USO DE Trichoderma sp. PARA EL BIOCONTROL DE LA PUDRICIÓN RADICULAR EN CEBOLLA

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1 USO DE Trichoderma sp. PARA EL BIOCONTROL DE LA PUDRICIÓN RADICULAR EN CEBOLLA RESUMEN Lourdes Cervantes-Díaz 1 Jairo Venus Moreno Castro 2 Armando Pulido-Herrera 1 Carlos Ceceña Durán 1 Daniel González Mendoza 1 Onécimo Grimaldo Juárez 1 Arcenio Gutiérrez Estrada 3 La cebolla Allium cepa (L.) es un cultivo de importancia económica para el estado de Baja California. Recientemente es afectado por la enfermedad conocida como pudrición radicular causada por los hongos Fusarium oxysporum y Pyrenochaeta terrestris. El efecto antagónico de Trichoderma sp. cepa nativa ThVT1 sobre el crecimiento de los hongos Fusarium oxysporum cepa 72 y Pyrenochaeta terrestris cepa 16 fue evaluado in vitro e in vivo y directamente en semilla de cebolla var. Kristal. La cepa de Trichoderma presentó porcentajes de inhibición en un 70% para F. oxysporum y un 58.3% para P. terristris en pruebas duales in vitro, asimismo, presentó capacidad antagónica de tipo hiperparasítica, colonizando toda la superficie del medio y reduciendo la colonia del patógeno. En condiciones in vivo se observó que las plantas de cebolla presentaron menor número de sitios de infección, inducción del crecimiento de raíces e incremento del peso seco con respecto a los tratamientos inoculados por separado con F. oxysporum, P. terrestris y testigo. No se encontró que Trichoderma favoreciera la germinación de las semillas; sin embargo, promovió el incremento en el peso seco de las plántulas. PALABRAS CLAVE: Antagonista, Fusarium oxysporum, Pyrenochaeta terrestris, control biológico. INTRODUCCIÓN La cebolla Allium cepa (L.), es una de las hortalizas con mayor demanda en el mundo debido a sus cualidades que enriquecen el sabor de los alimentos. Es una especie que cuenta con diferentes variedades adaptadas a los países y sus climas donde su cultivo es de importancia económica. En América, los principales países productores son México, Ecuador, Jamaica y Paraguay (InfoAgro, 2009). Para México, es un cultivo importante por el consumo y recursos generados por su exportación. En el 2008, la superficie cultivada en México fue de aproximadamente 48, 000 ha con una producción de 1, 300,000 t, obteniéndose divisas por $ 4, 272, 248,900 y favoreciendo la generación de empleos (61 jornales por hectárea) (SAGARPA- SIAP, 2009). Entre los diversos patógenos que afectan a la cebolla se tienen a las bacterias, nematodos, virus y hongos (Summer et al., 1997; CAB-International, 2005). La pudrición radicular causada por los hongos Fusarium oxysporum y Pyrenochaeta terrestris es la enfermedad más importante que afecta al cultivo de cebolla en Baja California, principal estado productor; donde se reportan 1 Instituto de Ciencias Agrícolas, Universidad Autónoma de Baja California. Ejido Nuevo León, Valle de Mexicali. C.P Correspondencia: lourdescervantesdiaz@yahoo.com. 2 Universidad Autónoma de Sinaloa, Facultad de Agronomía, Juan José Ríos, Ahome, Sinaloa, México. 3 Facultad de Ciencias Agronómicas, Universidad Autónoma de Chiapas. Villa Flores, Chiapas.

2 incidencias del 80%, que repercuten en la calidad y producción de esta hortaliza (Pulido et al., 2008). Generalmente el control de las pudriciones radiculares se realiza de manera unilateral con fungicidas; lo que incrementa significativamente los costos de producción, aunado al impacto que ocasionan al ambiente; por lo que el biocontrol de hongos fitopatógenos habitantes del suelo constituye una alternativa (Whipps y Lumsden, 2001). Actualmente el biocontrol ocupa un lugar importante dentro de las prácticas de manejo de enfermedades de las plantas causadas por los patógenos fúngicos del suelo, principalmente de los géneros Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium, Phytophthora, Fusarium y Pyrenochaeta (Papavizas,1986). Las especies del genero Trichoderma son las antagonistas más utilizadas para el control de enfermedades de plantas producidos por hongos, debido a características importantes como: facilidad para ser aisladas y rápido crecimiento en diferentes medios y sustratos; competencia por nutrimentos, micoparasitismo y producción de metabolitos antifúngicos, enzimas hidrolíticas y sustancias promotoras del crecimiento vegetal (Papavizas et al., 1982; Stefanova, 1996). Diversos autores han utilizado especies de Trichoderma para el biocontrol de enfermedades fitopatògenas. Mohamed et al. (2004), encontraron que T. harzianum tuvo actividad biofungicida para el control de Phytophthora capsici en chile; asimismo se ha encontrado que en plántulas de lechuga cepas de Trichoderma disminuyeron significativamente la incidencia de Rhizoctonia solani, además de incrementar el peso y altura de las plantas (Yossen et al. 2003). En frijol, se demostró que inmersiones de semillas con Trichoderma spp., antes y después de la siembra, fueron efectivas para el control de hongos patógenos de la semilla y del suelo (González et al, 2005). Suárez et al. (2008), encontraron que hubo antagonismo in vitro al utilizar los aislamientos nativos y comerciales de T. harzianum sobre F. solani en el cultivo de maracuyá. En otro estudio se evaluó el efecto de Trichoderma sobre la incidencia de la pudrición carbonosa por M. phaseolina en plántulas de ajonjolí, evaluando en tres formas la aplicación de Trichoderma: 1) directa a la semilla, 2) con gránulos de arcilla y 3) con granos de arroz. La evaluación se realizó durante tres años en una parcela inoculada artificialmente con 400 esclerocios de M. phaseolina por gramo de suelo; sin embargo, no se presentó efecto antagónico de Trichoderma sobre la incidencia de la pudrición carbonosa, probablemente a las características inherentes del suelo que no permitieron el establecimiento del antagonista (Cardona y Rodríguez, 2006). Por su parte, Bravo et al. (2008), evaluaron también tres métodos de inoculación de Trichoderma para el control de S. rolfsii en plántulas de cebolla: a) Trichodema aplicado al suelo junto con S. rolfsii y siembra de cebolla, b) Trichoderma aplicado a la semilla de cebolla y posteriormente la siembra junto con S. rolfsii y c) Trichoderma aplicado al suelo 20 días antes de aplicar S. rolfsii y siembra de cebolla. Los autores encontraron que en el tercer método de inoculación hubo menor incidencia de S. rolfsii y un crecimiento significativo de las plántulas (altura de planta, peso fresco y seco, grosor, tamaño y peso fresco de bulbo). Por otra parte, se tiene conocimiento que el éxito del control biológico radica en obtener y utilizar microorganismos que sean aislados en los lugares nativos donde se presente la enfermedad, ya que para controlar un hongo fitopatógeno se debe considerar la variabilidad del aislamiento del antagonista en términos de su adaptación a las condiciones bióticas y abióticas específicas (Harman, 2006). Con base a lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el grado de antagonismo de Trichoderma spp., sobre Fusarium oxysporum y Pyrenochaeta terrestris en condiciones in vitro e in vivo, aislados de la zona productora de cebolla del Valle de la Trinidad, Baja California. MATERIALES Y METODOS La investigación se realizó en el Laboratorio de Fitopatología del Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma de Baja California, Campus Mexicali.

3 Material vegetal Se utilizó semillas de cebolla de la variedad Kristal (Nunhems ), germinadas en cajas de Petri que contenían papel absorbente humedecido con agua destilada estéril y después fueron colocadas en una cámara de ambiente controlado (Biotronette Mark III, Lab.Line Instruments, Inc. ) a 28 C y fotoperiodo 12:12 hrs. Diez días después de su germinación se trasplantaron en macetas de 250 cm 3 de capacidad (tres plántulas por maceta) que contenían una mezcla de arena y peat moss (2:1) esterilizada en autoclave a 120 ºC durante dos horas en dos días consecutivos. Las macetas se mantuvieron en la cámara de ambiente controlado y a los diez días después del trasplante se realizaron los tratamientos. Material fúngico Se evaluaron los hongos patogénicos Fusarium oxysporum cepa 72 y Pyrenochaeta terrestris cepa 16, aislados de raíces de plantas de cebolla var. Aspen establecidas en el valle de la Trinidad, Baja California, México. La identificación y descripción de los patógenos se realizaron de acuerdo a las claves taxonómicas correspondientes y la patogenicidad de ambos hongos fue confirmada experimentalmente mediante postulados de Koch (datos no mostrados). Como antagonista se utilizó un aislamiento de Trichoderma cepa ThVT1 obtenido a partir de suelos (rizosfera y rizoplano) sembrados con cebolla, ubicados en el valle de la Trinidad, Baja California. Pruebas de antagonismo in vitro Para los ensayos de biocontrol se realizaron pruebas in vitro en cultivo dual papa-dextrosa-agar (PDA) entre los patógenos F. oxysporum y P. terrestris y la cepa de Trichoderma. Se utilizaron discos de PDA de 0.5 mm de diámetro con micelio del patógeno, colocándolo en un extremo de la caja de Petri. Debido al lento crecimiento del patógeno, 3 días después se sembró el micelio del antagonista (disco de PDA de 0.5 mm) en el punto equidistante respecto al patógeno. Los testigos consistieron de micelio de los patógenos y del antagonista, cultivados por separado en cajas Petri con medio PDA. Las cajas Petri se incubaron a 28º C + 3ºC durante ocho días. Para medir el efecto inhibitorio del hongo antagónico hacia los patógenos, se registró las medidas del diámetro de las colonias cada 24 horas hasta su enfrentamiento y la formación de un halo de inhibición entre las colonias. Se consideraron cuatro repeticiones por cada confrontamiento y para los testigos. La evaluación final fue considerada a los ocho días, cuando el patógeno cubrió el 50% de la caja de Petri en el tratamiento testigo (sin hongo antagonista). Los porcentajes de inhibición de crecimiento radial se calcularon con la fórmula propuesta por Correa et al. (2007). Adicionalmente se comparó la cepa con respecto a la capacidad antagonista, de acuerdo con la escala propuesta por Bell et al. (1982). Los datos obtenidos en las evaluaciones se sometieron al análisis de varianza (ANOVA) y las medias se compararon por la prueba de Tukey (α 0.5). Pruebas de antagonismo in vivo Preparación de la suspensión de esporas de Trichoderma y patógenos. Se preparó una suspensión de esporas de Trichoderma, utilizando cultivos de 5 a 7 días desarrollados en cajas Petri con PDA. Se utilizo 1ml de agua destilada estéril con azúcar al 3% para el raspado de la caja con una varilla de vidrio estéril. La solución que resultó de este lavado se suspendió en 7 ml de agua destilada estéril. La suspensión se colocó en tubos estériles a partir de los cuales se prepararon las concentraciones requeridas con ayuda de un hematocitòmetro (AO Brigth-Line). Se utilizó una concentración de esporas de 5.5x10 8 UFC.

4 La preparación del inoculo con F. oxysporum y P. terrestris fue similar, a excepción que el raspado se realizó con agua destilada estéril y la concentración de inoculo fue de 2x10 8 UFC y de 3x10 8 UFC para cada hongo, respectivamente. Las plántulas de cebolla de 10 días de trasplante se inocularon con un mililitro de la suspensión de Trichoderma y a las 24 horas después con 1 ml del patógeno. Se consideraron siete tratamientos con cinco repeticiones cada uno (tres plántulas por repetición) como a continuación se describen: 1) Trichoderma; 2) Trichoderma + F. oxyporum; 3) Trichoderma + P. terrestris; 4) F. oxysporum; 5) P. terrestris; 6) Trichoderma + F. oxyporum + P. terrestris, 7) testigo. A los 14 días después de la inoculación con los respectivos patógenos se evaluó el número de sitios de infección, severidad, longitud de tallo y raíz, peso fresco y seco. Los sitios de infección fueron evaluados como un estrangulamiento rodeado por necrosis sobre la superficie de la raíz, utilizando un microscopio óptico. La severidad se evaluó cualitativamente describiendo el porcentaje de raíz con necrosis de coloración rosa (asociada a P. terrestris) o café (por F. oxisporum) en cada plántula. Tratamiento de las semillas de cebolla con la suspensión de Trichoderma Se utilizaron semillas de cebolla de la variedad Kristal (Nunhems ), que se introdujeron en la suspensión de Trichoderma preparada en agua destilada estéril-azúcar al 3% durante 20 minutos, se retiraron y se colocaron sobre papel absorbente esterilizado para retirar el exceso de agua. El control consistió en sumergir semillas en una solución de agua destilada estérilazúcar al 3%. La semilla se sembró en una charola desinfectada de 288 orificios conteniendo arena-peat moos (2:1) esterilizados. Se sembraron 100 semillas tratadas con Trichoderma y 100 con agua azucarada. La charola se mantuvo en una cámara de ambiente controlado a 28 C y fotoperiodo 12:12 hrs, se regaron con agua destilada estéril cada 24 horas. La duración del experimento fue de 25 días. Cada 5 días se evaluó el porcentaje de germinación y a los 5 y 10 días posteriores a la germinación se evaluó el peso fresco y seco. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados del desarrollo de cada uno de los aislamientos evaluados en condiciones in vitro se presentan en el Cuadro 1. Se observaron diferencias entre el desarrollo de Trichoderma y los patógenos a partir de las 48 horas de incubación. La cepa de Trichoderma cubrió el 100% de la caja Petri a las 144 h. Para la cepa de F. oxysporum, el 100% de crecimiento fue a las 168 h, mientras que la cepa de P. terrestris cubrió menos del 50% de la superficie (2.4 cm) en el mismo tiempo de incubación (Cuadro 1) Cuadro 1. Crecimiento lineal de Trichoderma sp., y de los patógenos Fusarium oxisporum y Pyrenochaeta terrestris, desarrollados en medio papa-dextrosa-agar a 28 ºC. Cepas Crecimiento lineal (cm) 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h Trichoderma cepa ThVT F. oxisporum (cepa 72) P. terrestris (cepa 16) Con respecto a la confrontación in vitro por el método de cultivo dual de Trichoderma frente a Fusarium oxysporum y Pyrenochaeta terrestris los resultados se presentan en el Cuadro 2 y Figura 1. Se observó que la cepa de Trichoderma inhibió el crecimiento de F. oxysporum a partir de las 72 h de exposición en un 37 % hasta un 70% a las 168 h de exposición (siete días). Con

5 respecto a P. terretris a las 96 h se presentó un 37 % de inhibición, incrementando a 58 % a los 7 días de confrontación. Asimismo presentó una capacidad antagónica de tipo hiperparasítica ya que Trichoderma colonizó toda la superficie del medio y redujo la colonia del patógeno (clase 1) de acuerdo con la clasificación de Bell y colaboradores (1982) (Figura 1). Cuadro 2. Porcentaje de inhibición del crecimiento radial de Fusarium oxisporum y Pyrenochaeta terrestris en cultivo dual con Trichoderma sp en medio papa-dextrosa-agar después de 168 horas (h) de incubación a 28 ºC. Porcentaje de inhibición cada 24 horas Cepas Trichoderma + F. oxysporum Trichoderma + P. terrestris Figura 1. Confrontación de Fusarium oxisporum (izquierda) y Pyrenochaeta terrestris (derecha). Se observó inhibición del crecimiento vegetativo de ambos patógenos en presencia de Trichoderma en el medio papa-dextrosa-agar. Trichoderma realizó hiperparasitismo, invadió la superficie de la colonia de los patógenos y esporuló sobre las mismas. En el Cuadro 3 se presentan los resultados del estudio in vivo de la cepa de Trichoderma como agente de biocontrol contra Fusarium oxisporum y Pyrenochaeta terrestris en plántulas de cebolla. Cuadro 3. Resultados del estudio in vivo de Trichoderma ThVT1 contra Fusarium oxisporum y Pyrenochaeta terrestris en plántulas de cebolla var. Kristal a los 14 días después de inoculación (DDI) con los respectivos patógenos. Tratamiento 14 DDI 1 Sitios de infección % raíz dañada Long tallo 2 Long. raíz 2 No. de raíces Peso Fresco 3 Peso seco 3 1-Trichoderma 0 b* 0 b 9 a 5.1 a 3.0 a a 0.015a 2-Trichoderma + Fusarium oxysporum 0.8 ab 40 ab 7.9ab 4.3 a 2.4 a abc 0.011abc 3-Trichoderma + Pyrenochaeta 0.4 b 13 b 7.5ab 4.1 a 2.2 a abc

6 terrestres 4-F. oxysporum 1.2 ab 47 ab 6.5ab 2.2 a 2.2 a bc 5-P. terrestres 2.0 a 67 a 4.5 b 2.1 a 2.0 a c 6-Trichoderma b 13 a 8.7a 4.2 a 2.6 a F. oxysporum + abc P. terrestris c 0.008bc 0.005c 0.012abc 7-Testigo 0 b 0 b 8.6a 4.2 a 2.4 a ab 0.013ab 1 DDI= Días después de la inoculación. 2 En centímetros (cm). 3 En gramos (g). *Datos con la misma letra en cada columna son iguales estadísticamente (Tukey, p=0.05). Se encontró que el tratamiento 5 inoculado solo con P. terrestris presentó significativamente más sitios de infección con respecto al tratamiento 3 (Trichoderma + P. terrestris). Para el caso del tratamiento con F. oxysporum no se encontró diferencias significativas con respecto al inoculado previamente con Trichoderma (tratamiento 2); sin embargo, se presentó disminución de los sitios de infección (0.8). Asimismo, el tratamiento inoculado con P. terrestris tuvo mayor porcentaje de raíces dañadas (67%) disminuyendo a 13 % en presencia de Trichoderma. Además, la longitud de tallo y el peso fresco y seco en plántulas inoculadas con P. terrestris y sin Trichoderma fueron menores en relación a los demás tratamientos. No se presentaron diferencias significativas en la longitud y número de raíces entre tratamientos. Los resultados anteriores concuerdan con diversos trabajos realizados donde se plantea que cepas de Trichoderma son efectivas para su uso en el biocontrol de diversos patógenos (Papavizas, 1986; González et al, 2005; Suárez et al; (2008), y demuestra la potencialidad de la cepa en estudio para el control de P. terrestris y F. oxysporum, por las Tratamientos Porcentaje de germinación Peso seco Trichoderma ThVT Control características de competencia e hiperparasitismo que presentó. Las plántulas de cebolla provenientes de semillas inoculadas con Trichoderma presentaron menor porcentaje de germinación (55%); sin embargo, el peso seco fue mayor ( g) con respecto al control ( g) (Cuadro 4). Lo anterior sugiere que hubo mayor absorción de nutrimentos como se encuentra documentado en experimentos realizados por Bravo y colaboradores (2008) en el cultivo de cebolla. Cuadro 4. Efecto de Trichoderma sobre la germinación y la estimulación del crecimiento de cebolla var. Kristal a los 5, 10, 15, 20 días después de germinación. Datos referidos al porcentaje de germinación de 100 semillas. 1 Días después de la germinación CONCLUSIÒN Por su acción antagónica in vitro y pruebas in vivo puede considerarse que aislamientos nativos de Trichoderma en suelos sembrados con cebolla en el valle de la Trinidad, serían agentes promisorios en el control biológico de la pudrición radicular en el cultivo de cebolla ocasionada

7 por F. oxysporum y P. terretris. Futuros estudios se requieren para el aislamiento de cepas nativas de Trichoderma de la zona de interés y su potencial en el control biológico. AGRADECIMIENTOS Al Programa de Mejoramiento del Profesorado (PROMEP, proyecto 9073) por el financiamiento parcial para realizar esta investigación y apoyar la participación en el Verano de la Investigación Científica del Pacífico, Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del Pacífico (DELFIN). LITERATURA CITADA Bravo, L.L., Ruíz-Rosales, A. y Guijón-López, C Evaluación de tres métodos de inoculación de Trichoderma harzianum para combate de Sclerotium rolfsii y desarrollo de la cebolla bajo condiciones de vivero. X Congreso mundial de Trichoderma y Gliocadium. San José de Costa Rica. 21 al 23 de mayo. Bell, D.K., Wells, H.D. and Markham, C.R In vitro antagonism of Trichoderma species against six fungal plant pathogens. Phytopathology. 72: CAB-International, Crop protection compendium. Ed. Wallingford, UK. 270 p. Cardona, R. y Rodríguez, H Efecto del hongo Trichoderma harzianum sobre la incidencia de la enfermedad pudrición carbonosa en ajonjolí. Revista de la Facultad de Agronomía-LUZ. España. 23: Correa, S. Mello, M., Ávila, R.Z., Minare, B.L., Padua R.R. y Gomes, D Cepas de Trichoderma spp. para el control biológico de Sclerotium rolfsii Sacc. Fitosanidad. 11: 3-9. González, M., Castellanos, L., Ramos, M. y Pérez, G Efectividad de Trichoderma spp. para el control de hongos patógenos de la semilla y el suelo en el cultivo del frijol. Plan Diseases. 12: Harman, G.E Overview of mechanims and uses of Trichoderma spp. Phytopathology. 96: InfoAgro, El cultivo de la cebolla de Julio del Mohammed, E., Pérez, S.C., Ahmed, S. A., Requena, M. E. y Candela, M. E Trichoderma harzianum como biofungicida para el biocontrol de Phytophthora capsici en plantas de pimiento (Capsicum annum L.). Anales de Biología. 26: Papavizas, G.C Trichoderma y Gliocadium: biology, ecology and the potential for biocontrol. Annual Review of Phytopathology. 23: Papavizas, G., Lewis J. y Abd-Elmioty T Evaluation of new biotypes of Trichoderma harzianum for tolerance to benomyl and enhanced biocontrol capabilities. Phytopathology. 72:

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