Vacunas: protegen al establecer una resistencia inmunológica a patógenos

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1 Vacunas Vacunas: protegen al establecer una resistencia inmunológica a patógenos Hospedero produce anticuerpos Dr. Edward Jenner en 1796 infecto a un niño con cowpox Protegido contra smallpox 2 millones de humano sufren de enfermedades para las que hay vacunas Vacunas inactivadas: muertas Vacunas atenuadas: vivas no virulentas

2 Problemas de las vacunas tradicionales: No todos los agentes infecciosos crecen en cultivo Requiere cultivo de tejido de células mamíferas Bajo nivel de producción del agente Agente puede no estar completamente inactivado Pueden perder la atenuación Hay agentes como el HIV que son riesgosos Fecha de expiración limitada y necesitan refrigeración

3 Ventajas Vacunas recombinantes: Se puede remover los genes de virulencia. Puede usarse como vacuna viva Crear sistemas vivos no patogénicos Expresan el antígeno de un patógeno Se puede expresar los genes de un patógeno que no crece en cultivo en otro organismo

4 Vacunas recombinantes usadas inicialmente en animales

5 Vacunas producen inmunidad a proteínas en la superficie del patógeno Proteínas purificadas del cápsido o de la envoltura son suficiente para respuesta inmune Vacunas de subunidades: usan componentes del patógeno Mayormente por tecnología del DNA recombinante No hay peligro de contaminación Purificación puede ser mas costosa Puede ser menos inmunogénica

6 Virus del Herpes Simple Oncogénico Transmisible sexualmente Encefalitis Infección de ojos severa Usar vacuna atenuada o inactivada es peligroso Glicoproteína D de la envoltura Buena para vacuna subunidad Proteína es clonada en un vector de expresión mamífero Se expresa en CHO Modificaciones posttranslacionales

7 gd: se empotra en la célula mamífera Difícil de purifica Se le removió los nucleótidos que codifican para el terminal- C Dominio transmembranal Esto la hace soluble Se produce en CHO Es secretada al medio Efectiva contra HSV-1 y HSV-2

8 Foot-and Mouth Disease (FMDV) Enfermedad del ganado muy virulenta La proteína viral 1 del cápsido (VP1) es muy inmunogenica VP1 produce respuesta inmune suficiente por si sola Genoma de RNA (8,000 nt) hebra sencilla Se produjo el cdna Se produjo un biblioteca de cdna en vector de E. coli Fue clonado como una proteína de fusión Para ser aprobada por FDA tiene que ser clonada sola, no como fusión

9 Vacunas péptidas Se utiliza una porción de una proteína Puede utilizar epítopes que son determinantes antigénicos Puede ser que un epítope no sea suficientemente inmunogénico El péptido tiene que formar el doblez proteico funcional

10 Múltiples epítopes fueron fusionados a una proteína cargadora Usualmente epítopes solos son degradados rápidamente Se inyectaron en guimos Epítope del terminal C produjo mejor protección que la proteína VP1 completa o que los epítopes del terminal N. Cantidad requerida de la vacuna peptídico fue 1000 veces mas alta que usando el virus completo Péptido se fusiono a hepatitis B core protein que es altamente inmunogénica

11 Problemas de vacunas peptídicas: El epítope tiene que ser formado por a.a continuos Debe asumir la misma conformación Un solo epítope puede no ser suficientemente inmunogénico Respuesta inmunológica mas fuerte cuando esta ensamblado Cytotoxic T lymphocyte response Proteína p1 del Ty virus 7 epítopes de Plasmodium falciparum Inmunidad en ratones fue baja

12 Inmunización genética: Vacunas de DNA El gen que produce la proteína antigénica es introducida en la célula animal Inicialmente se uso el gene gun para llevar el gen bajo el control de un promotor viral Se puede insertar grandes cantidades de un plásmido que contiene el cdna del un gen directamente al músculo Requiere hasta 4 veces mas DNA que el gene gun No necesita pasos de purificación o producción de la vacuna recombinante Es menos costoso Produce modificaciones después de la translación

13 Ratón fue inmunizado con la vacuna de DNA al ser inyectado con un plásmido expresando cdna de la proteína del nucleocápsido de la influenza A bajo el control del pcmv Se detectaron anticuerpos Fueron protegidos contra la influenza A Protegió contra otros tipos de influenza Respuesta inmunológica no es contra el vector

14 Hay posibilidad de integración del vector Forma que no se replica y después desaparece Shigella flexneri como vector Infecta células epiteliales Envía sus plásmidos al citoplasma Si tiene un promotor eucariota es transcrito y traducido Es patogénico Producción del organismo no patogénico Aspartate B-semialdehyde dehydrogenase (ácido diaminopimélico) Se puede dar oralmente

15 Partículas catiónicas poliméricas biodegradables (micropartículas) Libera el DNA mas lentamente Permite que el DNA persista por mas tiempo Mismo efecto que DNA desnudo usando 250 veces menos DNA (usualmente mg) El adyuvante fosfato de aluminio ayudo a producir una mayor repuesta inmunológica Usualmente las vacunas no proporcionan inmunidad mucosa

16 Inmunidad Mucosa es importante porque limita la entrada del patógeno al organismo Tejido linfático asociado con superficies mucosas Glándulas secretoras externas Usualmente el virus atenuado Formulaciones de DNA envueltas en liposómas catiónicos Plásmido expresa cytokine (IL) Inmunidad sistémica Nódulos linfáticos, medula, otros

17 Monos rhesus vacunados con DNA que codifica para el virus de inmunodeficiencia del simio Fueron protegidos contra la enfermedad

18 Vacunas atenuadas recombinantes Organismos no patógenos que expresan el antígeno Patógeno donde los genes de virulencia fueron removidos Algunas veces el antígeno purificado no tiene la conformación apropiada V. colera Vacuna viva mas efectiva que la inactivada o de subunidades Toxina colera es hexamérica Porción A1 es la toxina (estimula adenylate-cyclase) A2 junta A1 con B Subunidad B es pentamérica y se pega al receptor

19 Vacuna actual es inactivada con fenol. Protege solo por 3 a 6 meses Una vacuna efectiva debe ser oral Se produjo una bacteria con parte de la subunidad A1 removida (no causa la enfermedad) Se inserto el gen de resistencia a tetraciclina en la región del A1 Podía revertir si el gen de tet era removido Se produjo una nueva bacteria transgénica

20 Un plásmido que contiene el segmento clonado del A1 fue cortado con RE Se recircularizó al añadir un XbaI linker Se uso la T4 DNA ligasa Se perdió 183 a.a del total de 194 Se inserto el vector mediante conjugación en la bacteria cargando el gen de tet Ocurre recombinación homologa Se pierde el fragmento extracromosomal Se seleccionaron por sensitividad a tet

21 Una vacuna atenuada molecular es mas segura si se atenúa en mas de un gen Salmonella Fiebre entérita, fiebre tifoidea, envenenamiento por alimentos 3 categorías de genes que pueden ser removidos: Genes biosintéticos Genes regulatorios Genes de virulencia

22 Leishmania (parasito) Forma atenuada al remover el gen de la enzima dihydrofolato reductase-thymidylate synthase La forma atenuada no se puede replicar en macrofagos en cultivo sino se provee timidina Solo persiste por pocos dias en ratones infectados Provee inmunidad

23 Protección contra el parasito fue obtenida

24 Vaccinia virus: virus de DNA de doble hebra Se replica en el citoplasma Tiene los genes de la DNA pol, RNA pol, y enzimas para Cap, metilar y poliadenilar mrna Un gen exogeno puede ser expresado independientemente del hospedero Infecta vertebrados e invertebrados Es bien estable a nivel molecular Genoma es grande y no pose RE Genes tiene que ser insertados por recombinación homologa

25 El gen se clona bajo el control de un promotor de vaccinia y este en medio de el gen de la kinasa de timidina El vector se usa para infectar células animales han sido infectadas previamente con vaccinia que tiene el gen kinase de timidina activo Ocurre recombinación Virus recombinante no produce kinasa de timidina en las células asi que no es sensitiva a bromodeoxyuridina (selección)

26 Mutación espontánea en vaccinia para la kinase de timidina Se inserta marcador de selección neor Mecanismo de producción de Vaccinia recombinante Gen vp37: produce placas Mutante al que se remueve vp37 no produce placas Vector de transferencia Recombinación homolaga transfiere genes a Vac mutante Si virus puede ahora formar placas, contiene transgenes y pierde el gen de selección

27 Ventajas: Vacunas virales recombinantes pueden producir el antígeno en forma activa Se puede replicar en el hospedero, aumenta el efector de la vacuna Desventaja: Puede producir infección en personas inmunocomprometidas Se le puede insertar el gen de IL-2 Aumenta la respuesta de las células T

28 El gen K3L de Vaccinia le da resistencia a Interferon Muy similar a eukaryotic initiation factor (eif-2a) Es fosforilado por la kinasa P1 que es activada por IL Apaga toda la síntesis de proteínas K3L compite con eif-2a Remover K3L debe producir un virus Vaccinia susceptible a Interferon

29 Sensitividad al interferón

30 Razones para vacunas contra bacterias: No todas las bacterias responden a antibióticos Muchas bacterias resistentes Antibióticos tienen que ser refrigeradas No se toman el tratamiento M. tuberculosis: Vacuna atenuada (BCG) de Mycobacterium bovis A causado tuberculosis en inmunocomprometidos No aprobada en USA Se creció Mt en medio líquido y se examinaron 100 proteínas secretadas y purificadas

31 Se inserto gen para hacer BCG mas inmunogénica

32 La flagelina quimérica funcionó correctamente Se produjo inmunidad contra la BTX Se puede utilizar una forma atenuada de la Salmonella Múltiples epítopes

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