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1 MÉTODOS DE ESTUDIO PARASITOLOGÍA Y MICOLOGÍA Dpto. Parasitología y Micología CEFA

2 IMPORTANCIA Diagnosticar patologías propiciando su prevención y/o detección precoz (enteroparasitosis). Promover el diagnóstico diferencial entre posibles patologías, dando oportunidad de tratamiento específico (infecciones: parasitarias, micóticas, bacterianas). Evaluación de una enfermedad ya instalada contribuyendo a escoger la mejor conducta terapéutica (hidatodisis). Estimar actividad o recurrencia de una patología (toxoplasmosis).

3 FASES DEL PROCESO DE LABORATORIO PREANALITICA: es la que insume mayor tiempo, solicitud, obtención, almacenamiento, transporte, recepción y la que está sujeta a mayor porcentaje de errores. ANALITICA: corresponde a la realización del procedimiento diagnóstico. Incluye validación de las técnicas, calibración de equipos, ejecución de controles de calidad, etc. POSANALITICA: Cálculos, interpretación de resultados, validación, emisión del informe.

4 METODOS DIRECTOS Son aquellos que ponen en evidencia el agente o sus formas evolutivas, fragmentos, antígenos, ADN, etc.

5 MÉTODOS DIRECTOS O PARASITOLÓGICOS Son los que permiten visualizar directamente parásitos u hongos en un material patológico, o aislarlos del mismo. Los parásitos y hongos pueden ser vistos estudiando el material en fresco o mediante coloraciones u otros artificios.

6 MÉTODOS DIRECTOS Los materiales pueden ser tratados previamente, para concentrar y/o mejorar la visualización de parásitos y hongos en ellos. EJEMPLOS Coproparasitario: incluye limpieza de la suspensión de materias fecales y enriquecimiento por centrifugación. Tratamiento de expectoraciones con soluciones cáusticas (reblandece el mucus y aclara las preparaciones).

7 MÉTODOS DIRECTOS EXAMEN EN FRESCO El material se coloca sobre una lámina portaobjetos, montado en algún medio líquido o no, cubierto con una laminilla, para su observación al microscopio. Los líquidos de montaje (solución salina fisiológica, hidróxido de sodio o potasio 10-20%, lactofenol-azul algodón, lugol, glicerina tamponada) facilitan la observación microscópica evitando distorsiones de la luz, reblandeciendo el material y/o aumentando el contraste de los objetos buscados.

8 EXAMEN EN FRESCO Quistes de E.histolytica/dispar Huevo de A.aegypti C. neoformans Larva S.stercoralis

9 COLORACIONES COLORACIONES PANÓPTICAS: Giemsa, May Grunwald- Giemsa, hematoxilina eosina, otras coloraciones hematológicas (frotis o cortes histológicos). HE GIEMSA Quiste tisular de T.gondii Corte histológico. Candida spp. Frotis. H. capsulatum Corte histológico. Gránulo actinomicótico. Frotis. Pseudoquiste T. gondii.

10 COLORACIONES ESPECÍFICAS Ziehl-Neelsen, Kinyoun (ácido-alcohol resistencia) Gomori, methenamino plata (pared de los hongos) Tricrómica (protozoarios entéricos, microsporidios). Hematoxilina férrica (membrana, núcleos y otros componentes de protozoarios).

11 CULTIVOS I MEDIOS GENERALES Sirven para el aislamiento primario de una variedad de agentes Pueden ser modificados con el agregado o cambio de algún componente para darle mayor especificidad EJEMPLOS Sabouraud, para hongos NNN, para protozoarios hemoflagelados

12 CULTIVOS II MEDIOS SELECTIVOS Sirven para el aislamiento de un agente o grupo de agentes determinados Tienen una formulación muy bien definida EJEMPLOS DTM, para dermatofitos LIT: para tripanosomas

13 TÉCNICAS DE AISLAMIENTO POR INOCULACIÓN En animales de experimentación. Excepcional (aunque es necesario frente a determinados agentes de difícil identificación o aislamiento por otros medios, ej: Toxoplasma gondii en líquido amniótico) Exige seguir rigurosas normas de bioética, bioseguridad y calidad operacional.

14 DETECCIÓN DE OTROS COMPONENTES PARASITARIOS Mediante diversas técnicas también se puede evidenciar: Antígenos. Ácidos nucleicos. Otras moléculas.

15 TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS DIRECTAS

16 DETECCIÓN DE ANTÍGENOS

17 ÁCIDOS NUCLEICOS

18 MÉTODOS INDIRECTOS INMUNOLÓGICOS Son los que permiten suponer la presencia de parásitos u hongos en el organismo, mediante el estudio de la respuesta del hospedero (producción de Anticuerpos específicos, reacciones de hipersensibilidad tardía, producción de linfoquinas, etc.).

19 TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN EN GEL DE AGAR

20 TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN Aglutinación directa: Suspensiones de parásitos enteros son enfrentadas a sueros de pacientes. Los Ac (Y) presentes aglutinan los parásitos, formando acúmulos consistentes. Y Y Aglutinación de partículas (látex, betonita, carbón,etc.): Suspensiones de partículas inertes, con su superficie cubiertas de Ag parasitarios, son enfrentadas a sueros de pacientes. Los Ac presentes aglutinan estas partículas, formando acúmulos consistentes. Y Y Y

21 TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN

22 TÉCNICAS DE MARCADO DE LA REACCIÓN Ag-Ac Ac

23 TÉCNICAS DE MARCADO DE LA REACCIÓN Ag-AcAc

24 SEGÚN LA FINALIDAD DEL ESTUDIO Técnicas de screening: utilizadas para estudio de grandes poblaciones. Técnicas confirmatorias: utilizadas para confirmar un diagnóstico en forma específica.

25 CLASIFICACIÓN Técnicas Inmunológicas 1. CUALITATIVOS: positivos o negativos 2. CUANTITATIVOS: miden la concentración del Ac a estudiar.

26 CUANTITATIVOS TÍTULOS: máxima dilución del suero problema qu arroja un resultado positivo (Ej: 1/16; 1/128; 1/2048) UNIDADES PREDETERMINADAS: cuando el valor obtenido como resultado es comparado a un patrón predeterminado de densidad óptica, fluorescencia, luminiscencia o concentración conocida de Ac específicos, que expresa el punto de corte de la técnica (cutoff o valor límite que diferencia positivos y negativos) (Ej: UI/ml; Index Value; MIU/ml; OD; etc.)

27 COMPORTAMIENTO DE LAS TÉCNICAS SEROLÓGICAS I DESDE EL PUNTO DE VISTA ANALÍTICO SENSIBILIDAD: expresa la capacidad de la técnica para detectar las menores concentraciones posibles de los anticuerpos (o antígenos) buscados. ESPECIFICIDAD: expresa la capacidad de esa técnica para diferenciar los anticuerpos específicos (o antígenos) buscados de otros presentes en el material en estudio.

28 COMPORTAMIENTO DE LAS TÉCNICAS SEROLÓGICAS II DESDE EL PUNTO DE VISTA CLÍNICO SENSIBILIDAD: expresa la capacidad de la misma para diagnosticar casos positivos en el conjunto de personas estudiadas. ESPECIFICIDAD: expresa, la capacidad de determinar resultados verdaderos.

29 AUTOMATIZACIÓN Existen equipos electrónicos, que permiten la automatización de los procedimientos y el análisis computacional de los resultados. La lectura y medida de la [ Acs-Ag Ag ] se hace mediante colorímetros, fluorómetros, fotómetros, etc., Facilitando la padronización y reproducibilidad de las técnicas, mayor precisión y registro de resultados, mejor cuantificación y valoración de los mismos. Disminuye los errores y permite un mejor control de calidad.

30 EJEMPLO Cono fase sólida y pipeteo Tira Buffer lavado Substrato Muestra Diluyente Conjugado photodiodo REACCION INMUNOLOGICA REACCION ENZIMATICA

31 CUIDADOS PARTICULARES ETAPA PREANALÍTICA: registro de datos, recolección, preparación y conservación de la muestra... ETAPA ANALÍTICA: manejo de la muestra, bioseguridad, calidad operacional, control de calidad interno y externo... ETAPA POSTANALÍTICA: registro, interpretación y validación de los resultados, expresión de los resultados, expresión de los valores de referencia...

32 PREGUNTAS?

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