Artículo 3 Solución isotónica de Cloruro de Sodio

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1 Banco de levaduras Esta es una serie traducida del original en y publicada en nuestro sitio web con permiso expreso del autor. Artículo 3 Solución isotónica de Cloruro de Sodio En este artículo hablaremos de la segunda técnica para crear bancos de levaduras en casa (o en el laboratorio) que trata acerca de las soluciones isotónicas de cloruro de sodio (o cualquier otra solución estéril). Descripción de la técnica Una forma de almacenar levaduras por largo tiempo es hacerlo en una solución estéril tal como una solución isotónica de cloruro de sodio. Isotónica en este caso refiere a soluciones que tienen la misma presión osmótica que las células mismas. La presión osmótica depende fundamentalmente de la concentración de sal que se encuentra en un líquido. Si se tiene un líquido con una alta concentración de sal, la presión osmótica de esa solución es alta. Por otro lado, el agua destilada (con concentración de sal entre baja y ninguna) tiene una baja presión osmótica. Si dos líquido con diferente presión osmótica están conectados por una membrana, las dos presiones tienen a equilibrarse: el agua con la presión osmótica mas baja pasa la membrana y fluye en la solución con mayor presión osmótica. El agua fluye hasta que los dos potenciales de presión de equilibran. Volvamos al tema. Las células de levadura también tienen membrana que básicamente rodean a toda la célula. Si se almacenan las levaduras en una solución con una alta presión osmótica entonces las células de levadura (en una célula hay muchas sales y otros compuestos orgánicos), las paredes de la célula prácticamente morirán por deshidratación (pérdida de agua). Perder agua no es lo ideal para una célula, basta solamente pensar en los humanos, si el cuerpo pierde agua puede tener graves problemas de la misma forma que una célula. Por otro lado, almacenar levadura en agua destilada puede eventualmente hacer estallar la célula dado que el agua destilada (sin sales) fluirá dentro de la célula (a una solución con una presión osmótica mayor) que tampoco es lo ideal. La clave es prevenir una diferencia de presión osmótica entre la célula de levadura y el líquido que la rodea. Esto se logra utilizando líquidos con la misma concentración de sal que la de la célula de levadura. Si esto se logra, se obtendrá la misma presión osmótica en la célula y en el líquido, esto se llama solución isotónica. Si se disuelven 9 g de cloruro de sodio (sal de mesa) en un litro de agua destilada, se logra una solución isotónica. Para otras sales/compuestos, hay formulas disponibles para averiguar la cantidad necesaria para obtener una solución isotónica. El Cloruro de Sodio esta en todas las cocinas y por que no utilizarlo para armar un banco de levaduras. De ahora en adelante solo nos referiremos a la solución isotónica hecha con Cloruro de Sodio. Fig: 1 Tubo de ensayo con tapa

2 Antes que nada, se debe pensar acerca de un contenedor para la solución que contenga la levadura y la solución de cloruro de sodio. Yo utilizo pequeños tubos de ensayo con tapa de rosca (volumen de aprox. 5 ml) como el mostrado en la Fig 1. Cualquier tubo de estas características puede servir, solamente hay que tener en cuenta la esterilización. Es mejor tener un recipiente sellado para evitar cualquier contaminación. Adicionalmente, cualquier recipiente que pueda ser esterilizado en una olla a presión mucho mejor. Otra forma de hacerlo es utilizar ampollas llenas de solución de cloruro de sodio (Fig. 2). Estas ampollas son usadas en hospitales con frecuencia y pueden ser conseguidas en farmacias. Ignoro si es así en otros países. Solo se necesita una jeringa estéril y una cánula e inyectar la levadura en la ampolla. Listo! Yo utilicé tubos (Fig. 1) inicialmente pero luego seguí con las ampollas dado el volumen que necesitaba. Inicialmente pensé que 5 ml de una solución de levadura no era suficiente para algún propósito. Ahora se, muchas de las ampollas que tengo aun tienen casi el 95% del liquido original. Si usted tiene la misma preocupación, solamente llene tubos adicionales con la misma cepa que utiliza con mas frecuencia. Si considerara volver a trabajar con la solución isotónica nuevamente, probablemente usaría tubos de vidrio de aprox. 5 ml, llenarlos con 45 ml de solución isotónica de cloruro de sodio y esterilizarla en una olla a presión. Con las ampollas será necesario utilizar jeringas y cánulas adicionalmente. Fig. 2 Solución isotónica Material necesario Recipiente para la solución isotónica de cloruro de sodio (por e j. Tubos de vidrio con tapa rosca) Cloruro de Sodio. Sal de mesa común puede servir. Agua destilada Jeringas estériles y cánulas para transferir la levadura en el recipiente Preparación Solución isotónica de Cloruro de Sodio: Disolver 9 g de Cloruro de Sodio (sal de mesa) en 1lt de agua destilada. Dependiendo de la calidad del agua, incluso agua de grifo puede funcionar si es baja en sales. De todas formas, obtenga 1lt de agua destilada si puede. 1lt de solución de Cloruro de Sodio durara por mucho tiempo y para varios tubos. Dependiendo del contenedor: Si puede esterilizar los contenidos, llenarlos con la solución isotónica de cloruro de sodio y esterilizarlos en una olla a presión, o en agua hirviendo por 15 min. Están listos para utilizar. Incluso se

3 pueden esterilizar los tubos y dejarlos a temperatura ambiente por mucho tiempo. Solamente consiga unos cuantos tubos con rosca y su banco de levaduras va a comenzar. Si no puede esterilizar los recipientes (ya sea por que los tubos son de plástico y pueden derretirse durante la esterilización, o no tiene la posibilidad de esterilizarlos) será necesario entonces esterilizar la solución de cloruro de sodio hirviéndola y luego transferirla al recipiente. De todas formas, no olvidar la esterilización del recipiente mismo. Si usted los compra preesterilizados, será suficiente. Si compra recipientes no estériles, desinféctelos de alguna forma. Ya sea utilizando acido Peracético, lavandina o Vodka. Solamente recuerde que desinfección no es lo mismo que esterilización. Algunos microorganismos puede sobrevivir al proceso de desinfección. De todas formas, no recomendaría este método, solamente consiga algunos tubos estériles y todas las precauciones desaparecen. Banco de levaduras Ahora que los tubos están llenos y esterilizados, es tiempo de mandarlas al banco. La forma mas fácil, en mi opinión, es obtener la levadura directamente de la fuente, tal como un paquete de Wyeast activado o un vial de White Labs. Utilizar una jeringa esterilizada y tomar aprox. 1ml de suspensión de levadura por cada 5ml de solución isotónica de cloruro de sodio y transferirla al recipiente con la solución isotónica. Básicamente el procedimiento esta listo. Incluso se puede volcar directamente suspensión de levadura desde el paquete comercial, dentro del recipiente con la solución isotónica, cuidando los aspectos de limpieza necesarios. Lo que funcione mejor. Por otro lado, se puede obtener levadura directamente del Kräusen y transferirla en la solución isotónica. En este estado, las células de levadura son muy viables y vitales. También se puede utilizar levadura cosechada (de botellas, etc.) aunque la viabilidad/vitalidad puede ser un tema a cuidar. Yo recomendaría, en el caso de levadura cosechada, realizar un pequeño starter con la levadura cosechada (aprox ml), decantarlo todo lo posible, y transferir la suspensión de levadura en las soluciones de cloruro de sodio isotónica. Adicionalmente, también se pueden transferir colonias de placas de agar en la solución de cloruro de sodio. Para resumir, básicamente se pueden utilizar varias fuentes de levaduras sanas que tengamos a disposición, solamente hay que mantener la vitalidad/viabilidad de las mismas. No es para nada recomendable almacenar levaduras en mal estado. Fig. 3 Solución isotónica con una levadura Belgian Wheat

4 Almacenamiento Si es posible, almacenar las levaduras en la solución estéril a aproximadamente 6 C. En general, una temperatura baja esta bien, solamente no hay que llevarla al punto de congelación por que probablemente no van a sobrevivir. Luego de un corto período de tiempo van a formar un sedimento en el fondo del recipiente. Reanimación Tomar una muestra de la solución y hacer un starter. Tomar 1 ml del liquido del recipiente con una jeringa estéril (agitar antes de sacar la muestra para volver a poner la levadura en suspensión) y transferirlo a aproximadamente 100 ml de un starter estéril a 10 P (1.040 SG) realizado con extracto seco de malta. Para crear un starter de 10 P (1.040 SG) solamente agregar 10 g de cualquier extracto de malta, algunos nutrientes de levadura y disolverlos en 100 ml de agua y esterilizar todo en una olla a presión. Yo utilizo botellas de 500 ml Schott para este propósito. Cualquier bollón hará el trabajo muy bien, solamente hay que tener la precaución de esterilizarlo en una olla a presión o en agua hirviendo (en esta ultima durante ½ hora al menos). Este es un paso muy importante porque las células tomadas de la solución isotónica de cloruro de sodio van a crecer muy lentamente al principio del proceso. Cualquier contaminación en el starter va a infectar la levadura seguramente. No utilizar grandes starters en este paso del proceso. Permitir que la fermentación avance por algunos días (hasta 7 días si es necesario). Se formará una pequeña capa de levadura. Luego incrementar el volumen hasta 1 lt. Para esto ultimo agregar 900 ml de mosto esterilizado a 10 P (1.040 SG), o transferir el starter de 100 ml con la levadura a un starter de 900 ml del mismo tipo de mosto mencionado. Con este starter de 1 lt., obtendremos la misma cantidad de levadura que hay en un paquete de Wyeast (100E9 células). Esto puede variar dependiendo de la cepa utilizada. Se puede utilizar una cámara de conteo para determinar la concentración exacta y cantidad de células aproximadas, o estimar la cantidad de células del volumen obtenido. Mis experiencias con este método Yo utilizaba este método y todas las levaduras en mi banco de levaduras están/estuvieron en soluciones de cloruro de sodio en algún momento. Mis cepas mas viejas se encuentran en ampollas desde el verano de 2010 y puedo reanimarlas sin problemas en el verano de En mi experiencia, las levaduras pueden ser almacenadas por este método por al menos dos años sin problemas (refrigeradas a 6 C). Esto es así para diferentes cepas. De todas formas, yo he perdido algunas cepas debido a infecciones. Ventajas El método es muy fácil No tiene mantenimiento No es necesario mucho equipamiento Se mantiene viable por mas de 2 años (a 6 C) Desventajas Se necesita espacio La contaminación es invisible No mucho tiempo de almacenamiento Almacenamiento de mezcla levadura/bacteria? Este es realmente un método muy económico y eficiente para almacenar levaduras y me llevó mucho tiempo encontrarle desventajas. Yo personalmente no almaceno mas levaduras con este método por que, de las desventajas, la que mas me afecta es la cantidad de espacio necesario para almacenar los recipientes. Tenga en cuenta que estoy hablando de aprox. 40 cepas diferentes en mi caso y mi refrigerador esta básicamente lleno de recipientes. Otra desventaja es la observación de la contaminación. En otras técnicas (tales como las placas de agar) resulta fácil la identificación de estas contaminaciones.

5 De todas formas, no espere tener contaminación alguna si trabaja en ambientes lo mas estériles posible y cuida bien los procesos. La única pregunta pendiente es cuanto tiempo se pueden almacenar estas levaduras en este medio Por mi experiencia, las levaduras pueden ser almacenadas por un máximo de 2 años, sin ningún tipo de mantenimiento o trabajo. Fig: 4 Banco de Levaduras de Eureka Brewing Otra desventaja de este método es almacenar una mezcla de levaduras/bacterias. Almacenar estas mezclas con este método puede cambiar el ratio entre las levaduras y bacterias mezcladas, que por otro lado, no existe un método seguro de almacenar estas mezclas. Incluso si pueden manejarse para mantener el ratio entre las diferentes cepas constante durante el almacenaje, durante la reanimación los ratios pueden cambiar nuevamente. Si usted quiere almacenar mezclas, la única forma de almacenar mezclas, es primeramente determinar el ratio de las diferentes cepas presentes y luego separarlas y almacenarlas separadamente. Luego crear la mezcla desde los recipientes. Mucho trabajo y esto incluso va mas allá del alcance de este trabajo. Para resumir, hacer un banco de levaduras en soluciones estériles es un método fácil y económico. No solamente es menos laborioso que almacenar en placas de agar, sino también mucho mas barato. Desde mi punto de vista, este es un método donde se pueden almacenar cepas por al menos dos años en una forma fácil y relativamente con poco trabajo. Si yo tuviera que recomendar una técnica de banking recomendaría esta misma. Adicionalmente se pueden intercambiar fácilmente con otros cerveceros. En el próximo articulo vamos a tratar el otro método para armar nuestro banco de levaduras: pendientes de agar. Sigan en contacto!

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