 2010 Profesora a cargo: Dra. Viviana Lepek PARTE PRÁCTICA Jefe de T.P.: Dra. Mara Roset Ayudantes: Dra. Ines Marchesini Lic. Lucas Bukata Dr. Juan Mucci Dr. Adrián Mutto Lic. Lucas Bukata Lic. Florencia Iannino Lic. Del Giudice, Mariela

2 T.P. 1: Detección y determinación de distintos tipos del virus del papiloma genital humano (HPV). El virus del papiloma genital humano es un grupo de más de 40 tipos distintos de virus que están asociados con un número de manifestaciones clínicas, enfermedades y cánceres. Los tipos 16 y 18 a menudo son hallados en displasias cervicales y carcinomas. Los tipos 6 y 10 son asociados con condilomas benignos. La detección y tipeo de HPV genital en tejidos normales y enfermos es importante para discernir o definir el rol de estos virus en cánceres y otras anormalidades. El método de detección y determinación de tipo basado en PCR es muy sensible y sirve para detectar un amplio rango de HPVs genitales. PCR: Por comparación de la secuencia de ADN completa de los distintos tipos de HPV (6,11,16,18, 33, etc) se definieron regiones de homología de 20 a 25 pb comunes a todos (oligos consenso). Con estos oligos se realiza una primera reacción de PCR en la que queda amplificado un fragmento a partir de cualquier tipo de HPV que haya en la muestra. Si bien cada oligo es complementario a una determinada posición del ADN de determinado tipo, el tamaño de los productos no difiere significativamente como para distinguirlos en un gel de agarosa. Generalmente se trabaja con una mezcla de oligos degenerados. Para determinar el tipo de HPV correspondiente a la muestra se utilizarán 3 métodos distintos: i) Corte con enzimas de restricción del producto de la PCR y comparación del pattern de bandas obtenido. ii) Nueva reacción de PCR hecha sobre el producto de la primer PCR, utilizando un oligo genérico para la hebra negativa (MY09) y un oligo específico de tipo para la hebra positiva (MY14 o WD74). iii) Análisis de polimorfismo de confórmeros de cadena simple (SSCP). Como controles se utilizará un plásmido que contiene un fragmento de ADN de HPV tipo 16 y otro que contiene un fragmento de ADN de HPV tipo 18. Luego se determinará que tipo de HPV está integrado en el cromosoma de una línea celular utilizada comúnmente

3 en cultivo de células. Desarrollo: a) Cuantificar el ADN plasmídico. b) Extraer el ADN de las células en cultivo. i) Centrifugar células en cultivo (unas 5x 106 células) a 1500 rpm por 10. Lavar con PBS. ii) Resuspender el pellet en 7 ml de buffer de extracción. Buffer de extracción: 10 mm Tris HCl ph M EDTA ph 8 0.5% SDS Agregar 20 µg/ml de RNAsa (DNAsa free) (stock 20 mg/ml). Incubar 1 hora a 37º C. iii) Agregar Proteínasa K 100 µg/ml final (stock 20 mg/ml) e incubar 3 hs a 50º C (u ON a 37º C). i v) Extraer con Fenol Cloroformo 10 agitando suavemente. Centrifugar a 5000 g 15 a temperatura ambiente (2 veces). v) Precipitar la fase acuosa agregando 0.2 vol de 10 M AcONH4 o 0.3 M de AcONa y 2 volumenes de EtOH. vi) Centifugar 25 minutos a rpm. Lavar el pellet con EtOH 70%. vii) Secar a temperatura ambiente. viii) Resuspender en µl de TE (10 mm Tris ph8 y 1 mm EDTA). ix) Cuantificar. c) Reacción de PCR: 100 pg de ADN plasmídico o 100 ng de ADN de la línea celular (entre 1 10 µl) 5 µl de buffer de Taq pol 10x 1 µl de cada oligo genérico (MY09 y MY11) (stock 50 µm) 1 µl de dntp (stock 10 mm)

4 4 µl de Cl 2 Mg (stock 50 mm) 0.5 µl de Taq polimerasa (2.5 unidades) H2O esteril para llevar a 50 µl. Además del control sin ADN se hará un control con una línea celular que no tiene virus de papiloma humano integrado al ADN. Como control interno para descartar la presencia de inhibidores en la reacción y para verificar que el ADN no esta dañado se deben agregar a la mezcla de reacción un par de oligos que complementen con otra región del ADN y que den un producto de distinto tamaño al esperado para el HPV (la décima parte de la cantidad de oligo usado para HPV) (PCR multiplex). Como en nuestro caso no lo hacemos sobre muestras clínicas obviamos este control. Ciclos: Etapa 1: 95º C (2 min) Etapa 2: 95º C (35 seg) DESNATURALIZACION 57º C (45 seg) ANNEALING 35 ciclos 72º C (1 min) EXTENSION Etapa 3: 72º C (2 min) 4º C Para el análisis de los productos de reacción se utilizará un gel de agarosa 1.8%. Se siembran 20 microlitros del producto de PCR. d) Corte con enzimas de restricción: Sobre una alícuota del producto de PCR que se pueda visualizar en el gel de agarosa se hará la reacción con la enzima de restricción correspondiente y su buffer. Volumen final de la mezcla de incubación 20 µl. Tiempo de incubación 2 hs a 37º C. Los productos de la incubación se someterán a corrida en gel de agarosa al 1.5%. e) SSCP: se analizará el polimorfismo de confórmeros de simple cadena utilizando los productos de la PCR realizada con oligos genéricos. El DNA doble cadena se

5 desnaturaliza por temperatura y se analiza la movilidad de los confórmeros de simple cadena en un gel de poliacrilamida 5% en condiciones no desnaturalizantes. Preparación de las muestras: se toman 3 microlitros del producto de PCR y se desnaturaliza incubando 3 minutos a 100º C y pasando inmediatamente a hielo. Gel de poliacrilamida 5%: TBE 5X Acri Bis. 29:1 H2O TEMED APS 10% 1,6 ml 2,6 ml 11,6 ml 24 microlitros 96 microlitros Condiciones de electroforesis: 10 ma durante 2 hs. en buffer TBE 0,5X. Tinción: 20% TCA 5 min. 8,3% Glutaraldehído 20 min. H2O 8 min. H2O 8 min. 0,5% AgNO3 16 min. H2O 1 min. H2O Revelador Revelador 5% AcOH 5% AcOH/5% Glicerol 1 min 1 min 4 min 8 min. 12min. Revelador: 40 ml 12,5% Na2CO3, 105 microlitros de formaldehído, 160 ml H2O. f) Heminested PCR: A 1 µl del producto de la primer PCR se le vuelve a someter a una segunda PCR en las mismas condiciones que la primera pero utilizando los oligos indicados en la introducción. El producto de la PCR se somete a un gel de

6 poliacrilamida 1.5%. OLIGOS MY09 CGTCCMARRGGAWACTGATC genérico (antisentido) MY11 GCMCAGGGWCATAAYAATGG genérico (sentido) Código degenerado: M = A ó C; R = A ó G; W = A ó T; Y = C ó T. MY14 CATACACCTCCAGCACCTAA específico de tipo 16 (sentido) WD74 GGATGCTGCACCGGCTGA específico de tipo 18 (sentido)

7 T.P. 2: PCR en Tiempo Real Objetivo: Determinar la cantidad inicial de un fragmento específico de DNA en una muestra. Metodología: PCR en Tiempo Real utilizando el fluoróforo SYBRGreen que al unirse a la doble cadena de DNA permite monitorear la acumulación de producto final ciclo por ciclo. De este modo es posible detectar la curva de amplificación de la reacción en su etapa linear, donde la cantidad amplificada es proporcional a la cantidad inicial. En este práctico se determinarán los valores de Ct (ciclos umbral) para una curva estándar con cantidades conocidas de DNA. De esta manera se calculará la cantidad de DNA inicial de la muestra desconocida por interpolación de la curva. Protocolo: Reacción de PCR: Volumen final 25 ul, volumen de templado 4 ul Reactivo Concentración final Concentración inicial Agua Buffer 1 X 10 X Cl2Mg 2,5 mm 25mM dntps 300 um 10 mm Primers (forward y 0.2 um 10 um reverse) Taq Polimerasa 1,25 U/reacción 5 U/ul Volumen inicial Volumen para la mix Templados: 6 8.Curva estándar: Diluciones seriadas desde 1/10 hasta 1/10 (curva de 3 puntos).muestra de concentración desconocida.control negativo (agua) Parámetros del termociclador: 94ºC 3 minutos 94ºC 15 segundos 65ºC 45 segundos 40 veces

8 72ºC 45 segundos Datos importantes: Concentración del plásmido estándar sin diluir: 500ng/ul. Tamaño del plásmido: 4700 bp. PM 1bp: 682 Preguntas: 1 Cuál es el Nº de copias inicial de cada punto de la curva estándar? Cuál sería la utilidad de expresar los valores de la curva estándar en Nº de copias en vez de gramos? T.P. 3: Apoptosis La muerte celular sucede continuamente en todos los tejidos por dos procesos muy diferentes, necrosis y apoptosis. La necrosis es un fenómeno pobremente regulado, inflamatorio, patológico y involucra levemente a las membranas celulares y mitocondriales. Involucra una rápida deterioración bioenergética, aumento del volumen celular y finalmente lisis. La necrosis es fácilmente detectable in vivo y tiende a estar asociada a agresiones intensas del tejido, como pueden ser altas dosis de sustancias tóxicas. Por otro lado, la apoptosis es en respuesta a agresiones crónicas menos intensas, como bajas dosis de sustancias tóxicas. Por otro lado, la apoptosis es un proceso fisiológico que esta implicado en el desarrollo desde unicelulares hasta vertebrados. La apoptosis es un fenómeno altamente regulado, no inflamatorio, dependiente de ATP, hay fragmentación nuclear, degradación del DNA, condensación de cromatina y bleebing de la membrana plasmática. Finalmente, las organelas y la cromatina son compartimentalizadas el los llamados cuerpos apoptóticos, que son fagocitados por las células vecinas. La apoptosis o muerte celular programada fue descripta por primera vez por Carl Vogt en 1842 y re descubierta a mediados del siglo pasado. En 1972 Kerr, Wyllie y Curie le asignaron el nombre de apoptosis y se han asociado varias enfermedades a la falta o al exceso de apoptosis. Una serie de enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, Parkinson, Huntington, esclerosis múltiple involucran un aumento en la apoptosis y los

9 tumores son un claro ejemplo de lo que puede ocurrir cuando hay un déficit. Por lo cual su diagnóstico es muy importante para la detección y el progreso de las distintas enfermedades. El objetivo de este trabajo práctico es familiarizarse con las técnicas de rutina utilizadas para la detección de apoptosis. Para asegurar que una célula está en apoptosis es necesario la validación por dos técnicas distintas. Tinción histológica con H&E. Con ella se pueden observar las características morfológicas de la apoptosis como son la condensación nuclear y la formación de cuerpos apoptóticos. Tinción con intercalantes fluorescentes de DNA: Se usa ioduro de propidio, DAPI, 7 animoactinomicina D, naranja de acridina, entre otros. Se incuban las células permeabilizadas con estas drogas y los resultados se pueden analizar por microscopía o por citometría de flujo. Ladder de DNA. La técnica se basa en la visualización directa de la fragmentación nucleosomal ocurrida durante la apoptosis. Para esto se lisan las células, se precipita el DNA citoplasmático y se corre en un gel de agarosa pudiéndose observar bandas en forma de escalera con diferencias de aproximadamente 200 pares de bases. Ensayo de TUNEL. Al igual que el ladder, la técnica se basa en la fragmentación nucleosomal. Con esta fragmentación se generan numerosos extremos 3, y sobre ellos una enzima, la transferasa terminal, incorpora una gran cantidad de deoxiuridina marcada (biotina, fluoresceína, etc). Entonces la célula apoptótica queda marcada con respecto a la célula viable. Esta técnica tiene mayor sensibilidad que la de ladder y es posible realizarlo tanto en células aisladas como en cortes histológicos. ELISA: Se detecta nucleosomas con un anticuerpo de captura para histonas y posteriormente se revela con un anticuerpo anti DNA acoplado a peroxidasa. Anexin V. Uno de los primeros eventos en la apoptosis es la exposición de fosfatidilserina en la membrana externa. Este lípido es un constituyente de la membrana interna de la célula y es algunos casos se encuentra en la externa a partir del fenómeno flip flop. Estos lípidos son devueltos a la membrana interna con gasto de energía. Durante el proceso apoptótico, se pierde la función de la mitocondria y por lo tanto la concentración de ATP

10 disminuye. Por eso, se acumula más fosfatidil serina en la membrana externa en las células apoptóticas. La anexin V es una proteína capaz de unirse a la fosfatidil serina. Entonces usando esta proteína marcada (fluorescinada, por ej) podemos detectar células apoptóticas. Esta técnica nos permite detectar apoptosis temprana. Protocolo: Una de las características sobresalientes de la apoptosis es la ruptura del DNA en fragmentos múltiplos de entre pares de bases. 1 Incubar células con los distintos inductores de apoptosis durante 18 hrs. 9 5 Sin estímulo anti Fas 2,5 5 µg/ml Dexometasona M 6 2 Cosechar las células (1 2 X 10 ) con sumo cuidado, centrifugar a 500 x g por 5 minutos, el transvasar el sobrenadante a otro tubo y agregar 500µl de buffer de lisis frío a las células. 3 Dejar 2 minutos en hielo y centrifugar a x g durante 20 minutos. Descartar el pellet. 4 Al sobrenadante de la lisis y de las células (medio de cultivo) agregarle 100 µl de NaCl 5M, agitar y después agregar 500 µl de isopropanol. Dejar al menos 48 horas a 20 C. 5 Centrifugar a x g durante 20 minutos y resuspender el pellet en TE + 0.5% SDS + 20 µg/ml proteinasa K. 6 Correr un gel agarosa al 2% y observar. Buffer de lisis: 10 mm Tris ClH ph=7,6, 1 mm EDTA,0,2 % Triton X 100 TE: 10 mm Tris ClH ph=7,6, 1 mm EDTA

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