MECANISMOS EXCITOTÓXICOS, RESPUESTA NEUROINFLAMATORIA Y FACTORES SÉRICOS EN LA ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA HUMANA Y EXPERIMENTAL

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1 MECANISMOS EXCITOTÓXICOS, RESPUESTA NEUROINFLAMATORIA Y FACTORES SÉRICOS EN LA ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA HUMANA Y EXPERIMENTAL Investigadores principales: Dr. Josep E. Esquerda Colell Facultat de Medicina Universitat de Lleida Dr. Joan Serratosa Serdà Institut d'investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer Dra. Jerònia Lladó Vich Facultat de Ciències Universitat Illes Balears Dr. Carles Solsona Sancho Facultat de Medicina Ciutat Sanitària i Universitària de Bellvitge Dr. Ronald William Oppenheim Wake Forest University. School of Medicine. EUA Duración: 3 años 1

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4 1. Resumen La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa muy grave. Los neurólogos no disponen de ningún tratamiento capaz de mejorar su curso fatal. Desde el punto de vista patogénico, a pesar del notable esfuerzo de investigación realizado en los últimos años, que ha dado lugar a un considerable progreso en el conocimiento de la enfermedad, la ELA sigue siendo una enfermedad enigmática en muchos aspectos. Existen diversas teorías sobre la patogenia de la ELA, ninguna de ellas mutuamente exclusiva. El objetivo del presente proyecto es agrupar la experiencia propia de distintos laboratorios de investigación para realizar una contribución a la comprensión de algunos mecanismos implicados en la degeneración de la motoneurona (MN) e identificar nuevas dianas para la terapia de la ELA. Cada uno de los equipos de participantes constituye un laboratorio experto en distintos ámbitos de investigación, pero asimismo complementarios y que nosotros hemos considerado relevantes en el contexto de los conocimientos actuales sobre la patogenia de la ELA. Creemos que el estado actual de la investigación sobre la ELA se halla en un período particularmente estimulante. Cabe esperar que los conceptos actualmente emergentes a nivel celular y molecular en neurociencia y en inmunología, junto con la disponibilidad de modelos animales producirá, en los próximos años, avances importantes en la comprensión de la complejidad de la enfermedad como entidad biológica. Este esfuerzo de investigación tiene que ayudar a establecer las bases de una futura terapia para la ELA. Bajo esta perspectiva se ha elaborado este proyecto que se propone abordar algunos aspectos todavía no resueltos de la neurotoxicidad por glutamato y de la neuroinflamación en relación con las MN y que serán investigados conforme a los siguientes objetivos principales. 1.1) Exploración de algunos mecanismos específicos de tipo celular involucrados en la degeneración de MN durante la toxicidad crónica por glutamato. Una hipótesis, ampliamente aceptada por la comunidad científica, considera que la excitotoxicidad mediada por glutamato ejerce un papel importante en el daño motoneuronal en la ELA. Proponemos: en primer lugar dilucidar como un estímulo excitotóxico subletal altera selectivamente el procesamiento de proteínas a nivel del retículo endoplásmico, la homeostasis del 4

5 calcio intracelular y el transporte vesicular en MN sometidas a excitotoxicidad crónica subletal; segundo, evaluar los efectos neuroprotectores de agentes que interfieran la señalización de la excitotoxicidad en MN en sistemas tanto in vitro como in vivo; tercero, analizar los cambios plásticos en las conexiones neuromusculares por parte de las MN sometidas a excitotoxicidad crónica. 1.2) Analizar las implicaciones de la expresión de SOD1 mutada (msod1) en el impacto de las células gliales sobre la supervivencia de MN. Partimos de la hipótesis que la expresión de msod1 da lugar a cambios funcionales en las células gliales, algunos de los cuales pueden ejercer efectos negativos sobre la supervivencia neuronal. Para verificar esta hipótesis utilizaremos cultivos mixtos (astrocitos y microglia), cultivos enriquecidos en astrocitos y cultivos de microglia procedentes de ratones salvajes (WT) y mutantes sobreexpresores de msod1g93a. Estas células se obtendrán a distintas edades para así simular las distintas etapas de la enfermedad. Se caracterizará la respuesta microglial después del tratamiento con lipopolisacárido (LPS) para así verificar si la msod1 determina una exacerbación de la activación microglial cuando se compara con la SOD1 WT. Para este fin se determinará la liberación de óxido nítrico y de tumor necrosis factor-α (TNF-α) al medio y la translocación nuclear del factor nuclear kappa B (NF-κB), el incremento del factor de trascripción C/EBPβ y de p21cip1. Todos estos factores participan en la respuesta neuroinflamatoria glial. El segundo objetivo consistirá en el estudio de los efectos de un medio de cultivo condicionado de células gliales tratadas con LPS, ya sean procedentes de animales msod1g93a o bien WT, sobre la viabilidad de MN. El tercer objetivo será la inhibición farmacológica o mediante sirna de los factores anteriormente mencionados, con el fin de determinar su efecto sobre la viabilidad neuronal. 1.3) Estudio de las interacciones entre la excitotoxicidad y la neuroinflamación. Partimos de la hipótesis que los niveles elevados de citocinas como TNF-α liberadas al medio por la microglia convierten a las MN más vulnerables a la agresión excitotóxica. El TNF-α podría facilitar la excitotoxicidad mediada por glutamato por un mecanismo directo, aumentando la expresión de receptores AMPA en la sinapsis y también indirectamente inhibiendo los transportadores astrogliales de glutamato. Proponemos estudiar 5

6 la relación entre los receptores de TNF-α y los receptores de glutamato y los transportadores, ya que creemos que el nexo entre la neuroinflamación en la ELA y la excitotoxicidad motoneuronal podría radicar en la interconexión entre estas vías. Proponemos utilizar modelos in vitro de cultivos de médula espinal para estudiar: 1) los efectos directos de las citocinas sobre las MN evaluando la viabilidad celular, alteraciones del citoesqueleto, etc.; 2) la posible exacerbación de la excitotoxicidad inducida por los niveles elevados de citocinas; 3) las alteraciones en el tráfico de receptores de glutamato (AMPA, NMDA mglur) y de transportadores inducidos por los niveles altos de TNF-α. 1.4) Identificación de autoanticuerpos circulantes en el suero de pacientes con ELA. El diagnóstico de ELA se basa en datos clínicos y electromiográficos. La disponibilidad de un marcador de laboratorio válido para el diagnóstico o seguimiento de la enfermedad es un objetivo altamente deseado por los neurólogos. En pacientes de ELA se ha descrito la existencia de autoanticuerpos contra canales de calcio pero no ha sido definido ni su origen ni su significado patogénico. Nuestro propósito es la aplicación de nuevos métodos para detectar y caracterizar anticuerpos circulantes en enfermos de ELA para evaluar su especificidad y relevancia. Los oocitos de Xenopus transfectados con distintas subunidades proteicas de canales iónicos de membrana, se utilizarán para analizar las corrientes evocadas por los anticuerpos de los pacientes. También se analizaran los efectos de estos anticuerpos sobre MN en desarrollo del embrión de pollo, así como los antígenos neurales reconocidos por los mismos. 2. Resultados Equipo Dr. Josep E. Esquerda Colell Miembros del equipo: Jordi Calderó Pardo, Anna Casanovas Llorens, Dolors Ciutat Falcó, Olga Tarabal Moztazo. Estudiantes de doctorado: Núria Brunet García, Sara Hernández Estañol. Se han estudiado los procesos de excitotoxicidad de las MN espinales en cultivos organotípicos de médula espinal de embrión de pollo. Se han usado agonistas 6

7 glutamatérgicos y toxinas mitocondriales para provocar el daño neuronal y determinar les alteraciones en la homeostasis del calcio intracelular. Dado el controvertido efecto terapéutico del litio en la ELA, se ha utilizado este modelo para analizar los posibles efectos neuroprotectores de este agente. Nuestros resultados indican que a pesar de que el litio puede tener un efecto antiexcitotóxico, no evita la aparición de cambios degenerativos en motoneuronas sometidas a estímulos excitotóxicos. Hemos descrito el desarrollo normal de la microglia y su activación después de estímulos excitotóxicos en la médula espinal del embrión de pollo. También hemos descrito que las neuronas degenerantes en ratas y ratones transgénicos SOD1G93A adquieren una fuerte inmunorreactividad a anticuerpos contra el receptor purinérgico P2X4. Les neuronas que presentan esta propiedad están asociadas a microglia activada y neuronofágica. Mediante métodos de proteómica hemos descubierto que el material inmunorreactivo a P2X4 se corresponde con confórmeros neurotóxicos de msod1 que exponen un epítopo normalmente oculto en la SOD1 bien doblada. Pensamos que la neutralización de la actividad neurotóxica de los confórmeros mal doblados de SOD1 puede ejercer un efecto terapéutico en la ELA. Basados en esta idea hemos desarrollado nuevos anticuerpos anti-msod1, específicos de conformación y, además, hemos iniciado un protocolo de inmunoterapia activa en animales transgénicos con distintas mutaciones de SOD1, que actualmente está en marcha. En colaboración con el grupo 4 y 5 hemos puesto de manifiesto la existencia de autoanticuerpos contra semaforina 3 en el suero de un grupo de pacientes con ELA. Se necesitarían futuros estudios para evaluar la significación clínica de este hallazgo. Equipo Dr. Joan Serratosa Serdà Miembros del equipo: Carme Solà Subirana, Josep Saura Martí, Josep Maria Tusell Puigbert, Pilar Mancera Aroca, Tony Valente y Guido Dentesano. 7

8 La neuroinflamación puede desempeñar un papel importante en muchos procesos neurodegenerativos, incluida la ELA. En nuestro estudio hemos demostrado que la expresión de la ON sintetasa-2 (NOS2) y de la ciclooxigenasa-2 (COX2) inducida por el liposacárido (LPS) + interferón gamma era más alta en cultivos enriquecidos en células microgliales procedentes de ratones G93A-SOD1, que son un modelo animal de ELA, que en los cultivos microgliales de ratones normales (wild-type). Los niveles de CCAAT/enhancer binding protein β (C/EBPβ), un factor de transcripción que regula la expresión de genes pro-inflamatorios, también incrementaron en la microglia activada procedente de los ratones G93A-SOD1. In vivo, la inyección sistémica de LPS indujo una respuesta inflamatoria mayor en los ratones G93A-SOD1 en comparación con los ratones wild-type, con expresión aumentada de GFAP, CD11b, NOS2, COX-2, citocinas pro-inflamatorias y C/EBPβ. Finalmente, también demostramos que C/EBPβ se expresa en pacientes de ELA. Creemos que es la primera vez que se describe la expresión de C/EBPβ en la ELA humana. El conjunto de resultados que hemos obtenido durante la realización del proyecto indica que la expresión de los ratones G93A-SOD1 constituye un modelo exacerbado de neuroinflamación y sugiere que el factor de transcripción C/EBPβ es un candidato para regular la expresión de genes potencialmente neurotóxicos en las células microgliales en la ELA. Equipo Dra. Jerònia Lladó Vich Miembros del equipo: Gabriel Olmos Bonafé, Francesc Xavier Miralles Morell, Víctor J. Asensio Landa. Estudiantes de doctorado: Laia Tolosa Pardo, Margalida Mir Mas, Víctor Caraballo Miralles. Además de la excitotoxicidad glutamatérgica y del estrés oxidativo, la respuesta neuroinflamatoria parece ser un proceso relevante para el daño de la motoneurona en la ELA. La acumulación de microglia reactiva en áreas de neurodegeneración de la ELA es clave para crear un ambiente inflamatorio crónico que conduce a la muerte de las motoneuronas. Se ha propuesto que las citocinas proinflamatorias factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α) e interferóngamma (IFN-γ) están implicadas en la activación microglial típica de la ELA. De 8

9 hecho, se han detectado niveles circulantes elevados tanto en modelos animales de la enfermedad como en pacientes de ELA. El primer objetivo de nuestro estudio fue elucidar los efectos del IFN-γ y del TNF-α sobre la expresión de inos y la producción de óxido nítrico en células de microglia. En la línea celular de microglia BV-2 se ha demostrado que el IFN-γ y el TNF-α tienen una acción complementaria sobre la expresión de inos, circunstancia que podría ser importante para comprender los mecanismos moleculares de la expresión de la activación microglial asociada a la patogénesis de diversas enfermedades con un componente neuroinflamatorio en las que se han detectado niveles elevados de IFN-γ y TNF-α. El segundo objetivo fue estudiar los efectos de estas citocinas en un cultivo de motoneuronas en presencia de células gliales en un nuevo sistema de cultivo que hemos desarrollado en nuestro laboratorio. En estos cultivos la exposición conjunta a las anteriores citocinas indujo la expresión de enzimas pro-oxidativas en comparación con la exposición a cada citocina por separado. El IFN-γ y el TNF-α también cooperaron en la inducción de oxidación proteica y nitración, aumentando el porcentaje de motoneuronas inmunorreactivas para la nitrotirosina. Finalmente, el IFN-γ y el TNF-α también cooperaron en la inducción de muerte apoptótica de motoneuronas. Curiosamente, estas citocinas no afectaron la viabilidad de motoneuronas espinales purificadas, en ausencia de células gliales. Estos resultados sugieren que las citocinas proinflamatorias IFN-γ y TNF-α tienen efectos cooperativos/complementarios en la muerte de motoneuronas asociada a neuroinflamación. El tercer objetivo fue estudiar si las citocinas anteriores tienen un papel facilitador de la neurotoxicidad de motoneuronas inducida por glutamato. En cultivos organotípicos de médula espinal de rata, la excitotoxicidad crónica por glutámico inducida con el inhibidor de la captación de glutamato threohidroxiaspartato (THA) provocó muerte de las motoneuronas, asociada a una respuesta neuroinflamatoria. El TNF-α potenció la excitotoxicidad inducida con THA y se observó un incremento en la muerte de motoneuronas. La exposición conjunta a TNF-α y THA condujo a la regulación a la baja del transportador de glutamato astroglial 1 (GLT-1) y a un incremento en los niveles 9

10 extracelulares de glutamato, que fueron abolidos por la inhibición del factor nuclear-kappa B (NF-κB). Además, el TNF-α y el THA también tuvieron efectos cooperativos en la inducción de estrés oxidativo en un mecanismo que implica la vía del NF-κB. La inhibición de esta vía anuló la exacerbación por TNF-α de la muerte de motoneuronas mediada por glutámico. Con estos resultados, se describe por primera vez que la activación de NF-κB inducida por TNF-α potencia la muerte excitotóxica de motoneuronas y se refuerza nuestra hipótesis que plantea una compleja interrelación entre los mecanismos de neuroinflamación y la excitotoxicidad glutamatérgica, importantes en la patología de muchas enfermedades neurológicas, incluyendo la ELA. Sería interesante considerar esta interrelación para el diseño racional de nuevas terapias para la ELA. Equipo Dr. Carles Solsona Sancho Miembros del equipo: Jordi Marsal, Joan Blasi, Mireia Marti-Satué, Artur Llobet, Mònica Povedano. Estudiante de doctorado: Laura Teixidó. Las formas familiares de la ELA están asociadas con mutaciones de la enzima Superóxido dismutasa dependiente de Cu/Zn (SOD-1), pero éstas sólo corresponden al 10% de los casos, el resto, más del 90% corresponden a las formas esporádicas de ELA. Aunque en los últimos años se han propuesto diferentes hipótesis sobre los mecanismos responsables de la muerte selectiva de las motoneuronas, aún no sabemos las causas de la ELA esporádica. En este proyecto hemos estudiado el efecto de los sueros de enfermos de ELA sobre los receptores de glutamato de tipo NMDA (NMDAR). Teniendo en cuenta la posible implicación de los receptores NMDA en la muerte neuronal, hemos partido de la hipótesis que algunos factores séricos endógenos pueden estar implicados en la muerte neuronal en la ELA, a través de estos receptores. En los sueros de enfermos de ELA y de personas sanas se inactivó la vía del complemento y se dializaron para eliminar la glicina y el glutamato. Las IgG de los pacientes y de las personas sanas se purificaron mediante cromatografía de afinidad y fueron dializadas contra salino tamponado con fosfato. Los receptores NMDA humanos (subunidades NR1 y NR2A) se expresaron en ovocitos de 10

11 Xenopus laevis y las corrientes iónicas se registraron utilizando la técnica de fijación de voltaje con dos electrodos. En los ovocitos que expresaban los receptores NMDA, los sueros procedentes de los pacientes con ELA esporádica activaban corrientes oscilatorias transitorias, siendo su carga eléctrica mayor que la que activaban los sueros de personas sanas. Los sueros procedentes de otras enfermedades neuromusculares no producían este efecto. Las corrientes oscilatorias se deben a la movilización del calcio de los almacenes intracelulares. Las corrientes estaban inhibidas por MK- 801, el antagonista no competitivo de los receptores NMDA. Para obtener esta respuesta era necesaria la presencia de las dos subunidades NR1 y NR2A. Además, la respuesta a glutamato estaba potenciada tanto para los sueros de los pacientes como para los de las personas sanas. Las IgG aisladas de los pacientes doblaban significativamente la respuesta de los ovocitos que expresaban NMDAR respecto a la obtenida con IgG de personas sanas. Nuestros datos apoyan la hipótesis que el suero de los enfermos de ELA contiene un factor soluble que sin abrir directamente la conductancia iónica moviliza el calcio intracelular, y que a través de vías no canónicas activa los receptores NMDA, probablemente a través de la interacción con una proteína Gq. Equipo Dr. Ronald William Oppenheim Miembros del equipo: Carol Milligan. Los experimentos se han dirigido a investigar la existencia de sustancias con actividad trófica y/o tóxica en el suero y en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con ELA. Los resultados han mostrado una actividad promotora de supervivencia de MN en desarrollo en ensayos realizados en embriones de pollo. Estos resultados han sido replicados por el equipo 1. En colaboración con este equipo y aplicando técnicas de proteómica, se ha detectado la presencia en los sueros de anticuerpos antisemaforina 3A que promueven la ramificación de axones intramusculares y que pueden explicar el efecto promotor de la supervivencia motoneuronal. Se han detectado niveles elevados de estos anticuerpos en un subgrupo de pacientes con ELA. Se necesitarían estudios futuros para evaluar la significación de este hallazgo. 11

12 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos La ELA o enfermedad de la motoneurona sigue siendo una de las enfermedades neurológicas más devastadoras. A pesar de que con el tratamiento con Riluzol se obtiene un cierto efecto terapéutico incrementando modestamente la esperanza de vida de los enfermos, se trata indudablemente de una enfermedad actualmente incurable. Desde el punto de vista biológico la enfermedad es todavía muy enigmática. Sin embargo, en los últimos años un número cada vez mayor de científicos de todo el mundo se esfuerzan para descifrar los mecanismos por los que se produce esta enfermedad. Solamente el esfuerzo conjunto de investigadores en todo el mundo con la ayuda de las potentes técnicas analíticas disponibles en la actualidad para el estudio de los procesos patológicos a los niveles nivel celular y molecular podrá cambiar esta situación y proporcionar nuevas formas de abordaje de la terapia de la ELA en un próximo futuro. Hace poco tiempo en la página web de la asociación americana para la ELA se podia leer: A pesar de la naturaleza misteriosa de la ELA, el notable avance que se produce actualmente en ciencia, medicina y tecnología está articulando un futuro de esperanza para los enfermos. La ALS Association quiere estar en primera línea de frente en este nuevo mundo, estimulando a los jóvenes científicos a combinar ideas innovadoras con los más recientes avances tecnológicos con el objetivo de descifrar los misterios que encierra la ELA. Cada 90 minutos fallece un americano de ELA. No tenemos tiempo para lamentaciones. El objetivo de este proyecto ha sido la realización de un trabajo de cooperación entre 5 laboratorios para contribuir a la comprensión de algunos mecanismos implicados en la degeneración de motoneuronas y a la identificación de nuevas dianas para el tratamiento de la ELA. Creemos que el estado actual de la investigación en ELA se halla en un período particularmente estimulante. Cabe esperar de los conceptos actualmente emergentes en neurociencia a un nivel celular y molecular, así como en inmunología, junto con la disponibilidad de modelos animales de la 12

13 enfermedad, deriven en los próximos años de hecho ya lo está haciendo en notables avances en la comprensión de la complejidad de la enfermedad como entidad biológica. Este conocimiento nos ha de conducir hacia el establecimiento de las estrategias de terapia. Esta ha sido la orientación de nuestro proyecto. Los resultados obtenidos con el desarrollo del proyecto han sido publicados en revistas especializadas de alcance mundial. Esperamos que los datos aportados en estos trabajos contribuyan a avanzar la investigación sobre ELA y su terapia. Por ejemplo, gracias a resultados obtenidos en este proyecto se está desarrollando actualmente una vacuna terapéutica orientada a neutralizar la actividad neurotóxica de la SOD1 mutada. Esta vacuna se halla actualmente en fase de ensayo preclínico. Asimismo, este proyecto ha hecho posible la formación de nuevos investigadores jóvenes en este campo. Por ejemplo, Sara Hernández, que obtuvo su doctorado trabajando en el proyecto de La Marató, se halla actualmente incorporada como investigadora posdoctoral en uno de los laboratorios más importantes, a nivel mundial, de investigación sobre ELA (Dr. Wim Robberecht at the Department of Neurology, University of Leuven). Se espera que, una vez completado este período de formación postdoctoral, pueda reincorporarse a Cataluña como investigadora independiente, incrementando así nuestro potencial investigador en este tema. 4. Publicaciones Casanovas A, Hernández S, Tarabal O, Rosselló J, Esquerda JE. (2008) Strong P2X4 purinergic receptor-like immunoreactivity is selectively associated with degenerating neurons in transgenic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 506: (IF: 3.93) 13

14 Calderó J., Brunet N., Ciutat D., Hereu M., Esquerda J. E. (2009) Development of microglia in the chick embryo spinal cord: implications in the regulation of motoneuronal survival and death Journal of Neuroscience Research 87: (IF: 3.19) Brunet N.,Tarabal O. Esquerda J. Calderó J. (2009) Excitotoxic motoneuron degeneration induced by glutamate receptor agonists and mitochondrial toxins in organotypic cultures of chick embryo spinal cord by Journal of Comparative Neurology 516: (IF: 3.93) Hernández S, Casanovas A, Piedrafita L, Tarabal O, Esquerda JE. (2010) Neurotoxic species of misfolded SOD1G93A recognized by antibodies against the P2X4 subunit of the ATP receptor accumulate in damaged neurons of transgenic animal models of amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol.;69: (IF:5.04) Calderó J, Brunet N, Tarabal O, Piedrafita L, Hereu M, Ayala V, Esquerda JE. (2010) Lithium prevents excitotoxic cell death of motoneurons in organotypic slice cultures of spinal cord. Neuroscience 165: (IF:3,52) Hernández S, Texidó L, Calderó J, Ciutat D, Piedrafita L, Casanovas A, Blasi J, Solsona C, Povedano M, Rojas R, Illa I, Caress J, Prevette D, Oppenheim RW, Milligan C, Esquerda JE (2010) Increased intramuscular nerve branching and inhibition of programmed cell death of chick embryo motoneurons by immunoglobulins from patients with motoneuron disease. J Neuroimmunol. 229: (IF:2.83) Tusell JM., Ejarque-Ortiz A., Mancera P., Solà C., Saura J., Serratosa J (2009) Upregulation of p21cip1 in Activated Glial Cells. Glia, 57: (IF:5,09) 14

15 Valente T., Mancera P., Tusell JM., Serratosa J., Saura J. (2011) C/EBPβ expression in activated microglia in amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiology of Aging.(Sotmès per publicar.) Tolosa, L.; Mir, M.; Asensio, VJ.; Olmos, G.; Lladó, J. (2008) Vascular endothelial growth factor protects spinal motoneurons against glutamate-induced excitotoxicity via phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Neurochemistry 105: (IF:4.20) Mir, M.; Tolosa, L.; Asensio, VJ.; Lladó, J.; Olmos, G. (2008) Complementary roles of tumor necrosis factor alpha and interferon gamma in inducible microglial nitric oxide generation. Journal of Neuroimmunology 204: (IF:2.83) Tolosa, L.; Mir, M.; Olmos, G.; Lladó, J. (2009) Vascular endothelial growth factor protects motoneurons from serum deprivation-induced cell death through phosphatidylinositol 3-kinase-mediated p38mapk inhibition. Neuroscience 158: (IF: 3.52) Mir, M.; Asensio, V.J., Tolosa, L.; Gou-Fabregas, M.; Soler, R.M.; Lladó, J.; Olmos, G. (2009) Tumor necrosis factor alpha and interferon gamma cooperatively induce oxidative stress and motoneuron death in rat spinal cord embryonic explants. Neuroscience 162: (IF:3.52). Tolosa, L.; Caraballo-Miralles, V.; Olmos, G.; Lladó, J. (2011) TNF-α potentiates glutamate-induced spinal cord motoneuron death via NF-κB. Molecular and Cellular Neuroscience 46: (IF:3.88) Texidó L., Hernández S., Martín-Satué M., Povedano M., Casanovas A., Esquerda JE., Marsal J., Solsona C (2011) Sera from amyotrophic lateral sclerosis patients induce the non-canonical activation of NMDA receptors in vitro. Neurochemistry International, (submitted) 15

16 Texidó L., Martín-Satué M., Alberdi E., Solsona C., Matute C (2011) Amyloid-β peptide oligomers directly activate NMDA receptors Abbreviated title: Amyloid-β activates NMDA receptors. Cell Calcium, (in press) (IF:4,27). Oppenheim RW, Calderó J, Cuitat D, Esquerda J, McArdle JJ, Olivera BM, Prevette D, Teichert RW. (2008) The rescue of developing avian motoneurons from programmed cell death by a selective inhibitor of the fetal muscle-specific nicotinic acetylcholine receptor. Developmental Neurobiology. 68: (IF:2.79) 16