Universidad de Colima

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1 Universidad de Colima FACULTAD DE MEDICINA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS "ESTABILIDAD DEL ANTIGENO PROSTATICO ESPECIFICO LIBRE Y TOTAL, Y SUS EFECTOS EN LOS RESULTADOS DE LABORATORIO." TESIS Que para obtener el grado de: Maestría en Ciencias Médicas Presenta El Q.F.B. Francisco Vargas Salas DR. RAFAEL COLL CARDENAS C.U.I.B., U. DE C. Asesores 0

2 DR. C. MOISES HERNANDEZ SUAREZ CIENCIAS BASICAS, U. DE C. Q.B.P. FRANCISCO VARGAS GOMEZ DIRECTOR L.Q.V. Colima, Col. Julio del

3 AGRADECIMIENTOS A Dios, por haberme permitido concluir un ciclo más de vida. A mis padres, Francisco y Margarita, que con gran esfuerzo y dedicación hicieron de mi un hombre de bien, siempre los mantendré en mente con un gran cariño. A mi esposa, Gabriela A., que siempre he contado con su apoyo y, he compartido bellas experiencias y responsabilidades. A mi hija, Gabriela Margarita, por su gran cariño, y su alegría que siempre me ha inspirado. A los doctores J. Rafael Coll y Carlos Moisés Hernández por su tiempo, asesoría, dedicación y apoyo para la culminación de esta tesis. Al Q.B.P. Francisco Vargas Gómez por transmitirme sus conocimientos y experiencias, que sin duda alguna, han influído para forjarme. A los doctores Luis R. Beas y Sergio Cevallos G. por su orientación y apoyo para realizar el presente trabajo. A todos aquellas personas que de alguna manera intervinieron en la realización de este trabajo. 0

4 INDICE RESUMEN...3 INTRODUCCION...5 ANTECEDENTES CIENTIFICOS...7 I.- Historia...7 II.- El Antígeno Prostático...8 III.- Síntesis del PSA...13 IV.- Formas Moleculares...13 V.- Relación PSA y Edad...15 VI.- Característica Enzimática y Estructural...18 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA...23 HIPÓTESIS...24 OBJETIVOS...25 METODOLOGIA...26 TECNICA DE MUESTREO...27 CONTROL DE CALIDAD INTERNO

5 ANALISIS DE RESULTADOS...42 CONCLUSIONES Y DISCUSIONES...53 ANEXOS...56 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

6 RESUMEN Propósito: El antígeno prostático específico (PSA-T), el antígeno prostático fracción Libre (PSA-L) y su cociente, se han utilizado para el diagnóstico de cáncer de próstata. Si las muestras no son conservadas con su Buffer adecuado, ó conservadas a -20 C sus concentraciones in vitro se ven modificadas con el paso del tiempo; dando como resultados diagnósticos erróneos. En la presente investigación, se estudió la forma en que el PSA-T y PSA-L y su cociente se alteran con el paso del tiempo bajo condiciones de temperatura de cuarto, determinando cuales son los umbrales de riesgo de las concentraciones del antígeno prostático específico.se estudió la estabilidad in vitro de PSA-L, PSA-T y su cociente en suero de pacientes con un PSA-T de 2 ng/ml a 30 ng/ml con cáncer prostático ó hiperplasia prostática benigna (HPB), y en hombres de edad mayor sin enfermedad prostática. Materiales y Métodos: Los efectos del almacenaje a temperatura ambiente in vitro de PSA-T y su cociente, fueron analizados en el suero de 83 pacientes. Todos tuvieron PSA-T mayor de 2 ng/ml y menores de 30 ng/ml PSA-T y PSA-L fueron medidos por inmunoensayos enzimáticos comerciales. Los resultados fueron analizados mediante regresión lineal. Resultados: Se encontró una diferencia mínima entre las lecturas. a las 24 horas. A las 48 horas encontramos una diferencia de 1.05 ng/ml. El valor no confiable para las mediciones es a partir de las 72 horas, que es de 1.96 ng/ml, mientras que a las 168 horas se encontró la mayor probabilidad de obtener falsos positivos. Conclusiones: Los rangos que se obtuvieron falsos positivos de acuerdo al tiempo entre su extracción venosa y el tiempo de su inmunoanálisis son: 1) A las 24 horas son de ng/ml a ng/ml. 2) A las 48 horas son de ng/ml a 9.83 ng/ml. 3) A las 72 horas son de ng/ml a 8.91 ng/ml. 4) A las 96 horas son de ng/ml a 7.69 ng/ml. 5) A las 120 horas son de ng/ml a 6.16 ng/ml. 6) A las 144 horas son de ng/ml a 4.32 ng/ml. 7) A las 168 horas son de ng/ml a 2.18 ng/ml. 3

7 ABSTRACT Purpose: The prostate-specific antigen (PSA) and the fraction Free prostate-specific antigen (PSA-f) and its ratio have been used to diagnose prostate cancer. If the samples are not conserved with their proper buffer or if the in vitro concentrations are conserved at -20 C, their results become time-modified, causing diagnostic errors. In the present work, the way in which the PSA and PSA-f and its ratio are altered by the passage of time under room temperature conditions is studied, determining the risk thresholds for prostate- specific antigen concentrations. The stability in vitro of PSA-f and PSA and its ratio was studied in the serum of patients with prostate cancer or benign prostatic hyperplasia (BPH) with a PSA from 2 ng/ml to 30 ng/ml, and in elderly men with no prostate disease. Materials and Methods: The effects of storage at room temperature in vitro of PSA and its ratio were analyzed from the serum of 83 patients. All patients had a PSA greater than 2 ng/ml and less than 30 ng/ml. PSA and PSA-f were measured by commercial enzymatic immunoassays. The results were analyzed by linear regression. Results: A minimal difference among readings was found at a 24-hour time period. At 48 hours a difference of 1.05 ng/ml was found. The unreliable value of 1.96 ng/ml for measurings was found starting from a 72-hour time period, while the greatest probability of false positives was found at 168 hours. Conclusions: The ranges in which false positives were obtained, in accordance with the time lapse from vein extraction to immune analysis are: 1) from ng/ml to at 24 hours 2) from ng/ml to 9.83 ng/ml at 48 hours 3) from ng/ml to 8.91 ng/ml at 72 hours 4) from ng/ml to 7.69 ng/ml at 96 hours 5) from ng/ml to 6.16 ng/ml at 120 hours 6) from ng/ml to 4.32 ng/ml at 144 hours and 7) from ng/ml to 2.18 ng/ml at 168 hours. 4

8 INTRODUCCION: El cáncer de próstata ha sido la enfermedad que mayor concierne al hombre y a las organizaciones de salud a nivel mundial. En los últimos 12 años, la incidencia de cáncer de Próstata se ha incrementado en un 50% y las muertes por esta enfermedad se han elevado en un 40%. Para darnos una idea, en los Estados Unidos, aproximadamente 317,000 nuevos casos y más de 40,000 muertes se han reportado en el año de Esto hace que el cáncer de próstata sea la enfermedad de malignidad más frecuentemente detectada en hombres y es la segunda causa de muerte debida a cáncer en hombres adultos. Es bien conocido, que en años recientes, se han hecho esfuerzos para reducir la mortalidad, lo que ha obligado a una detección temprana y a una terapia definitiva, ya que no hay un tratamiento sistemático para el cáncer de próstata. La mayoría de estos casos continúan siendo diagnosticados después de que el tumor se ha diseminado más allá de la glándula prostática disminuyendo en forma considerable las posibilidades de curación. Sabemos, que la mayoría de las alternativas terapéuticas disponibles actualmente, aún tienen una alta morbilidad y la posibilidad de curación en estadios avanzados es algo imposible. Durante el último decenio, la concentración sérica de antígeno prostático específico (PSA) se ha convertido en una herramienta esencial para el diagnóstico del cáncer prostático precoz y curable. Su utilidad clínica se ha incrementado todavía más por la utilización de parámetros como los valores de referencia específicos para cada edad que aumentan la sensibilidad para la detección del adenocarcinoma prostático en hombres jóvenes, y el porcentaje de PSA libre que permite una mayor especificidad para el cáncer de próstata cuando el nivel sérico de PSA sólo está ligeramente elevado. Los cambios que se han producido recientemente en la práctica de la medicina, han obligado a los médicos no sólo a proporcionar una asistencia de elevada calidad sino también 5

9 a considerar los costos de tal asistencia. En pocas áreas de la medicina existe mayor controversia a este respecto que en los que se refiere a los pacientes con cáncer prostático. Se ha demostrado que la fracción no compleja de PSA-L es mayor en pacientes con Hiperplasia Prostática Benigna que en pacientes con cáncer de próstata ; y que el uso de la relación de PSA-L y PSA-T podría cambiar el diagnóstico. En reportes de los últimos años, se ha observado que la molécula de PSA in vitro tiene una degradación natural a 4 C por un espacio de 7 días, por lo que su naturaleza misma; lo que podría resultar en diagnósticos erróneos en el laboratorio. Como sabemos, las muestras que no se van a procesar se deben de congelar a -20 C dentro de las tres horas de su separación ó en su defecto ajustar el ph del suero con un Buffer, con 25 microl Con una concentración de 2.5 mol/l Con buffer de acetato de sodio para obtener valores en suero de p H de 5.5 a 5.7 (69). En nuestra localidad no se acidifica el suero en ningún laboratorio. 6

10 ANTECEDENTES CIENTIFICOS: I.- HISTORIA La primera descripción anatómica de la próstata de la cual se tiene conocimiento se remonta al siglo III A. C. atribuída a Herófilo, médico nacido en el año 300 A. C. El cual vivió en Alejandría. Ha sido llamado el padre de la anatomía por ser de los iniciadores de las disecciones humanas. Describió a la glándula prostática como prostatae glandulosae y prostatae cirsoides. De acuerdo a la descripción inicialmente realizada se considera que pudo haber confundido los ductos deferentes y las vesículas seminales con la próstata bífida observada en diversas especies animales. Galeno quien vivió en Roma del año 131 al 210 D. C. describe la presencia de un tejido glandular de tamaño variable, el cual se encontraba en la base de la uretra, de aspecto esponjoso y que tenia pequeños conductos hacia la uretra, la cual no se encontraba en las mujeres y la relacionó con dificultad para el vaciamiento vesical, sentando las bases de la fisiopatolo gía de la obstrucción urinaria secundaria a crecimiento prostático. El término de hiperplásia prostática benigna de uso común por mucho tiempo es incorrecto, ya que la hiperplásia por sí sola define un padecimiento benigno y hemos propuesto el incluir aquellos pacientes con síntomas relacionados con la próstata y dificultad para el vaciamiento vesical, como hiperplasia prostática obstructiva (HPO). Aproximadamente a los 40 años, en la glándula prostática se inicia un crecimiento singular que constituye lo que conocemos con el nombre de hiperplasia. Hay tres aspectos de la hiperplasia prostática que van a ser especialmente analizados a continuación: su génesis y su desarrollo morfológico, los factores que inducen y mantienen este proceso de Hiperplasia prostática, la relación existente entre la Hiperplasia Prostática y el llamado Síndrome Clínico del Prostatismo. 7

11 Sin lugar a duda la etiología de la Hiperplasia Prostática Obstructiva (HPO) es multifactorial, es el resultado del crecimiento sin control de varios elementos celulares de glándula prostática. Para que éste fenómeno ocurra, actualmente se reconocen dos factores, uno la edad y en segundo lugar la presencia de andrógenos. La edad se ha considerado como un factor de riesgo para el desarrollo de la HP en el hombre. Paradójicamente se desarrolla cuando la función testicular se encuentra declinando. La enfermedad rara vez se produce en hombres con edad inferior a los 40 años, ni tampoco en varones castrados antes de ésa edad y el proceso a veces regresa si se practica una orquiectomía. Por otro lado, los estudios experimentales han conseguido evidencia suficiente para afirmar la relación entre hormonas y patogénesis de la HP. No obstante, se sospecha que puede haber otros factores involucrados en ésta proceso. (44). La Hiperplasia Prostática es la neoplasia benigna más frecuente en el hombre. En estudios de autopsia la frecuencia a los 40 años de edad es de un 25%, llegando a un 100% a los 80 años. La enfermedad sintomática se presenta generalmente después de los 50 años, los cambios histológicos tempranos, relacionados a la patogénesis de la HP, se observan como focos microscópicos de hiperplasia y se pueden reconocer entre los 25 y 30 años, muy poco tiempo después de que la glándula ha llegado a su tamaño. La hiperplásia prostática obstructiva es una causa significativa de deterioro en la calidad de vida de los hombres mayores y además tiene asociada morbilidades significativas. Según datos de la INEGI, en México el 55% de la población con hiperplásia prostática obstructiva es mayor de 64 años y el 30% tiene entre 55 y 64 años, lo que equivale en nuestra población a 8% del total, con una esperanza de vida de 70 años [44]. II.- EL ANTIGENO PROSTATICO. El Antígeno Prostático Específico (PSA) es el marcador tumoral más importante de la década de los 90 s. Podríamos mencionar que durante los diez últimos años, se han descrito más de 2,000 artículos científicos en el ámbito mundial acerca de la glucoproteína que es sintetizada principalmente por las células epiteliales de la glándula prostática. Es bien 8

12 conocido que la determinación de la fosfatasa ácida fracción prostática como marcador tumoral, ha sido ampliamente sustituida por la determinación del PSA, siendo actualmente el marcador tumoral ideal. Teniendo en cuenta que el Antígeno Prostático Específico (PSA), no es realmente específico para el cáncer de próstata y que el cáncer de próstata afecta a los pacientes a una edad en que la prevalencia de Hiperplasia Prostática Benigna (H.P.B.) es elevada; se han desarrollado e investigado en el ámbito mundial varios parámetros, que en su conjunto han servido para mejorar la sensibilidad y especificidad del PSA, entre los que podemos mencionar, la velocidad del PSA ( modificación del nivel sérico del PSA con el tiempo), los valores de referencia específicas para la edad respecto al nivel sérico del PSA, el PSA Total, PSA fracción Libre (PSA- L) y su cociente. La conjunción de todos éstos parámetros junto con la indiscutible experiencia clínica del médico especialista, permite diagnosticar en forma precoz un cáncer de próstata en aquéllos que presentan una Hiperplasia Prostática Benigna. Las pruebas con PSA han incrementado de manera significativa la tasa de detección de cáncer prostático, y también que la mayor parte de los casos de cáncer que se detectan hoy en día son tumores confinados al órgano y curables. Por tanto, con el paso del tiempo sería de esperar que disminuyera la tasa de mortalidad por cáncer prostático. El valor de PSA se puede combinar con la puntuación de Gleason y con el estadio clínico local del cáncer prostático para predecir fiablemente el estado de los ganglios linfáticos pélvicos (1), debido a ello, se puede evitar la linfadenectomía pélvica bilateral para estadificación en hasta un 60% de los pacientes con cáncer prostático en estadio T1a hasta T2b. Cuando queremos seguir a los pacientes con cáncer prostático tras un tratamiento definitivo, no existe una herramienta mejor que el PSA. Es extraordinariamente sensible para detectar la enfermedad persistente/recurrente tras la prostatectomía radical, la radioterapia, la ablación crioquirúrgica de la próstata, el tratamiento de privación androgénica y la actitud expectante. Un nivel detectable o en aumento de PSA tras el tratamiento aparece meses o años 9

13 antes de que se manifiesten los síntomas, de que encontremos alteración digital rectal o de que la gammagrafía ósea "hipersensible" sea positiva. Un marcador tumoral es una sustancia producida por un tumor, que se puede cuantificar en líquidos corporales y que es útil para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer. Hace 150 años se describió un marcador tumoral cuando Bence y Jones observaron la presencia de proteínas anómalas en la orina de los pacientes que presentaban lo que ahora conocemos como mieloma múltiple [2]. Un hecho interesante es que el APE se ha convertido probablemente en el mejor marcador que existe en oncología, y ha dado lugar claramente a un profundo impacto en todos los aspectos relativos a la curación del cáncer de próstata [3]. Podremos mencionar que el primer marcador tumoral para el cáncer de próstata fue la fosfatasa ácida, ya descrita por Gutman y Gutman en 1938 [4]. En la época de los 40 s, el tratamiento basándose en privación androgénica fue documentado por las disminuciones séricas de la fosfatasa ácida; como sabemos, la fosfatasa ácida sérica se origina en hueso, próstata, hígado, riñón y eritrocitos, por lo que pueden haber otros procesos patológicos que podrían dar lugar a niveles alterados de la fosfatasa ácida [10]. Posteriormente, la Fosfatasa ácida Fracción Prostática (PAP) como una isoenzíma exclusiva incrementó la utilidad clínica de este marcador. En la época de los 50 s, la elevación de la PAP, se aceptó como evidencia confirmadora de enfermedad metastásica, por lo que durante muchos decenios se basaron fuertemente en tal determinación. Más recientemente, cuando se introdujo el Radioinmunoanálisis (R.I.A.), para la determinación de la P.A.P., el rendimiento de este marcador mejoró notablemente, al aumentar su sensibilidad y especificidad, aunque sabemos que disminuyó su utilidad clínica, ya que como se demostró, que la detección elevada de la PAP en el Radioinmunoensayo no siempre se asociaba a una enfermedad metastásica, sin contar con las restricciones que represente actualmente el RIA sobre otras técnicas. Aunque el marcador PAP (Fosfatasa ácida Fracción Prostática) mediante Radioinmunoensayo era mejor que la PAP enzimática para la detección del cáncer de próstata, su sensibilidad y especificidad eran insuficientes para permitir su utilización como técnica de detección. La mayor parte de estos problemas desaparecieron tras la introducción del PSA. El cáncer de próstata, presenta 10

14 múltiples características especiales dentro de los tumores sólidos frecuentes, lo que también complica su consideración diagnóstica Un marcador tumoral es una sustancia producida por un tumor, que se puede cuantificar en líquidos corporales y que es útil para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer. Debemos de reconocer un hecho realmente importante, en donde el PSA se ha convertido probablemente en el mejor marcador que existe actualmente en urología, y ha dado lugar claramente a un profundo impacto en todos los aspectos relativos a la curación del cáncer de próstata. En el año de 1971, Hara y cols [6] Describieron la presencia de la proteína seminal gamma en el líquido seminal y propusieron su utilización en el ámbito forense; en la actualidad sabemos que esta proteína es la misma que el PSA. Posteriormente, en 1979, Wang y cols. [7] demostraron que el PSA se encontraba en el tejido prostático. A partir de 1980, el impacto sobre la práctica Urológica ha sido inmenso, a raíz de que Papsidero y cols. [8], reportaron la presencia del PSA en el suero de hombres con cáncer de próstata. El marcador tumoral perfecto debería ser elaborado exclusivamente por las células tumorales y tendría que ser detectable en cualquier paciente que presentara la enfermedad. Si supusiéramos que la primera célula tumoral transformada produjera el marcador, su sensibilidad sería del 100%. En lo práctico, esta posibilidad sería problemática debido a que haría imposible la identificación del lugar de origen del tumor. El marcador tumoral perfecto también debería poseer una especificidad del 100%; es decir, si la persona no presenta cáncer, el test es negativo. El rendimiento del marcador mejora a medida que su sensibilidad y especificidad se aproxima al 100%. El área que queda bajo la curva se puede utilizar como una medición cuantitativa de la precisión del test. La mayor parte de los marcadores son proteínas normales o proteínas que se sintetizan en fases de desarrollo y que son producidas en cantidades excesivas por el cáncer. Es prudente mencionar que, la elevación del PSA es frecuente en enfermedades distintas del cáncer: hiperplásia prostática benigna, prostatitis aguda y crónica, e infarto prostático; dichos procesos no se pueden identificar clínicamente, por lo que la biopsia prostática representa el único medio para distinguir a los pacientes con 11

15 cáncer de próstata. Los pacientes con un PSA de 3 a 15 ng/ml, representa el grupo de mayor interés, y se han propuesto varios métodos para mejorar el rendimiento del PSA. Oesterling y cols. [9] Propusieron unos límites normales de PSA según la edad para mejorar el rendimiento del marcador. Mencionan que la disminución del umbral normal incrementa la sensibilidad en los hombres jóvenes, que son los pacientes en los que la detección y el tratamiento precoces permiten obtener un mayor beneficio. La mayor parte de los marcadores séricos se miden como una variable contínua, como el PSA, los límites establecidos para los grupos pronósticos pueden depender de los métodos estadísticos utilizados, por lo que la aplicación de estos límites puede disminuir la capacidad predictiva del marcador. De acuerdo a los datos reportados, éstos confirman el valor del PSA como marcador pronóstico independiente antes del tratamiento local. Inicialmente, el PSA fue aprobado por la Food and Drug Administration sólo para el seguimiento de los pacientes con cáncer de próstata, y es especialmente eficaz para este objetivo. La importancia clínica del PSA queda subrayada por el hecho de que la detección precoz del cáncer de próstata facilita su curación potencial En 1996, se diagnosticaron 317,000 nuevos casos de cáncer de próstata en Estados Unidos [14], debido en parte a la utilización de la determinación del PSA, así como al conocimiento de la existencia de esta prueba y de la propia enfermedad en la población en general. La importancia clínica del PSA queda subrayada por el hecho de que la detección precoz del cáncer de próstata facilita su curación potencial. Ablin y cols. [11, 12] demostraron la presencia de varios antígenos mediante estudios de difusión precipitación en gel, con antisueros frente a extractos tisulares prostáticos humanos fuertemente antigénicos [13]. Los estudios de especificidad tisular de estos antígenos y su relación con el tejido prostático normal, hiperplásico y maligno sugieren la existencia de diferencias entre estos antígenos y la molécula de PSA aceptada en la actualidad. En 1981, Wang y cols. [15, 16] aislaron el antígeno prostático a partir del plasma seminal y lo compararon con el antígeno prostático purificado del tejido prostático. Análisis bioquímicos 12

16 de las preparaciones con respecto al peso molecular, punto isoeléctrico, análisis inmunológico mediante inmunodifusión reveló que los antígenos del tejido prostático y del plasma seminal eran idénticos. Las comparaciones que se efectuaron posteriormente entre extractos tisulares prostáticos y suero de los pacientes con cáncer de próstata demostraron una identidad inmunológica [17, 18]. III.- SINTESIS DEL PSA El PSA se sintetiza en el epitelio ductual y en los acinos prostáticos [19], y se localiza en el interior de célula en gránulos y vesículas citoplásmicas, en el retículo endoplásmico rugoso, en vacuolas y gránulos de secreción, y en cuerpos densos lisosomales [20]. El PSA se encuentra en tejido prostático normal, hiperplásico, tumoral primario y tumoral meta stásico de la próstata. El PSA es segregado en la luz de los conductos prostáticos mediante exocitosis y se convierte en un componente del plasma seminal, alcanzando el suero tras su difusión desde las células luminales a través de la membrana basal epitelial y de el estroma prostático, pudiendo atravesar la membrana basal capilar y las células epiteliales e introducirse en los linfáticos [21]. El PSA, que es segregado en la luz de la próstata, se introduce en el fluido seminal cuando éste atraviesa la glándula prostática. El PSA actúa produciendo la licuefacción del coágulo seminal mediante la proteólisis de las proteínas formadoras de gel en fragmentos más pequeños y solubles, liberando de esta forma los espermatozoídes [21, 22, 23]. En una observación reciente se ha sugerido que el PSA también puede modular el crecimiento celular y, por tanto, en cáncer de próstata [24]. IV.- FORMAS MOLECULARES. Las concentraciones de PSA en el suero son aproximadamente 10E6 veces menores que en el fluido seminal. Los estudios in vitro han determinado que el PSA enzimáticamente activo se puede unir fácilmente con enlaces covalentes a los inhibidores de la proteasa ACT (antiqimiotripsina) y alfa 2- Macroglobulina, formándose más rápidamente complejos con la primera que con la segunda. El PSA se une a la ACT en un complejo 1:1 que inhibe la actividad del PSA debido a la fragmentación de un péptido interno del ACT en la posición leu 13

17 135 [25, 26]. El PSA unido al ACT no ha sido detectado en el plasma de pacientes con cáncer de próstata [27]. Un pequeño porcentaje de PSA sérico aparece en forma libre, lo que sugiere que el PSA es inactivo en las formas de zimógeno e irregular[28]. Se ha descubierto que las células prostáticas malignas, pero no las benignas pueden sintetizar AC T y, por tanto, liberar hacia la sangre el complejo ACT-PSA [29]. Como se mencionó, el grupo Inmunoreactivo esta formado por dos formas moleculares primarias. Una de estas formas es la denominada PSA libre (PSA-L); representa habitualmente una fracción relativamente pequeña ( 1 a 30%) del grupo inmumoreactivo y en su mayor parte no representa actividad enzimática. La segunda forma es la del PSA unido al inhibidor de la proteasa de serina alfa-1-antiquimiotripsina ( ACT), representa en promedio aproximadamente de 70% al 85% del PSA total detectado mediante Inmunoanálisis, en hombres normales y con HPB. La forma PSA-L sérica es menor en los pacientes con cáncer de próstata que en las personas normales y que en los pacientes con hiperplasia prostática benigna. Con respecto a las diferencias en los cocientes PSA-L/PSA-ACT entre los pacientes con HPB o cáncer de próstata, Bjork y cols [30] han mencionado que las células neoplásicas de la próstata expresan no solamente PSA sino también ACT; suponen que en el interior de la célula neoplásica o en los espacios intersticiales esta doble producción facilita la formación de complejos de PSA con ACT. Consideran que el PSA-L es la forma irregular, apareciendo después de que el PSA ezimáticamente activo alcanza la circulación. Podemos suponer que la disponibilidad de ACT en el interior de la célula neoplásica y en su proximidad inmediata al PSA enzimáticamente activo podría dar lugar a una disminución del porcentaje de PSA-L en los pacientes con cáncer, en comparación con los que presentan HPB. Reportes recientes, mencionan que un paciente con exploración digital rectal positiva y un porcentaje de PSA-L del 10% presentaría la probabilidad de por lo menos del 60% de padecer cáncer de próstata y aproximadamente la mitad si la exploración rectal digital fuera negativa. Un paciente con un nivel de PSA-L del 20% tendría cuando menos la probabilidad de 36% de tener cáncer si la ERD fuera positiva y un 17% si la ERD fuera negativa. Un paciente con un 30% de PSA-L tendría el 19% de probabilidad de padecer cáncer si la ERD 14

18 fuera positiva y un 8% si la ERD fuera negativa [31]. Estudios similares, que realizó Luderer y cols. [32] en pacientes con valores de PSA de 3 a 10 ng/ml, observaron que el 73 % de los hombres con cáncer presentó cocientes de PSA-L /PSA-T de 0.15 ( P< ). En resumen la mayoría de los autores utilizando un valor límite porcentual del PSA-L del 20%, sugieren una tasa de detección del cáncer superior al 90%. Catalona y cols. [33] demostraron en un estudio prospectivo que las mediciones porcentuales de PSA-L eran útiles para la detección del cáncer en los pacientes con PSA-T entre 3 y 10 ng/ml, lo que indica que éstos pacientes deben de ser estudiados mediante PSA-L. En este estudio se toma el límite inferior de 3 mg/ml, ya que Gann y cols. demostraron que hombres con PSA de alrededor de dicho valor tienen una probabilidad 12 veces mayor de ser diagnosticados de cáncer de próstata durante los 10 años siguientes, en comparación con los hombres cuyos niveles de PSA son menores de 1ng/ml [34]. V.- RELACION P.S.A. Y EDAD En 1993 se publicaron importantes estudios independientes en lo que se estableció el papel que desempeñan los valores de referencia con especificidad para la edad en la detección del cáncer prostático precoz [9, 45]. Osterling y cols. [9] evaluaron el PSA como un marcador tumoral, estudiando sus características en una población de hombres sanos y sin evidencia de cáncer prostático escogidos al azar en la población de Olmsted County, Minnesota. Estos pacientes constituyeron la base para el estudio de población. Osterling y cols. [9] observaron que el nivel sérico de PSA se correlacionaba con la edad del paciente (r=0.43, P<0.0001). Además, la concentración sérica de PSA en esta población aumentó en un 3.2% anual, o en 0.04 ng/ml. A partir de estos datos y utilizando el percentil 95, se determinaron valores de referencia específicos para la edad respecto al PSA sérico, y se desarrollo un algoritmo diagnóstico. 15

19 Los valores de referencia específicos para la edad respecto al PSA sérico recomendados en este estudio, efectuado sobre hombres de raza blanca, fueron: 40 a 49 Años de Edad 0.0 a 2.5 ng/ml. 50 a 59 Años de Edad 0.0 a 3.5 ng/ml. 60 a 69 Años de Edad 0.0 a 4.5 ng/ml. 70 a 79 Años de Edad 0.0 a 6.5 ng/ml. Osterling señaló que la utilización de los valores de referencia específicos para la edad podría aumentar la sensibilidad del PSA para detectar más casos de cáncer prostático confinado al órgano en hombres jóvenes, al t iempo que aumentaría la especificidad del PSA al eliminar biopsias prostáticas en hombres de edad más avanzada. Oesterling y cols. [35] demostraron la utilidad clínica de los valores de referencia del PSA en relación con la edad, observando un incremento en la especificidad del 11% y valor predictivo positivo del 5%, con una pérdida del 9% en la sensibilidad. Arcangeli y cols. [36] han publicado un estudio preliminar en el que el porcentaje de PSA libre fue útil para distinguir los cánceres prostáticos potencialmente agresivos de los no agresivos. En dicho estudio efectuado sobre 54 hombres consecutivos con cáncer prostático diagnosticado en las pruebas de detección selectiva e intervenidos mediante prostatectomía radical, se observó que los niveles bajos de PSA libre se asociaban a tumores potencialmente más agresivos; en estos pacientes con niveles de PSA total entre 2 y 14 ng/ml (más del 90% entre 2 y 8 ng/ml), la elevación del PSA total no se asoció de manera significativa con la presencia de características anatomopatológicas adversas en el cáncer, mientras que los valores bajos de PSA total no fueron predictivos de cánceres poco significativos. Por su contra parte, el nivel bajo de porcentaje de PSA libre se asoció significativamente con la presencia de características anatomopatológicas adversas en los tumores, como extensión extracapsular, infiltración tumoral de los bordes quirúrgicos, mayor puntuación de Gleason y mayor volumen tumoral. Lo que se pretende en el presente estudio es reproducirlo para saber si el porcentaje de PSA libre podría ayudar a clínicos y pacientes a decidir qué tumores deben ser tratados y cuáles pueden ser dejados a su evolución con garantías de seguridad. Ya que otros autores [37, 38, 16

20 39] no han observado una correlación significativa entre el porcentaje de PSA libre y el estadio tumoral. Numerosos investigadores han observado que el nivel prequirúrgico de PSA se correlaciona con el estudio anatomopatológico pero que, por sí mismo, no permite predecir ninguno de los componentes de este estadio anatomopatológico (perforación de la cápsula, infiltración de vesículas seminales o afectación de ganglios linfáticos en casos individuales [40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47]. Para detectar el cáncer prostático con fiabilidad y en un estadio precoz se debe utilizar en las pruebas de detección un nivel límite inferior de PSA sérico de 4 ng/ml. Sin embargo, la aplicación de este valor límite bajo se acompaña de un riesgo apreciable de resultados falsamente positivos, lo que disminuye su valor predictivo y da lugar a la realización de biopsias innecesarias en procesos benignos. Aproximadamente, del 25% al 30% de hombres con HPB, y el 80% de hombres con cáncer prostático demostrado, muestran concentraciones séricas de PSA superiores a 4 ng/ml. [46, 47, 48, 49], por tanto, aproximadamente el 20% de los hombres diagnosticados de cáncer prostático presentan concentraciones séricas de PSA inferiores a 4 ng/ml [48]. En los estudios iniciales sobre esta cuestión se demostró que el 38% al 48% de pacientes con cáncer prostático clínicamente significativo y confinado al órgano presentaba niveles séricos de PSA dentro del espectro referencia estándar de 0 a 4 ng/ml [50,51]. Con el objeto de mejorar la utilidad clínica de las mediciones séricas del PSA se han desarrollado y evaluado varios conceptos nuevos, como la densidad del PSA, la velocidad del PSA y los valores de referencia específicos para la edad. Además, varios investigadores han demostrado que el PSA existe en diversas formas moleculares en el sue ro, y que las concentraciones de estas formas moleculares varían según las características patológicas de la glándula prostática. 17

21 VI.- CARACTERISTICA ENZIMATICA Y ESTRUCTURAL El antígeno prostático específico (PSA) es una proteasa de la serina con una sola cadena de 237 aminoácidos, que muestra una importante similitud estructural con los diferentes productos genéticos de la familia de las calicreínas glandulares [52, 53, 54, 55]. En el fluido seminal humano, el PSA existe en concentraciones muy elevadas ( 0.2 a 5mg/mL, o 10 a 150 micromol/l), debido principalmente a la actividad secretora del epitelio glandular de la próstata, y aproximadamente el 70% del PSA muestra actividad enzimática de tipo quimotripsina. La actividad del PSA se dirige principalmente hacia las proteínas gel principales, semenogelina I y II, y la fibronectina, lo que da lugar a la licuefacción del semen y a la liberación de los espermatozoides con una movilidad progresivamente mayor [52, 56, 57]. El PSA (hk3) está codificado por un gen localizado en el locus genético de la calicreína glandular humana en el cromosoma 19, que también contiene los genes para la calicreína tisular (hk1) y la calicreína glandular prostática humana (hk2 ó hgk-1)(58). La calicreína tisular pancreático-renal (hk1) presenta una identidad de aproximadamente el 62% con el PSA, en lo que se refiere a su estructura primaria[53, 54, 59]. La expresión del PSA y de la hk2 depende de los andrógenos y está restringida principalmente al epitelio prostático [60]. La proteína hk2 tiene una estructura primaria con una identidad de aproximadamente el 80% respecto a la del PSA. Por tanto, se ha asumido que los anticuerpos mono y policlonales frente al PSA podrían presentar reactividad cruzada con otras calicreínas glandulares humanas, lo que generaría discrepancias en los resultados de la detección inmunológica específica del PSA en el suero. Este problema ha sido abordado recientemente mediante la producción de hk2 y PSA recombinantes [61]. Y en estos estudios se ha demostrado que sólo unas pocas IgG monoclonales anti-psa presentan reactividad cruzada con la hk2 debido a afinidades idénticas por la hk2 recombinante, el PSA recombinante y el PSA aislado del fluido seminal. Por el contrario, una mayoría de la IgG monoclonales anti- PSA definen epitopos exclusivos para el PSA y no muestran reactividad cruzada con la hk2[61]. Así esta información se puede usar en el diseño de determinaciones inmunológicas 18

22 que sean específicas para el PSA; el inmunoanálisis presenta un umbral de detección de 0.1 ng/ml y una reactividad cruzada menor del 0.7 % con el PSA recombinante [62]. La concentración del PSA en el suero se mantiene normalmente por debajo de 0.1 mmol/l (aproximadamente, 3 ng/ml, lo que corresponde a menos de 10^-6 de la concentración normal del PSA liberado hacia el fluido seminal. En los fluidos extracelulares existen dos inhibidores de proteasas que se originan principalmente en el hígado, la alfa-1- anti-quimiotripsina (ACT) y la alfa-2-macroglobulina (AMC), que muestran un gran exceso molar frente al PSA (10^4-10^5 veces en estos fluidos extracelulares, y que poseen la capacidad de regular la actividad del PSA en sangre in vitro mediante la formación de complejos covalentes con la forma activa monocatenaria del PSA [63]. Además de la ACT, existen otros inhibidores que pertenecen a la superfamilia serpina de los inhibidores de la proteasa de serina (serpinas) y que forman complejos covalentes con el PSA, como la alfa-1- antitripsina (inhibidor de la alfa1-proteasa, alfa1-pi) y el inhibidor de la proteína C (ICP). Por tanto, los inmunoanálisis que existen en la actualidad para el PSA son incapaces de reconocer y medir correctamente la concentración de los complejos PSA-AMG en el suero en condiciones que no sean de desnaturalización. Por el contrario, existen varios epitopos antigénicos en el PSA que permanecen expuestos en esta molécula tras la formación de un complejo estabilizado con la ACT mediante enlaces covalentes y con cociente molar 1:1[64, 65]. Los epitopos en la porció n PSA de este complejo pueden interactuar con un número apreciable de anticuerpos monoclonales anti-psa, debido a afinidades que son igualmente intensas que las que les unen la forma libre de PSA. No obstante, un número limitado de epitopos específicos de la forma libre del PSA son completamente inaccesibles tras la unión del PSA a la ACT o a otros complejos ligadores de la clase de las serpinas como el inhibidor de la proteína C. La existencia de múltiples formas moleculares del PSA en el suero fue publicada por primera vez en El complejo covalentes estable PSA-ACT (tamaño molecular aproximada 90kd) constituye la principal forma molecular del PSA en el suero. Existe una forma libre de PSA que no forma complejos (tamaño molecular aproximado de 30kd) que es 19

23 menos abundante, aunque se ha establecido si aparece en el suero en una forma enzimáticamente activa. Esta posibilidad parece poco probable dado el sustancial exceso molar de la ACT y la AMG en el suero, que son capaces de reaccionar con una forma activa del PSA. En el momento actual, existen sólo datos limitados procedentes de estudios sobre las condiciones preanalíticas en el análisis de las diferentes formas del PSA, por ejemplo estudios de estabilidad in vitro de los preparados purificados de las diferentes formas del PSA. Estos estudios se han realizado en función de varias consideraciones teóricas; una es la posible influencia del PSA libre en el Inmunoanálisis debida a la posible conversión de la forma activa monocatenaria del PSA en una forma inactiva bicatenaria [66]. La estabilidad del complejo PSA-ACT es especialmente elevada, al contrario de lo que ocurre con otros complejos serpina-proteasa; aproximadamente, el 70% de los complejos purificados PSA-ACT se disocian tras el almacenamiento durante cuatro semanas con un ph neutro (ph 7.8) y a 35 C in vitro [62]. En el momento presente no ha sido aclarada con detalle la naturaleza molecular de la forma libre del PSA en el suero, aunque parece que no reacciona con el importante exceso molar de ACT y de AMG que existe en la sangre. El análisis de la forma libre del PSA se puede realizar con un umbral de detección de 0.01 ng/ml., Con menos de una reactividad cruzada de 0.2% con el complejo PSA-ACT, y sin reactividad cruzada detectable con la hk2 [61,62, 65]. Una captura específica de fase sólida del complejo PSA- ACT se puede conseguir mediante anticuerpos monoclonales anti-psa que no presentan reactividad cruzada con la hk2, y en combinación con anticuerpos monoclonales marcados anti -ATC para la detección de estos complejos. Los inmunoanálisis disponibles diseñados para medir la concentración total de PSA en los fluidos corporales ( es decir, la forma libre del PSA y el PSA que forma complejos con diferentes ligadores con la ACT, la alfa-1-pi y el inhibir la proteína C) no detectan la señal del complejo PSA - AMG. Se ha señalado que los niveles séricos de PSA total obtenidos con una determinación de respuesta sesgada son significativamente menores que los obtenidos con una determinación de respuesta equimolar para cocientes PSA-libre / PSA Total menores de

24 (un cociente PSA-libre/PSA-Total que se observa con frecuencia en el suero de pacientes con cáncer prostático). Actualmente no se ha aclarado todavía por qué existe una mayor proporción de PSA formando complejo con la ACT en el suero de los pacientes con cáncer prostático que en el de los pacientes que presentan HPB. No obstante, podríamos suponer que la hk2 no constituye parte de la forma de PSA libre en el suero debido a que los anticuerpos monoclonales anti PSA que se utilizan en la detección específica de PSA libre no presentan reactividad cruzada con la hk2[61]. La transcripción de ACT y la expresión de la proteína ACT se detectan en la mayor parte de las células tumorales de la mayoría de los cánceres prostáticos. Por el contrario, la expresión y transcripción de la ACT son escasas en el epitelio productor de PSA de los nódulos de la HPB. La producción local de ACT que se detecta en la mayor parte de las células tumorales prostáticas puede proporcionar condiciones mejores para que el PSA forme complejos con la ACT que se pueden introducir en la circulación sanguínea, en comparación con las condiciones proporcionadas por el epitelio de los nódulos de la HPB en el que la producción de ACT es escasa y puede facilitar la entrada de una forma de PSA libre que carece de actividad de proteasa en la sangre. Lilja y cols [64] demostraron que el PSA formando complejos con la ACT constituía la forma inmunoreactiva predominante del PSA en el suero, lo que representaba aproximadamente el 85% de PSA sérico, dejando el resto para el PSA Libre. Más recientemente, Vashi y cols realizaron un estudio para establecer los límites adecuados que permitieran utilizar el porcentaje de PSA libre[67]. Estos investigadores investigaron la capacidad del porcentaje de PSA libre y del PSA Total para distinguir los hombres con HPB con los pacientes con cáncer prostático precoz y curable en un grupo de 413 hombre con un valor sérico de PSA de 2 a 20 ng/ml. Lo que en el presente estudio se utilizarán los mismos rangos. El espectro en el que el porcentaje de PSA libre contribuyó a la mayor utilidad de la prueba del PSA fue el de 3 a 10 ng/ml. En este espectro, el porcentaje de PSA Libre superó en rendimiento al valor de PSA To tal para distinguir el cáncer de próstata de la HPB en más de un 21%. 21

25 En este estudio se seguirá el siguiente procedimiento : en los hombres con glándulas prostáticas de mayor tamaño, fue necesario determinar un valor límite de 20% o menos para detectar al menos el 90% de los cánceres. Es conveniente un valor límite del cociente PSA libre/ PSA Total de ó inferior para garantizar una sensibilidad del 90% en la detección de cáncer. Existen cada vez más pruebas de que se detecta un cáncer prostático al cabo de 3 a 5 años en el 13% al 20% de los hombres cuyos niveles de PSA Total están entre 2.6 y 4ng/mL. La detección de éstos cánceres es una base precoz y sin aumentar de forma importante el número de biopsias innecesarias, haría que aumentasen el número de hombres que acuden en buscar de tratamientos antes de que su cáncer se haya diseminado. 22

26 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA: EXISTE ALGUNA RELACION ENTRE LA ESTABILIDAD DEL PSA-T Y PSA-L IN VITRO Y EL TIEMPO ENTRE SU EXTRACCION Y ANALISIS INMUNOENZIMATICO A TEMPERATURA DE CUARTO? 23

27 HIPÓTESIS DE TRABAJO: La relación PSA-L / PSA-T in vitro se altera con el tiempo bajo condiciones de laboratorio. Este cambio puede resultar en diagnósticos equivocados, por lo que es importante estudiar la forma en que estos cambios ocurren para determinar la probabilidad de diagnósticos equivocados como función del tiempo y valores iniciales da PSA-T y PSA-L. 24

28 OBJETIVOS: OBJETIVO GENERAL: Establecer el tiempo máximo en días que se debe determinar la medición de PSA-T y PSA-L in vitro a temperatura de medio ambiente, antes de que pierda su estabilidad. OBJETIVOS PARTICULARES: -Determinar el tiempo máximo que debe permanecer el suero a temperatura de cuarto antes de que se empiece a degradar para la determinación del cociente PSA-L / PSA-T. -Conocer las concentraciones del PSA-T que se convierten en falsos positivos en días, cuando el cociente PSA-L/ PSA-T disminuye del 20%. -Determinar el tiempo máximo en días que una muestra debe permanecer a temperatura ambiente antes de que se pueda dar un resultado erróneo. -Predecir a cuales concentraciones de PSA-T los pacientes se pueden diagnosticar como falsos positivos (que tengan Cáncer de próstata) por un mal manejo de las muestras. Dar a conocer la importancia que tiene el procesar y almacenar una muestra antes de la determinación misma y; sus implicaciones que conlleva. Obtener una ecuación, con la cual no sea necesaria la determinación de la fracción libre (PSA-L) para obtener el cociente de acuerdo a las variables T (Tiempo) y PSA-T. 25

29 METODOLOGIA DISEÑO DEL ESTUDIO: múltiple. Es un estudio descriptivo, prospectivo y de correlación, con análisis de regrsión DEFINICION DEL UNIVERSO: El Universo del estudio fueron los individuos a los que se le realizaron su determinación de PSA - T sea mayor de 2 y menor de 20 ng/ml. y que su COCIENTE sea menor del 20%. LA UNIDAD DE OBSERVACION: Los sueros de pacientes que fueron admitidos al Laboratorio y se determinaron los valores de PSA-T y de PSA-L. 26

30 TECNICA DE MUESTREO: Muestreo por cuota desde el 30 de Junio de 1999 hasta noviembre 19 de1999, aquellos pacientes que fueron remitidos al Laboratorio por los asesores clínicos para la determinación de PSA-T, PSA-L y su COCIENTE. CRITERIOS DE INCLUSION: Todos aquellos pacientes que fueron remitidos por los asesores clínicos con ó sin algún diagnóstico inicial. Todos aquellos pacientes que asistieron por su propia voluntad al Laboratorio. a 20ng/mL. Sueros que su concentración de PSA-T sea mayor ó igual que 2 ng/ml.y menor ó igual Pacientes que no fueron tratados de patología prostática. Pacientes con cualquier determinación de PSA-L como PSA-T. 27

31 CRITERIOS DE EXCLUSION: Pacientes con antecedentes de haber recibido cualquier tipo de tratamiento para patología prostática. Sueros que no fueron determinados dentro de sus 24 horas correspondientes. Muestras que no fueron tomadas en el mismo Laboratorio. Pacientes que hubieran recibido masaje prostático. Suero cuya concentración de PSA-T fué menor a 2 ng/ml y mayores a 20 ng/ml. PROCEDIMIENTO Y RECOLECCION DE DATOS: 1. - Se les informó por escrito a los Urólogos (asesores clínicos) participantes de los criterios de inclusión y exclusión que deben llenar los pacientes para el estudio Después de haber sido estudiados clínicamente por el médico, y tener un diagnóstico clínico; fueron remitidos al Laboratorio para la determinación de PSA-T, PSA-L y su COCIENTE En el Laboratorio se les asignó un número de folio donde se le tomó todos sus datos como nombre completo, edad, médico tratante, domicilio, teléfono, diagnóstico inicial, fecha de toma de la muestra Se les tomó sangre venosa de 12 a 14 ml. con tubos con activador de SST; se rotularon los tubos y después de haberse coagulado se centrifugaron. 28

32 5. - Se mantuvieron los sueros en recipientes a temperatura de medio ambiente a la sombra. Debidamente rotulados y fechados El día 0 (cero) será el día en que se recolecte la muestra; el día 1, 24 horas después; el día 2, 48 horas después y así sucesivamente. 7. Se vaciaron los datos a la hoja de captura de datos de paciente, para su análisis posterior. 8. Para conocer la temperatura de medio ambiente que tuvimos durante la investigación, se llevó un registro y medición de temperatura del medio ambiente 3 veces al día para su posterior análisis Se llevó un registro de control de calidad interno de las mediciones de PSA-T, PSA- L; para su posterior análisis estadístico Las muestras fueron procesadas en el aparato AxSYM de ABBOTT 11. -EL Ensayo de PSA libre por AxSYM es un ensayo enzimático por micropartícula (MEIA) para la determinación cuantitativa del antígeno prostático específico fracción libre (PSA) en suero humano. El ensayo PSA libre AxSYM está diseñada para ser usado en conjunción con el AxSYM ensayo Total PSAen hombres con edad de 50 años y con exprolación rectal digital (ERD) no sospechosa para determinación del cociente PSA libre / PSA Total. El AxSYM PSA Libre/ PSA Total cociente, puede ser usado como una ayuda en la discriminación entre cáncer de próstata y enfermedad benigna. El reactivo está constituído por los siguientes constituyentes: A) 1 Botella (8.3mL) Anti-PSA (Raton, monoclonal) unido a Micropartículas in Buffer TRIS con sucrosa. Preservativos: Azida de sodio. (Reactivo Botella 1). 29

33 B) 1 Botella (12.6 ml) Diluyente del Ensayo. Buffer TRIS con proteína (bovina) estabilizadores. Preservativos: Azida de sodio y Agentes Antimicrobianos. (Reactivo Botella 2). C) 1 Botella (16.0) Anti-Libre PSA ( Ratón, Monoclonal) : Conjugado de Fosfatasa Alcalina en Buffer TRIS con proteína (bovina) como estabilizadores. Concentración mínima : 0.1 micro g/ml.preservativo: Agentes Antimicrobianos (Botella reactivo 3). D) 1 Botella (25.7 ml) Especímen diluyente. Con Buffer TRIS con estabilizadores de proteína (bovina). Preservativos: Azida de Sodio y Agentes Antimicrobianos. (Reactivo Botella 4) El AxSYM PSA Total es un ensayo Inmunoenzimático por micropartículas (MEIA) para la determinación cuantitativa de PSA Total( tanto como PSA libre y PSA Complejo unida a alfa-1-antiquimiotripsina ) en suero humano: 1.- Como una ayuda en la detección de cáncer de prostátacuando es usado en conjución con el exámen rectal digital (ERD) en hombres de 50 años ó mayores. 2.- Como un exámen adjunto para la ayuda en el manejo de pacientes con cáncer de próstata. El reactivo está constituído por los siguientes constituyentes: A) 1 Botella ( 8.3 ml ) Anti-PSA (Ratón, Monoclonal) Unido a Micropartículas en Buffer TRIS con sucrosa. Preservativos : Azida de Sodio. (Botella Reactivo 1). B) 1 Botella (9.4 ml) Diluyente del Ensayo. Buffer TRIS con proteína (bovina ) como estabilizadores. Preservativos: Azida de Sodio y Agentes Antimicrobianos. (Botella Reactivo 2). C) 1 Botella (13.5 ml) Anti-PSA (Ratón, Monoclonal : Conjugado de Fosfatasa alcalina en Buffer TRIS con proteína (bovina) como estabilizadores. 30