ACTUALIZACIÓN EN DENGUE Y CHIKUNGUNYA

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1 ACTUALIZACIÓN EN DENGUE Y CHIKUNGUNYA Diagnóstico de las infecciones por DENV y CHIKV María Gabriela Barbás Bioq. Esp.en Virología Jefa del Servicio Bioquímico Laboratorio Central de la Provincia de Córdoba

2 Complejo Dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4) E Familia: Flaviviridae Genero:Flavivirus ARBOVIRUS Partícul viral M C RNA Un serotipo suele ser dominante en una región por 2-4 años, luego declina su prevalencia y otro serotipo/s emerge para reemplazar al anterior DENV2 6 genotipos DENV3 4 genotipos DENV1 5 genotipos DENV4 2 genotipos

3 Viremia y Cinética de Anticuerpos IgM e IgG en Infecciones por Virus Dengue Viremia AgNS1 IgM IgG(2º) IgG(1º) // >90 Días Inicio Síntomas Métodos Directos Detección del agente viral RT-PCR Métodos Indirectos

4 TECNICAS de DIAGNOSTICO PARA DENV TECNICAS DIRECTAS Detección de Antígenos. Detección de Genoma Viral. Aislamiento Viral. TECNICAS INDIRECTAS ELISA IgM. ELISA IgG. IHA. Neutralización en Cultivos Celulares (considerada técnica de referencia). Técnicas de screening Técnicas confirmatorias

5 Nested RT-PCR Dengue qrt-pcr Dengue

6 Nueva Herramienta Diagnóstica RT- PCR en Tiempo Real para DENV (CDC) Diseño de nuevas sondas y primers basados en secuencias actuales ( ). Amplificación en distintas regiones del genoma para cada uno de los serotipos. Identificación de los serotipos. Incluye control interno para realizar el ensayo. Permite el procesamiento de un mayor número de muestras en menor tiempo en comparación a RT-PCR convencional.

7 Detección del Antígeno NS1 del DENV Test de ELISA comercial NS1: Glicoproteína No Estructural Puede detectarse hasta el día 13 No determina Serotipo Viral Se plantea su utilización como técnica de screening en muestras tempranas

8 Detección de Anticuerpos IgM Fácil manejo Menor costo Detección de infecciones recientes Posibilidad de procesar un gran número de muestras No identifica serotipo IgM no detectable en un porcentaje de infecciones secundarias Persistencia de IgM Cruces serológicos Clasifica a los casos como PROBABLES

9 ALGORITMO DIAGNOSTICO El algoritmo diagnóstico dependerá del contexto epidemiológico local 1.- Áreas SIN CIRCULACIÓN confirmada de DENV 2.- Áreas CON CIRCULACIÓN confirmada de DENV

10 Se plantea la utilización de un ALGORITMO SECCIONADO para aumentar la Sensibilidad del Diagnóstico de DENV Temporada Días Evolución 4-6 Días Evolución 6 Días Evolución NS1 RT-PCR Aislamiento NS1 RT-PCR /Aislamiento IgM IgM

11 (+/+) CASO CONFIRMADO 0-3 Días de Evolución PCR y AgNS1 (1) (-PCR/+AgNS1) CASO PROBABLE (-/-) CASO SOSPECHOSO Pedir 2 muestra con más de 6 días de evolución y pasar a (3) (+PCR/+IgM) CASO CONFIRMADO MUESTRA DE SUERO 4-6 Días de Evolución PCR o AgNS1 e IgM (2) (+AgNS1/+IgM) CASO PROBABLE (-PCR o AgNS1/+IgM) CASO PROBABLE (-/-) CASO SOSPECHOSO Pedir 2 Muestra entre 10 y 15 días para realizar NT Pedir 2 muestra con más de 6 días de evolución y pasar a (3) Más de 6 Días de Evolución IgM (3) (+) CASO PROBABLE Pedir 2 Muestra entre 10 y 15 días para realizar NT ALGORITMO DENGUE TEMPORADA (-) NEGATIVO: si el cuadro clínico fuera muy característico de dengue, se recomienda la toma de una 2 muestra para detección de IgG.

12 6 6 En un contexto epidemiológico de CIRCULACIÓN AUTÓCTONA DE DENGUE CONFIRMADA EN UN ÁREA DETERMINADA, aquellos casos que se estudien por laboratorio DEJAN DE DIFERENCIARSE ENTRE CASOS PROBABLES Y CASOS CONFIRMADOS: se suman los criterios del laboratorio y epidemiológicos para optimizar el uso de recursos humanos.

13 CONCLUSIONES DX DENV No existe la técnica de diagnóstico ideal, pero contamos con un número importante de herramientas diagnósticas para detectar DENV. La combinación de metodologías entre los 4-6 días de evolución se plantea como una estrategia de mejora para la sensibilidad del diagnóstico. En Argentina es importante evaluar las reacciones serológicas cruzadas con otros Flavivirus y continuar la vigilancia de posibles emergentes y/o reemergentes.

14 VIRUS CHIKUNGUNYA Familia: Togaviridae Género: Alfavirus ARBOVIRUS Agrupados en Alfavirus del Viejo y del Nuevo Mundo. Vectores: Aedes aegypti y Aedes albopictus. 1 Serotipo, 3 Genotipos - África Occidental (Selvático), - Asiático - ECSA (Este-Centro-Sur de África). ALFAVIRUS RECONOCIDOS EN EL CONTINENTE AMERICANO Mayaro: Trinidad, Brasil, Venezuela, Perú, Bolivia. Virus Una: (subtipo de Mayaro) aisaldo en mosquitos Brasil, en equinos en Córdoba y evidencias serológica en humanos y aves. Aurá: se aisló en mosquitos en Misiones. Encefalitis Equina del Este (EEE); de Venezuela (EEV) y del Oeste (WEE). CHIKUNGUNYA

15 Viremia y Respuesta Inmune en la Infección por Chikungunya Métodos Directos Métodos Indirectos Muestras tomadas entre 0 a 8 días de evolución POTENCIALMENTE VIREMICAS Muestras de más de 8 días Poco probable de contener carga viral

16 Selección, recolección y envío de muestras Selección de muestras a procesar: Muestras de pacientes con artralgia grave o artritis no explicada por otra condición médica, que reside o haya visitado áreas con circulación de CHIKV Tipo de muestra: Suero de Fase aguda: hasta 8 días tras el inicio de síntomas Suero de Fase convaleciente: días tras el inicio de síntomas Conservación de la muestra: Tomar la muestra y derivar inmediatamente al laboratorio. Refrigerada si se procesa dentro de las 24-48hs. Envío de la muestra Con geles refrigerantes para asegurar la cadena de frío. Siempre con la ficha clínico-epidemiológica completa: Fecha de inicio de síntomas y fecha de toma de muestra. Antecedentes de viajes. Antecedentes de vacunación, etc

17

18 Pruebas de Laboratorio para Diagnosticar CHIKV Métodos Directos: - Aislamiento viral - RT-PCR (específica y genérica) - PCR en tiempo real Métodos Indirectos o serológicos: - ELISA (IgM e IgG) - Neutralización por reducción de placas (PRNT) - IHA Aislamiento viral RT-PCR Elisa

19 Diagnóstico Molecular de CHIKV RT-PCR en TIEMPO REAL: Desarrollada por el Dr. Lanciotti (2007). Diseño de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27. Detecta todos los genotipos África Occidental, ECSA y Asia. No hay reactividad para otros Alphavirus (ONN, Ross River, Mayaro, EEE, WEE, VEE, Semiliki Forest, Sinbis). nsp1 nsp2 nsp3 nsp4 C E2 E1 AAAAAAAAAAA No estructural estructural Recientemente se han diseñado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC): Diseñados para la detección del genotipo asiático (cepa americana). 3 sets de primers y sonda : 1 ECSA y 2 asiáticos. Sondas: FAM-TAMRA. Son reacciones separadas (NO multiplex).

20 Diagnóstico Molecular de CHIKV AAAAAAAAAAA nsp1 nsp2 nsp3 nsp4 C E2 E1 No estructural estructural Límite de detección: Set 1 (genotipo ECSA): 56 ufp Set 2 (genotipo asiático-americano): 5,6 ufp Set 3 (genotipo asiático-americano): 5,6 ufp Los sets 2 y 3 tienen mayor sensibilidad que el set 1, por lo cual se recomienda para el análisis de las cepas que circulan actualmente en América Sets de primer y sondas Set 1 (ECSA) 6856F 6981c 6919-FAM Set 2 (Asiático-America) 3855F 3957c1, FAM1,2 Set 3 (Asiático-America) 856F 962c 908-FAM

21 Interpretación de Resultados Diagnóstico Molecular de CHIKV IMPORTANTE Un resultado positivo confirma el caso En general, los valores predictivos negativos de las metodologías directas no son altos y por lo tanto un resultado negativo no descarta el caso. Se sigue hablando de un caso sospechoso no conclusivo y se requiere estudiar una 2 muestra.

22 Pruebas Serológicas ELISA de Captura de Ac IgM Permite detectar infección actual o reciente Presenta cruce serológico con otros alfavirus del mismo grupo ej: virus Mayaro, Ross River, Onyong nyong) Neutralización por reducción en el número de placas Se requiere para confirmar el diagnóstico Aumento en 4 veces el título entre muestra aguda/convaleciente. Validar especificidad, estudiar panel de alfavirus CHIK RR ONN VEE MAY EEE

23 Confirmación de Resultados Aislamiento del virus CHIK con confirmación por técnica de IF, PCR real time, RT-PCR específica o RT-PCR genérica del sobrenadante celular y secuenciación Detección del genoma viral Demostración de la seroconversión o el aumento de 4 veces el título por técnica de PRNT o IHA (con panel de alfavirus).

24 ALGORITMO CHIKUNGUNYA

25 Eventos de Notificación Obligatoria Ficha Clínico-Epidemiológica S U E R O - Las muestras deben estar debidamente identificadas. - Deben estar acompañadas de las fichas epidemiológicas correspondientes y los datos en ambas deben ser coincidentes. ENVIAR TUBO DE MUESTRA PRIMARIO!!! IMPORTANTE: - Fecha de Inicio de Síntomas y Fecha de Toma de la Muestra. - Datos Epidemiológicos: antecedentes de viaje, antecedentes de vacunación. - Diagnóstico diferencial.

26 GRACIAS Laboratorio Central de la Provincia de Córdoba

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