PRÁCTICA No. 7 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGUA RESIDUAL POR EL MÉTODO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

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1 PRÁCTICA No. 7 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGUA RESIDUAL POR EL MÉTODO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) I. OBJETIVO Determinar la presencia de coliformes totales y fecales en el efluente de la PTAR de la UPEMOR por el método del Número Más Probable, utilizando la técnica de tubos de fermentación múltiple. II. INTRODUCCION Debido a que las aguas residuales son de composición variada provenientes de descargas de usos municipales, industriales, comerciales, de servicios, agrícolas, pecuarios, domésticos, incluyendo fraccionamientos y en general de cualquier uso, así como la mezcla de ellas, contienen diferentes tipos de microorganismos contaminantes y las diferentes concentraciones, dependiendo de su fuente. La variada población de microorganismos en esta agua, proviene del suelo y de origen intestinal, incluyen aerobios y anaerobios estrictos y facultativos así como también numerosos virus como: Poliovirus y virus de la hepatitis. Igualmente pueden contener formas parasitarias variables como quistes de Protozoarios y huevecillos de Helmintos (Metazoarios). Asimismo, existe en nuestro país el grave problema de contaminación de ríos, lagos acuíferos y costas debido a que estos son utilizados como depósito de todos los desechos generados por las actividades humanas. Estos microorganismos pueden sobrevivir al tratamiento, por lo que su reúso p.ej., en riego agrícola, actividades recreativas: Aguas de piscinas, baños de hidromasaje, aguas potables naturales, actividades piscícolas y aguas marinas superficiales (playas), representan un riesgo potencial a la salud pública. La presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante en la determinación de la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una

2 variedad de microorganismos y formas de resistencia de los mismos, involucrando organismos patógenos, los cuales son un riesgo para la salud pública al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de agua para determinar la presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan normalmente en el intestino humano y de otros animales de sangre caliente, da una indicación, pues dada la limitada capacidad de algunos miembros del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus números también pueden emplearse para estimar el grado de contaminación fecal. Son Organismos coliformes aquellos capaces de crecimiento aeróbico ya sea 35 ó 37 ± 1 C en un medio de cultivo líquido lactosado con producción de acido y gas dentro de un periodo de 48 h. El método de la NPM es un método robusto por lo que puede aplicarse en cualquier tipo de agua, aún aquellos que contienen gran cantidad de materia orgánica. Para la determinación del NMP de Coliformes Totales y Fecales en este tipo de aguas, es necesario proceder a preparar diluciones decimales de la muestra, debido a que se espera que la concentración de coliformes sea superior en éstas que en un agua potable. El número de diluciones varía mucho, dependiendo del origen de la muestra a tratar. Por lo demás, para su análisis de procede en la misma forma que para una muestra de agua potable. III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS Muestra de agua de del efluente de la PTAR de la UPEMOR. Mechero Bunsen. Cerillos ó encendedor. 9 tubos de 18 x 150 mm conteniendo 9 ml de agua de dilución estéril. 9 Pipetas de 1 ml estériles. 15 tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo caldo lactosado estéril de concentración sencilla. 15 tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante estéril. 10 tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo caldo E.C. estéril. 2 Cajas de Petri conteniendo Agar Endo estéril. 5 Tubos de 18 x 150 mm conteniendo agar nutritivo inclinado estéril. Agitador de tubos Vortex. Gradillas para tubos de 18 x 150 y de 13 x 100 mm.

3 Asa Bacteriológica. Incubadora a 35 C. Baño Incubador para Coliformes fecales a una temperatura constante de 44 C (0.5 C). IV. METODOLOGÍA PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS Y SOLUCIONES. MEDIOS DE AISLAMIENTO: -Caldo lauril triptosa (CLT). Triptosa 40.0g Lactosa 10.0g Cloruro de sodio (NaCl) 10.0g Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 5.5g Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) 5.5g Lauril sulfato de sodio 0.2g Agua para llevar a 1000 cm 3 Añadir la triptosa y el cloruro de sodio al agua, calentar para disolver y añadir el lauril sulfato de sodio. Disolver el resto de los componentes por separado y agregarlos a los anteriores mezclando suavemente para evitar la formación de espuma. -Caldo bilis lactosa verde brillante: Peptona 10.0g Lactosa 10.0g Bilis de buey (deshidratada) 20.0g Verde brillante (1% m/m en solución acuosa) 13 cm 3

4 Agua para llevar a 1000 cm 3 -Medio EC: Triptosa o tripticasa 20.0g Lactosa 5.0g Mezcla de sales biliares 1.5g Fosfato dibásico de potasio (K 2 HPO 4 ) 4.0g Fosfato monobásico de potasio (KH 2 PO 4 ) 1.5g Cloruro de sodio (NaCl) 5.0g Agua para llevar a 1000 cm 3 Distribuir el medio de simple concentración en volúmenes indicados en cada tubo que debe contener un tubo de fermentación invertido (Durham). Colocar en autoclave y esterilizar. Disolver los componentes por separado y agregarles agitando suavemente y esterilice. Nota: Como medio confirmativo para coliformes totales, el más generalizado es el caldo de bilis lactosa verde brillante (BLVB). Para confirmar la presencia de coliformes fecales se utilizan tanto el BLVB como el caldo EC. V. TECNICA PRUEBA PRESUNTIVA Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de asepsia. 1. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces para lograr una distribución uniforme de los microorganismos. 2. Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado preparar diluciones. 3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estéril tomar una alícuota de 1 ml de la muestra original y llevarlo a uno de los tubos conteniendo 9 ml de

5 agua de dilución estéril, obteniendo de esta manera una dilución de (Fig. 7.1) 4. Agitar el tubo de la dilución 10-1 y con otra pipeta estéril tomar una alícuota de 1 ml y llevarlo a otro tubo con 9 ml de agua de dilución estéril para obtener una dilución de Proceder de la misma manera hasta obtener una dilución de 10-3 o hasta donde sea necesario. 6. Inocular asépticamente con 1 ml de muestra por triplicado, tubos de fermentación conteniendo caldo lactosado o caldo lauril triptosa, a partir de las últimas 3 diluciones y conservar todas las anteriores en refrigeración por si se requiere su utilización posterior. 7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 C durante 24horas. 8. Después de 24 horas de incubación efectuar una primera lectura para observar si hay tubos positivos, es decir, con producción de ácido, si el medio contiene un indicador de ph, turbidez y producción de gas en el interior de la campana Durham. 9. Al hacer esta verificación es importante asegurarse que la producción de gas sea resultado de la fermentación de la lactosa, en cuyo caso se observará turbidez en el medio de cultivo, y no confundir con burbujas de aire. 10..Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las campanas Durham antes de proceder a la inoculación y desechar aquellos tubos cuyas campanas contengan burbujas de aire ó de alguna manera eliminar éstas y así poder utilizarlos. 11. De los tubos que en la primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales. 12. En caso de no apreciarse crecimiento en el resto de los tubos, continuarán en incubación 24 horas más. 13. Después de 48 horas (± 2h) a partir de la inoculación, se hace la lectura final. 14. Si pasadas 48 h tampoco se aprecia crecimiento ni producción de gas, los tubos se toman como negativos. INTERPRETACIÓN: Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada. Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarán convenientemente y se procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para Coliformes Totales y Fecales.

6 PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES: 1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB). 2. Incubar durante 48 ± 3 h a 35 ± 0.5 C. 3. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de gas. INTERPRETACIÓN: Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP. Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: Se consideran NEGATIVOS, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo del NMP Si todos los tubos dan negativos ó todos dan positivos, con base en los grados de dilución analizados, considerar la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución menores (mayores volúmenes de muestra) ó mayores (menores volúmenes de muestra), respectivamente. PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES: 1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo E.C. (Escherichia coli). 2. Incubar durante 24 horas a 44.5 ± 0.2 C. y después de este período, observar presencia de turbidez y gas. INTERPRETACIÓN: Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos positivos y establecer el código para posteriormente hacer el cálculo del NMP, (Figs. 7.2 y 7.3) Si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: Se consideran negativos, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo del NMP. Si todos los tubos dan negativos ó todos dan positivos, con base en los grados de dilución analizados, considerar la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución menores (mayores volúmenes de muestra) ó mayores (menores volúmenes de muestra), respectivamente.

7 VI. CÁLCULOS De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes Totales y Fecales, establecer los códigos correspondientes para calcular por referencia en las tablas estadísticas (Tablas 7.1) el NMP de Coliformes Totales y Fecales en 100 ml de agua. En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada, emplear para los cálculos la siguiente ecuación: VII. ELABORACIÓN Y PRESENTACIÓN DE RESULTADOS. Los resultados se elaboran de la siguiente manera: Si se han realizado diluciones, se ha de obtener una serie final con valor cero. A continuación se establece el triplete de valores correspondiente a las tres series anteriores a la del valor cero que podrá ser leída en la tabla del NMP. Para efectos de expresar el valor obtenido basándose en 100 ml de muestra habrá de dividirse el resultado de la tabla por el volumen real de muestra inoculada en cada tubo de la serie central de cada triplete escogido. En general se tiene: Los resultados obtenidos se expresarán de la siguiente manera: NMP DE COLIFORMES TOTALES: / 100 ml NMP DE COLIFORMES FECALES: / 100 ml

8 VIII. CUESTIONARIO 1. Cuáles son los límites máximos permisibles de Coliformes. Fecales para las descargas de aguas residuales vertidas a aguas y bienes nacionales así como a suelo? 2. Mencionar 5 enfermedades transmitidas por el agua, indicando el agente etiológico correspondiente. 3. Además de representar un riesgo para la salud pública el vertido de aguas residuales tratadas inadecuadamente o sin tratar a los depósitos naturales, Qué otros efectos indeseables puede representar? 4. Cuáles son los límites máximos permisibles de Coliformes Fecales en aguas residuales tratadas que se reúsan en servicios al público? Indicar NOM. Figura 7.1 Preparación de diluciones decimales Figura 7.2 Código de NMP, 5,2,1

9 Figura 3. Ejemplo de tabla de resultados de coliformes totales y fecales

10 Tabla 7.1 Tabla para el cálculo del NMP IX. BIBLIOGRAFÍA Secretaria de Comercio y Fomento industrial NNX-AA Calidad del agua determinación del numero más probable (NMP) de coliformes totales, coliformes fecales (termotolerantes) y Escherichia Coli presuntiva. 21 p.