UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA ESCUELA DE CIENCIAS AGRICOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE PROPAGACIÓN Y MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS UNIDAD III Maria Isabel Aristizabal Guerra (Directora Nacional) 1

2 INDICE DE CONTENIDO UNIDAD 3: MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS 6 CAPÍTULO 7: ASPECTOS BÁSICOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS (PARTE 1) 6 Lección 30: Generalidades del cultivo de tejidos..6 Lección 31: Laboratorio de cultivo de tejidos 10 Lección 32: Medios de cultivo.14 Lección 33: Preparación de un medio de cultivo.20 CAPÍTULO 8: ASPECTOS BÁSICOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS (PARTE 1) 22 Lección 34: Control preventivo de la contaminación (Parte 1).22 Lección 35: Control preventivo de la contaminación (Parte 2).25 Lección 36: La esterilización y sus métodos 26 Lección 37: Posibles respuestas en el cultivo de tejidos (Parte 1)..28 Lección 38: Posibles respuestas en el cultivo de tejidos (Parte 2)..30 CAPÍTULO 9: MICROPROPAGACIÓN 32 Lección 39: Generalidades de la micropropagación 32 Lección 40: Etapas de la micropropagación.34 Lección 41: Fases de laboratorio..40 Lección 42: Propagación por segmentos de hoja y por meristemos.42 2

3 Lección 43: Propagación por segmentos nodales 43 BIBLIOGRAFÍA..47 3

4 ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO Este contenido fue diseñado inicialmente en el año 2005 por el Ingeniero Agrónomo Gabriel Orlando Pardo Rodríguez, años después fue actualizado por el Ingeniero Agrónomo y Especialista en Pedagogía para el Desarrollo del Aprendizaje Autónomo, Juan Carlos Padilla Osorio, del CCAV Eje cafetero. A la fecha esta información ha sido actualizada por la Ingeniera Agropecuaria, MSc en Ciencias Agrarias, Maria Isabel Aristizabal Guerra del CEAD Medellín. 4

5 INTRODUCCIÓN La relación entre el hombre y las plantas, principalmente las cultivadas se ha acentuado desde el descubrimiento de la agricultura, esta relación no es estática, pues el hombre continua domesticando especies silvestres o intensificando y variando la utilización de las ya cultivadas, ampliando la diversidad varietal por procesos de selección y mejoramiento en la que uno de los elementos fundamentales para ampliar la riqueza varietal se basa en el manejo de las metodologías y técnicas de propagación tradicional y más actualmente en las técnicas de micropropagación para acelerar procesos de mejoramiento varietal. 5

6 UNIDAD 3. MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS CAPITULO 7. ASPECTOS BÁSICOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES (PARTE 1) Lección 30. Generalidades del cultivo de tejidos. Historia del cultivo in vitro En 1.665, Hooke realiza la primera descripción de una célula. En 1.674, Leeuhenhoek, realiza la descripción de la vida celular. En Schleiden, Establece el concepto celular en plantas sobre la totipotencia celular. En 1.846, Nageli establece que las células vegetales se forman por división de células vegetales existentes. En Sachs indica que las plantas sintetizan sustancias para poder formar órganos. En 1902, Hänning realiza un cultivo de embriones, aunque esto no se puede considerar como el inicio del cultivo in vitro ya que los embriones no necesitan hormonas para crecer. En ese misma año, Haberlandt realizó un cultivo de células aisladas del mesófilo de hoja, sin conseguir células en división. En 1.909, Kuster realiza el primer intento de fusión de protoplastos vegetales, sin lograr su supervivencia. En 1922 Robbins comienza a usar extractos de levadura y de tiamina para realizar los medios de cultivo, logrando cultivar in vitro ápices de raíz por corto tiempo. En 1933 Thimann demuestra la influencia de las hormonas en el crecimiento vegetal. 6

7 En 1934, Gautheret realiza un cultivo en condiciones asépticas del tejido cambial de árboles. En 1.936, La Rue realiza el cultivo de embriones en Gimnospermas. En 1937, Went y Thimann descubren la primera auxina: el ácido indolacético o IAA. En 1939, Gautheret cultiva segmentos de raíz de zanahoria en un medio con sales minerales, sacarosa, vitaminas y auxinas y teoriza sobre la posibilidad de crecimiento sin límite. En 1.941, Van Oberbekk utiliza la leche de coco en el cultivo de embriones de Datura. En 1944, Skoog descubrió que los callos se podían diferenciar aplicando hormonas. En 1950, Hoagland y Aaron establecieron los 11 tipos de sales que necesitaban las plantas para su crecimiento. En 1952, Morel y Martin realizan la primera aplicación del microinjerto y obtienen plantas libres de virus por meristemos. En 1957, Skoog y Miller establecieron las cantidades de auxinas y citoquininas que se necesitaban para diferenciar un callo. En 1958, Steward obtuvo callos de zanahoria que posteriormente diferenció a una planta completa. En 1960, Cocking obtuvo protoplastos empleando enzimas de digestión En 1.962, Murashige y Skoog, formulan el medio MS, uno de los medios más empleados. En 1.964, Nitsch lograr la inducción floral en condiciones in vitro. Para el mismo año, Guha y Maheswary, obtienen plantas haploides a partir de anteras de Datura. En 1.965, Ledoux, realiza pruebas para introducir DNA extraño en células. 7

8 En Kao et al y Takebe, realizan pruebas para la regeneración de plantas provenientes de protoplastos. En 1.972, Carlson et al, fusionan protoplastos y regeneran híbridos. En 1.977, mediante la utilización de anteras China (Arroz) y Japón (Tabaco) logran variedades mejoradas. En este mismo año, Chilton et al, lograr la integración del plásmido Ti de Agrobacterium en plantas. En 1.978, Melchers et al, lograr la hibridación somática entre tomate y papa. En 1.984, primera patente de un gen de una planta. Definición de cultivo de tejidos Como puede observarse en el desarrollo histórico del cultivo de tejidos vegetales distintas partes de la planta fueron utilizadas (tejidos de hoja, de tallo de raíz, meristemos, protoplastos, anteras, etc). Teniendo en cuenta que estas técnicas presentan características comunes como: Ocurren a microescala, se requiere una parte de un tejido vegetal. Se optimizan las condiciones ambientales, esto es, se homogenizan condiciones físicas, nitricionales y hormonales. Se excluyen todos los microorganísmos. Generalmente no se reproduce el patrón normal de desarrollo de un planta. Existe la capacidad de manipular células individuales lo que permite nuevas alternativas no posibles en la reproducción y mejoramiento vegetal convencional. Estas técnicas de cultivo no convencionales- solamente hasta después de se agruparon bajo el nombre de cultivo de tejidos vegetales, aunque también se conoce como cultivo in vitro, que es un término muy genérico que se refiere más 8

9 bien a la metodología usada que al propio objetivo de ese método. En sentido estricto, in vitro quiere decir "dentro de vidrio", es decir, el cultivo de plantas o de alguna de sus partes (pero también de células y tejidos animales) dentro de recipientes de vidrio en condiciones de ambiente controlado. Roca (1993) establece que el cultivo de tejidos in vitro de plantas comprende la combinación de un grupo heterogéneo de técnicas mediante las cuales una parte separada de la planta o explante (embriones, órganos, tejidos, células, protoplastos, meristemos, etc.) se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida, incubado en condiciones ambientales controladas. 9

10 Lección 31. Constitución de un laboratorio de cultivo de tejidos. Un laboratorio de cultivo de tejidos consta de las siguientes áreas o secciones, principalmente: Área de preparación Se utiliza principalmente para preparar los medios de cultivo, pero debe proveer también un espacio para almacenamiento de materiales de vidrio y de plástico y de los reactivos químicos. Debe contar con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar las balanzas, medidor de ph, agitador magnético, y un espacio para el refrigerador. Área de lavado y de esterilización El área de lavado debe incluir un lavadero grande y una fuente de agua de alto grado de pureza, para tal efecto debe tenerse un destilador de agua. Esta área debe contar con un espacio para almacenar el agua destilada en botellas plásticas. El área de esterilización debe contar con un espacio para el autoclave, y debe incluir un espacio para una estufa, y una estufa de secado, además de una estantería para almacenar material de vidrio no estéril. Área de Transferencia En esta área del laboratorio se realiza el trabajo de excisión, inoculación y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. Aquí se encuentra ubicado la cámara de flujo laminar y se puede ubicar un estante con puerta que permita almacenar material estéril. 10

11 Área de incubación El área de incubación o crecimiento in vitro debe proporcionar un buen control de la temperatura (promedio 25 C) y de la iluminación (1000 a 5000 lux). En el cuarto se instala estantes metálicos con dimensiones variables, el ancho entre 0.30 m a 1 m, el largo de acuerdo al tamaño del cuarto, la altura total entre 1.8 a 2.2 m y la distancia entre entrepaños de 0.20 a 0.50 m. Estos estantes se encuentran provistos de lámparas fluorescentes, donde puede ser conveniente que los balastos queden instalados afuera del cuarto y la regulación del tiempo de funcionamiento de las lámparas está controlado por un reloj temporizador. Área de Adaptación Está área es vital para lograr la adaptación del material producido in Vitro y puede estar constituida por un invernadero. Es importante anotar que las áreas que conforman el Laboratorio con excepción del área de adaptación, deben tener pisos lavables en materiales cerámicos o de caucho de alta duración, así mismo las paredes del laboratorio deben ser blancas, con pintura lavable de alta resistencia, evitando en las esquinas que formen ángulos de 90 (esquinas curvas). Equipos y elementos necesarios para el montaje de un laboratorio Cuarto de incubación: Iluminación fluorescente Estantería metálica Termómetro de máximas y mínimas Reloj temporizador para la regulación del fotoperiodo. 11

12 Cuarto de siembra: Cámara de flujo laminar Estante para material de vidrio estéril Área de preparación de medios Refrigerador pequeño Balanza analítica (precisión hasta 0.01 g) Balanza de precisión (precisión hasta 0.1 mg) y phhmetro. Destilador de agua Placa caliente con agitación magnética Área de lavado: Lavadero metálico Horno de secado y esterilización Otros equipos, materiales y reactivos Material para cerrado de tubos y frascos (papel aluminio, tapones, algodón, etc) Suministro de agua, gas y electricidad Probetas de 100ml, 500ml y 100ml Pipetas graduadas de 1ml, 2ml, 5 ml, 10 ml. Frascos de vidrio de diferentes volúmenes cajas de petri Beaker de 100ml, 250 ml, 600 ml, 1000 ml. Erlenmeyer de 25 ml, 125 ml,250 ml, 500 ml,1000 ml Amplia gama de productos químicos 12

13 Sacarosa* Agar-agar Hipoclorito de Sodio, Hipoclorito de Calcio. Etanol (96%) Mangos para bisturí, cuchillas para bisturí y tijeras pequeñas Pinzas metálicas cortas pinzas metálicas largas, mechero de alcohol, papel para envolver y papel filtro Toallas de papel, espátulas y detergente anionico. Cepillos de lavado para frascos Elementos de aseo Rollo de Parafilm Frascos lavadores plásticos Gradillas metálicas Cestillos metálicos Depósito de agua destilada Escurridores 13

14 Lección 32. Los medios de cultivo Aunque se han formulado una gran cantidad de medios de cultivo, antes de iniciar una investigación, es necesario definir los objetivos para determinar cual medio se va a emplear, ajustándolo y modificándolo si es necesario. El éxito en un trabajo con cultivo de tejidos se debe principalmente a la elección del medio de cultivo por cuanto existe una interacción entre el explante utilizado y los requerimientos nutricionales. Teniendo en cuenta que los requerimientos nutricionales para un crecimiento in Vitro óptimo varían con la especie, e incluso son específicos de acuerdo a la parte de la planta que se esté cultivando y a la respuesta que se desea obtener. Desde se han realizado una gran cantidad de trabajos referentes a las necesidades nutricionales de explantes utilizando medios estrictamente definidos. En términos generales, la mayor parte de los explantes se pueden cultivar en un medio que contenga una mezcla de sales minerales asegurando al menos el mantenimiento del mismo sin presentar cambios en crecimiento y diferenciación. Mientras algunos tejidos solamente en medios completamente definidos y complementados con ciertos microelementos, vitaminas y sustancias promotoras de crecimiento pueden ser cultivados obteniendo respuestas favorables al cultivo in Vitro. Teniendo en cuenta la gran cantidad de información que puede obtenerse de la literatura sobre el cultivo de tejidos vegetales, esta puede convertirse en una herramienta valiosa para la selección de un medio de cultivo, la dificultad se deriva de la confiabilidad de la información obtenida, pues normalmente se omiten o no son completos y claros algunos de los procesos desarrollados. Por ello es importante comprender la parte básica del sistema biológico con el cual se espera trabajar, tal como la definición del material desde el punto de vista taxonómico, genético y de desarrollo, ya que se presenta variabilidad en la respuesta obtenida de acuerdo al genotipo utilizado y de la forma como se realice el cultivo. A menudo el problema se basa en la interpretación de los materiales biológicos empleados en los trabajos experimentales, encontrándose diferencias en las descripciones morfológicas de los orígenes de los explantes. 14

15 Así mismo las supresiones o modificaciones de varios o muchos de los compuestos utilizados en los medios básicos frecuentemente complejizan la interpretación de los resultados obtenidos. Para obviar esta dificultad es conveniente que la información indique la designación de las sales minerales y de los suplementos de crecimiento y el valor del ph del medio. El desarrollo de los materiales in Vitro es altamente dependiente de la interacción entre la ocurrencia natural de procesos de organogénesis, la presencia natural de reguladores de crecimiento y de reguladores en el medio, por ello las respuestas pueden mostrar marcadas diferencias de acuerdo a la combinación de estos factores. Composición de los medios de cultivo Podemos en forma general decir que un medio de cultivo contiene: Una fuente de carbono. Nutrientes minerales Vitaminas. Un agente gelificante (en el caso de medios sólidos o semisólidos) Hormonas vegetales. Otros compuestos. Generalmente cuando se hace referencia a un medio basal se hace referencia a aquel medio que contiene una fuente de carbono, nutrientes minerales y vitaminas. Fuentes de carbono Son la fuente de carbono y energía, y más teniendo en cuenta que los explantes cultivados in vitro son ampliamente heterotróficos, en sus primeras fases. 15

16 La sacarosa es la fuente más utilizada (1 al 5%), pudiendo remplazarse por glucosa y en menor medida por maltosa y galactosa. Nutrientes minerales En los medios de cultivo cualitativamente se encuentran los mismos elementos (macro y Micronutrientes) que son requeridos esencialmente para el crecimiento de plantas. Vitaminas Si bien todos los medios contienen comúnmente vitaminas que in vitro favorecen el crecimiento de tejidos, hasta el momento la única vitamina que se considera necesaria en medios de cultivo es la Tiamina (0.1-1 mg/l). Aunque se han señalado efectos benéficos del ácido pantotenico, la piridoxina, la riboflavina, y el ácido nicotínico. Agente gelificante En los medios semisólidos o sólidos comúnmente se utiliza el agar (0.3-1%), considerándose importante la pureza del mismo, pues sus minerales trazas pueden alterar la respuesta in Vitro. Hormonas vegetales o reguladores de crecimiento Los fitoreguladores, fitohormonas, reguladores de crecimiento vegetal, hormonas de crecimiento vegetal, son compuestos orgánicos sintetizados por las plantas superiores, que influyen sobre el crecimiento y desarrollo, actúan generalmente en un lugar diferente a donde son producidas y se encuentran presentes y activas en muy pequeñas cantidades. En el cultivo in Vitro, estos compuestos naturales o sintéticos juegan un papel muy importante ya que la clase y concentración interactúa con el genoma de la planta, siendo responsables de la distribución de los compuestos que la planta biosintetiza y determinan el crecimiento relativo de todos los órganos de la planta. En general los explantes in Vitro podrían presentar las siguientes necesidades hormonales: 16

17 1. Explantes que no requieran ni auxinas ni citoquininas 2. Explantes que requieran solo auxinas. 3. Explantes que requieran solo citoquininas. 4. Explantes que requieran tanto auxinas como citoquininas. En el caso de especies en las que no se haya trabajado previamente se deben plantear las necesidades hormonales, su concentración absoluta y relativa y si son necesarias otros tipos de hormonas. Si se requiere la utilización de reguladores especialmente auxinas y/o citoquininas, se debe establecer el tiempo en el cual permanecerán los explantes en cada etapa, ya que se puede producir el efecto de habituación, es decir, cultivos in vitro que inicialmente necesitan reguladores, para su crecimiento y/o formación de órganos, después de algunos repicados, necesitan menores aportes de ellos, ya que han acumulado parte de los reguladores aportados en el medio de cultivo y si se mantiene el nivel inicial puede generar alteraciones en los nuevos explantes. Auxinas Producen elongación celular y expansión de los tejidos, división celular (formación de callos), formación de raíces adventicias, inhibición de la formación de brotes axilares y adventicios. La formación de raíces se observa en bajas concentraciones, mientras la producción de callos se obtiene con concentraciones altas. Dentro de las principales auxinas se encuentran: El ácido-β-indolacético (AIA) que se produce de manera natural en las plantas, siendo sensible a la acción de enzimas, se oxidan en la luz y es termolabil. El ácido-β- indolbutírico (AIB) El ácido naftalen-acético (ANA), su principal uso es la producción de rizogénesis. El ácido indol-propionico (AIP). 17

18 El 2,4 D o ácido 2,4 dicloro fenoxiacético. El 2,4,5 T o ácido 2,4,5 tricloro fenoxiacético. Estos dos últimos son utilizados principalmente para la formación de callos, afecta procesos de fotosíntesis y puede producir vitrificación de los explantes. Citoquininas Poseen una alta actividad sobre la división celular, retardan la senescencia de los órganos vegetales, promueven la formación de vástagos axilares disminuyendo la dominancia apical, inducen la iniciación del crecimiento en tallos y yemas, y el rompimiento del letargo en yemas y semillas de muchas especies. Para el cultivo de tejidos se utilizan las siguientes citoquininas: Kinetina: 6-Furfuril-amino-purina 2ip: 6-Dimetil-amino-purina BA: 6-Bencil adenina. BAP: 6-Bencil-adenin- purina. Zeatina: 6- (4-hidroxi-3 metilbut-2-enilamino) purina. Adenina. En general la concentración de trabajo está en función de su Molaridad así: Para la proliferación de tejidos M. Formación de yemas sobre callos M. Proliferación de meristemos axilares M 18

19 Giberelinas Las giberelinas son un grupo de compuestos que inducen la elongación de los entrenudos y el crecimiento de los meristemos o yemas en condiciones in vitro, también pueden romper la dormición de embriones aislados o yemas, inhiben también la formación de raíces y de brotes adventicios. La principal giberelina utilizada en condiciones in vitro es la GA3 Otros compuestos Existen un tipo variado de compuestos que son incorporados a los medios de cultivo, sobresaliendo principalmente: Leche de coco (5-15% v/v) Antioxidantes (ácido cítrico, ácido ascorbico) Aminoácidos (Sulfato de Adenina (2-120 ppm), glicina, asparagina, cisteína, tirosina, glutamina,etc.) Carbón activado ( 0.1-5%) Caseína hidrolizada(0.1-1%) Jugos de frutas Extractos de papa o levadura. Purinas y Pirimidinas. 19

20 Lección 33. Preparación de un medio de cultivo La preparación de medios puede realizarse de dos formas, una de ellas es a través de medios comerciales con premezclas de los elementos constituyentes del mísmo, entre estos se consiguen los medios MS, B5, Nitsch and Nitsch, With, Hiller, Vacin and Went, Anderson y otros. La otra forma, es a partir de soluciones stock concentradas o soluciones madre, siendo una práctica habitual en todos los laboratorios preparar soluciones stock concentradas de los distintos componentes, agrupados teniendo en cuenta que algunas sustancias son incompatibles con otras y producen fenómenos de precipitación como es el caso por ejemplo del Calcio y el Magnesio que forman precipitados con fosfatos. Es habitual trabajar con una solución stock de macronutrientes, una de micronutrientes, una de hierro con un agente quelante, otra de vitaminas y mioinositol, así como con soluciones específicas para los demás componentes del medio. Las soluciones stock se deben mantener en frascos ámbar, con una etiqueta que los identifique con fecha de preparación. Estas pueden mantenerse durante un cierto tiempo en la nevera o en el congelador, para el caso de macro y micronutrientes pueden almacenarse hasta por un año, para vitaminas por tres meses. Mientras para las hormonas como el AIA debe emplearse antes de dos semanas de preparación, el ácido ascórbico y las giberelinas se preparan en el momento de la utilización, por lo cual es conveniente mantener soluciones stock de hormonas por muy corto tiempo. Preparación de un medio partiendo de soluciones stock Para la preparación de un medio de cultivo a partir de soluciones stock, se desarrollan los siguientes pasos: 1. En un erlenmeyer agregue un volumen conocido de agua destilada estéril. 20

21 2. Añadir el volumen de soluciones de macronutrientes, micronutrientes y vitaminas, agitando. 3. A continuación, añadir la solución stock que contenga la fuente de hierro y agitar. Se debe tener en cuenta que se debe utilizar una pipeta por solución stock agregada, además de tomar el volúmen requerido de acuerdo al a cantidad de medio a preparar. 4. Agregar la fuente de carbono y agitar hasta que se disuelva completamente. 5. Completar con agua destilada estéril al volumen requerido de Medio, agitar y ajustar el ph para que se encuentre entre 5,7-5,9., añadiendo NaOH 0.1 N o HCl 0.1N al medio. 6. Si el medio a preparar se requiere que sea semisólido o sólido, se agrega el agente gelificante, agitando y calentando la solución hasta que se formen un rosario de burbujas, sin dejar ebullir. 7. Verter el contenido en los recipientes de cultivo, procediendo a taparlos y esterilizándolos en autoclave. 8. Cuando finalice el proceso de esterilización, dejar enfriar el material para que el medio adquiera una textura gelatinosa. El medio de cultivo puede permanecer en buenas condiciones durante una semana si se almacena a temperatura ambiente, y hasta un mes si se conserva 4 ºC. Conviene tener en cuenta que algunos de los componentes del medio de cultivo pueden ser termolábiles (algunas vitaminas, algunos reguladores,...). En este caso, la esterilización de la solución que contiene la substancia termolábil debe hacerse por filtración y añadirse una vez esterilizada al medio de cultivo. 21

22 CAPITULO 8. ASPECTOS BÁSICOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES (PARTE 2) Lección 34. Control preventivo de la contaminación (Parte 1). El cuidado primordial que se debe tener al hacer cultivo in vitro es la conservación del material y los medios de cultivo libres de microorganismos. Donde la contaminación por hongos y bacterias (incluyendo Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Enterobacter, Lactobacillus, Pseudomanas, Staphylococcus, y Xanthomonas), son uno de los mayores problemas que afronta quien trabaja en este campo. Aunque también se pueden presentar levaduras y virus, estos últimos son de difícil detección y pueden influir en etapas posteriores del cultivo. Las siguientes son las fuentes donde se encuentran contaminantes y sobre los cuales se requieren medidas de prevención: Los tejidos La puesta en cultivo es un proceso que consiste en obtener material vegetal in Vitro libre de microorganismos, a partir de material vegetal ex Vitro. Estos tejidos pueden llevar contaminantes tanto en su superficie como en su interior, para la desinfección superficial de estos tejidos, aunque existen una gran variedad de productos químicos que se pueden utilizar como desinfectantes superficiales, en la actualidad es casi generalizado el empleo de etanol (70%) y del hipoclorito de Sodio (NaOCl) en concentraciones del 1 al 3%, un producto alternativo al hipoclorito de sodio es el hipoclorito de calcio (Ca(COCl) 2 ) que se utiliza en concentraciones del 2 al 12%. Otro agente esterilizante es el cloruro de mercurio (HgCl 2 ), el cual se disuelve en agua a una concentración de 0,01-0,5 (p/v). El material vegetal está en contacto con el producto durante 2-12 minutos, para ser enjuagado concienzudamente con agua estéril al final del proceso. Este producto debe utilizarse bajo medidas de seguridad, ya que es nocivo para la salud. 22

23 En algunos casos resulta útil la adición de algún agente tensoactivo (TWEEN 20 ú 80 en concentración del 0.01 al 0.1%). En el proceso de desinfección es conveniente agitar el tejido conjuntamente con la solución desinfectante, y después de tratar los tejidos con las soluciones desinfectantes, es necesario remover de él, los restos del tejido mediante varias lavadas de agua destilada estéril con 2 a 3 enjuagues sucesivos (2, 5 y 15 minutos, respectivamente). Este proceso de esterilización superficial presenta, dos problemas: la capacidad de los agentes esterilizantes para dañar los tejidos vegetales y la presencia de microorganismos en el interior de dichos tejidos. En el primer caso, se aconseja disminuir la concentración y/o tiempo de exposición a los agentes esterilizantes. Con esta medida disminuyen los daños al material vegetal pero aumenta el porcentaje de contaminación. En el segundo caso, el proceso de esterilización no tiene el efecto deseado puesto que los microorganismos internos no se eliminan y pueden proliferar en el medio de cultivo, por lo cual se puede llegar a requerir productos fungistáticos o bacteriostáticos, dentro de estos últimos los más recomendados por su amplio espectro son el Sulfato de Gentamicina, el sulfato de estreptomicina, Penicilina, Kanamicina, y Rifampicina en concentraciones de mg/l. El área de trabajo Deben tenerse en cuenta como medidas preventivas la limpieza y orden riguroso en los mesones de trabajo, limpiando no solo los mesones sino paredes con alcohol, hipoclorito o algún detergente., para evitar la acumulación de esporas de hongos y bacterias. En el área donde se encuentra la cámara de flujo donde se realiza gran parte de las manipulaciones propias del cultivo in Vitro donde se requieren condiciones de esterilidad total para evitar la contaminación de los cultivos se deben tener en cuenta aspectos tales como la limpieza diaria, no introducir ningún material infectado, no permitir la entrada a objetos o personas innecesarias, no utilizar la cámara como almacén y antes de comenzar a trabajar en ella encenderla de 15 a 23

24 30 minutos antes de su uso. Así mismo es necesario el mantenimiento de la cámara limpiando los filtros de forma regular y remplazándolos anualmente. 24

25 Lección 35. Control preventivo de la contaminación (Parte 2). Los instrumentos Los instrumentos metálicos tales como pinzas requieren de mantener las condiciones de esterilidad, por lo cual es importante mientras se utilizan colocarlos en alcohol etílico y flamearlos cuidadosamente, manteniendo varios juegos mientras se trabaja. El material de vidrio y los elementos necesarios para la labor de siembra (Pinzas, espátulas, bisturíes, agua) deben esterilizarse ya sea en autoclave o en estufa, si es en estufa u horno de acuerdo a la temperatura empleada se requieren unos tiempos específicos. El material debe envolverse en papel para evitar la adherencia de contaminantes mientras se guardan y utilizan. El investigador Es la fuente primaria de contaminación por tanto debe utilizar batas de laboratorio limpias, mascarillas para nariz y boca, gorro para el cabello y polainas, siendo necesario antes de iniciar su trabajo lavar brazos y manos con agua y jabón y enjuagarse con alcohol al 70%. 25

26 Lección 36. La esterilización y sus métodos. Se entiende por esterilización a la destrucción total de los microorganismos por medios físicos y se utiliza principalmente sobre los medios de cultivo y el agua a utilizar en procesos de enjuague de tejidos o de preparación de medios. Para este proceso se utiliza principalmente el autoclave y la filtración. El autoclave Esteriliza por medio del vapor bajo presión siendo muy eficiente para la destrucción de bacterias y hongos y sus esporas, Su efectividad depende del tiempo, de la presión, de la temperatura y del volumen del objeto a esterilizar, normalmente se acostumbra utilizar una presión de 15 libras; a esta presión la temperatura del vapor es aproximadamente 121 C (250 F), Las ventajas de este sistema son: Velocidad. Destrucción adicional de virus. Simplicidad Mientras sus desventajas son: Puede haber cambios en el ph del medio de 0.3 a 0.5 unidades. Algunos compuestos se pueden separar: zeatina, ácido giberélico, sacarosa, Extractos vegetales, enzimas. Pueden producirse reacciones químicas que resulten en una pérdida de actividad, si la temperatura es demasiado alta. A altas temperaturas los azúcares pueden caramelizar, resultando tóxicos al explante. Por un proceso muy largo de autoclaveado se puede despolimerizar el agar o puede ocurrir precipitación de sales. 26

27 Filtración La filtración se usa cuando se deben añadir al medio sustancias termolábiles, donde las soluciones o medios líquidos pasan a través de un filtro de membrana, donde son retenidas partículas de microorganísmos de mayor tamaño que el correspondiente tamaño de poro del filtro. Los filtros que se utilizan son de Nitrato o acetato de celulosa, con tamaño de poro de 0,22 μ. Como mayor ventaja presenta que las sustancias termolábiles, pueden pasar a través del filtro sin sufrir ninguna modificación, como desventajas se encuentran la adsorción de componentes del medio en la membrana, y si el poro no es lo suficientemente pequeño, pueden pasar virus, además de ser un proceso más complejo que el uso del autoclave, pues, se pueden presentar contaminantes cuando existe una presión excesiva en el filtro, o se encuentran fugas en la línea de vacío. El compuesto filtrado se añade después de que el resto del medio se ha autoclavado y está a una temperatura razonable. 27

28 Lección 37. Posibles respuestas en el cultivo de tejidos vegetales (Parte 1). El establecimiento de los cultivos de tejidos vegetales, esto es,la separación de un determinado tipo de explante y los procesos relacionados con su incubación, dependerán en gran medida del explante y del sistema de cultivo que se emplee, los que a su vez dependerán del objetivo perseguido. Para su aplicación en la agricultura, independientemente del sistema de cultivo in Vitro el producto final del proceso debe ser la regeneración de plantas completas. Sin embargo, en algunos casos es posible encontrar repuestas no deseadas dentro del proceso investigativo y aplicativo, en general podemos hablar de respuestas tales como: Sin respuestas En esta situación no se observa ningún cambio apreciable en el explante, aunque en la mayoría de los casos lo que se puede observar es un explante vivo que se conserva así debido a los elementos nutricionales presentes hasta que el medio se agote ocurriendo la muerte del explante. Cultivo infectado Pudiendo presentarse en parte del material sembrado o en su totalidad, como consecuencia de contaminación de tipo exógena, endógena o combinada. Para identificar donde se presenta la contaminación es importante revisar los pasos seguidosy los procesos desarrollados durante el proceso de desinfección, aislamiento y siembra del explante. Oxidación del explante Ocurre un oscurecimiento del explante revelado por el oscurecimiento de la superficie del medio, debido a la presencia de polifenoles. Muchas plantas son ricas metabólicamente en compuestos fenólicos los cuales se manifiestan después 28

29 que un tejido se lesiona durante la disección in vitro. La oxidación de explantes se relaciona con la inhibición de la actividad de la enzima Polifenoloxidasa (PPO), bloqueando el metabolismo celular e induciendo el oscurecimiento de los explantes hasta la muerte del tejido celular en algunos casos. El control de la oxidación puede realizarse en el proceso de desinfección del material vegetal, en el momento del aislamiento de explantes o en el medio de cultivo utilizando para ello ácido cítrico, ácido ascorbico, polivinilpirrolidona o carbón activado, este último en el medio de cultivo. 29

30 Lección 38. Posibles respuestas en el cultivo de tejidos vegetales (Parte 2). Formación de callo La formación de callo, como un proceso en el cual tanto la elongación celular como la división celular ocurren de manera desordenada y caótica, debe tomarse como una respuesta indeseable a menos que se busque variabilidad para la obtención de materiales para mejoramiento vegetal, debido a procesos de mutación inducida. Callo más regeneración indirecta En este caso ocurre primero la formación de un callo, pero posteriormente ocurre la regeneración de estructuras que pueden conducir a la conformación de una nueva planta. Una primera posibilidad es el proceso de organogénesis indirecta que permite la conformación de vástagos y brotes de los cuales se derivarán nuevas plantas, en el caso de que se logre la conformación de brotes aéreos y raíces en forma independiente dentro del explante, este material se debe eliminar por presentar una variabilidad genética muy alta con alta inestabilidad en su respuesta. La otra posibilidad es el proceso conocido como embriogénesis somática por el cual se conforman estructuras bipolares similares a los embriones cigóticos y del cual se puede derivar una planta completa. Vitrificación El proceso de vitrificación, hiperhidratación, suculencia, o cristalización se refiere a un conjunto de características físicas, que describen cambios en las hojas, tallo y raíces que le dan a la plántula una apariencia cristalina, acuosa, húmeda y translúcida. 30

31 Estos desórdenes, van a impedir el normal establecimiento de plantas micropropagadas a condiciones ex Vitro. Las causas de estas malformaciones están ligadas a las especiales características del cultivo in Vitro: factores nutricionales sobredimensionados y/o superfluos (elementos minerales, carbohidratos) y elevadas dosis de reguladores de crecimiento, que producen un efecto subtóxico global; una baja intensidad luminosa durante la incubación; y la humedad relativa y un potencial hídrico, que son el factor clave para explicar estas complejas anormalidades morfogenéticas producidas en condiciones de cultivo de tejidos in Vitro. 31

32 CAPITULO 9. LA MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS Lección 39. Generalidades de la Micropropagación Cuando se evidencia que la mayoría de plantas que se propagan mediante metodologías in Vitro utilizan pequeños trozos de tejido o de órganos en condiciones asépticas, con el fin de conseguir nuevas plantas, se podría pensar que no se presenta una gran diferencia entre la propagación convencional y la micropropagación. El termino de Micropropagación, desarrollado por Hartmann y Kester en es utilizado como término general para designar cualquier técnica in Vitro aplicada a la propagación de plantas. Por tanto en la micropropagación se busca reproducir de la forma más aproximada posible todos los factores que puedan incidir en la propagación cuando esta sucede en forma convencional, aunque lo veremos más adelante, otros factores propios de la técnica de cultivo pueden afectar la respuesta esperada. La micropropagación "in Vitro" de plantas como lo presenta Roca (1993) se puede definir como cualquier procedimiento aséptico que comprenda la manipulación, en las plantas, de órganos, tejidos o células que produzcan poblaciones de plántulas y que permitan el desvío tanto del proceso sexual normal como de la propagación no aséptica que se practica convencionalmente Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las células vegetales; esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando están sujetas a los estímulos adecuados Ventajas y desventajas de la micropropagación Las ventajas son las siguientes: Elevada velocidad de propagación. Esto se debe a que las condiciones de cultivo están controladas (luz, temperatura, composición del medio, niveles y relaciones hormonales, principalmente.) 32

33 Poco material de partida. Para hacer un cultivo in Vitro no se requieren grandes cantidades de material vegetal pudiendo lograrse resultados óptimos utilizando material seleccionado de forma adecuada antes de iniciar el cultivo, que permite además manejar menores espacios que en la propagación convencional y la reducción en tiempo y en costos. Multiplicación de especies. Permite la propagación de especies de difícil propagación convencional, o protegidas o en peligro de extinción. Mayor control sobre la sanidad del material que se micropropaga. Es el caso de la obtención de plantas libres de virus, partiendo de meristemos. Producción continua. Ya que la producción de nuevos materiales se puede mantener durante todo el año, sin ser afectadas por condiciones ambientales externas. Como desventajas presenta: Problemas de contaminación. Las fases tempranas del cultivo se contaminan con mucha facilidad, lo que produce grandes pérdidas económicas. Especificidad. Las técnicas de cultivo aplicadas a una especie vegetal pueden no servir para otra especie vegetal, o incluso para otra variedad Ello implica desarrollar métodos específicos para cada caso. Inversión inicial elevada. El coste inicial del cultivo es alto, sobre todo por el mantenimiento de la planta en condiciones controladas y por las instalaciones que se necesitan. Esto debe compensarse con una alta producción de plantas y con un valor añadido sobre el producto final. Instalación y personal especializado. Los cultivos in vitro, por el hecho de que requieren estar muy controlados, deben de realizarse en instalaciones altamente especializadas y con un personal con alta formación en el campo. Las técnicas de propagación no deben producir alteración genética. Esto es, durante ninguna parte del proceso se deben permitir la formación de callos, que favorecen cambios mutacionales. 33

34 Lección 40. Etapas de la micropropagación Etapa 0: Preparación del material vegetal El empleo de explantes que se encuentren expuestos a bajos niveles de contaminantes exógenos y endógenos puede resolverse con el manejo que se le dé a la planta donante durante esta etapa. La planta donante debe elegirse sobre la base de un proceso de selección, teniendo en cuenta las características agronómicas y/o potenciales deseables. Una vez seleccionados los individuos, es preciso definir el tipo de explante a establecer en condiciones in Vitro. En general, los órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. La elección del explante apropiado constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos in Vitro, dicha elección está determinada por el objetivo perseguido y la especie vegetal utilizada. Si por ejemplo se busca la proliferación de callos, es factible la utilización de una amplia gama de explantes desde que contenga células nucleadas vivas, si la obtención de callos no está limitada por el tipo de explante, la selección del mismo se hará teniendo en cuenta la disponibilidad, facilidad de manipulación, homogeneidad, baja contaminación por microorganismos y rápida respuesta in Vitro. Con respecto a la especie vegetal es importante tener en cuenta la variabilidad genética asociada con el genotipo, ya que es frecuente que en condiciones homogéneas del medio de cultivo y ambiente las respuestas in Vitro de un determinado explante de una especie difiera en respuesta con otro explante distinto de la misma especie. La respuesta de los explantes puede variar de acuerdo con el estado de desarrollo y la edad, considerándose la misma como la edad el material es decir el período de tiempo desde cuando se originó, la edad fisiológica, donde el explante se considera joven o viejo de acuerdo a si es derivada de un aparte de la 34

35 planta que se encuentre en una fase juvenil o adulta, la edad secuencial considerando que las células no diferenciadas se encuentran en órganos juveniles y células diferenciadas se encuentran en órganos más viejos. Aspectos tales como pretratamientos a explantes, las condiciones de crecimiento de las plantas donantes, y la época del año en que se toma el material también pueden afectar la respuesta del explante. Etapa 1: Establecimiento del cultivo En esta etapa los principales procesos a controlar son la selección, el aislamiento y la esterilización de los explantes. El objetivo de esta etapa es establecer explantes axénicos, donde la selección y la concentración de los productos para la eliminación de los contaminantes, así como el tiempo de desinfección se determinan, en gran medida experimentalmente por pruebas y evaluaciones de prueba y error. Etapa 2: Multiplicación El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicación sucesivos y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa Es importante señalar que en esta etapa, cualquiera que sea la vía de regeneración empleada, para procesos de micropropagación es conveniente evitar la formación de callo para disminuir el riesgo de variabilidad. En esta etapa, los medios de cultivo, los reguladores de crecimiento y las condiciones de crecimiento juegan un papel crítico sobre la multiplicación clonal de los explantes. Los medios de cultivo influyen por una parte por la presencia de los nutrientes requeridos por el explante para su mantenimiento y por otra parte las condiciones de ph del medio, pudiendo afectar la solidificación de los agentes gelificantes en medios de cultivo sólidos, la solubilidad y la absorción de algunos componentes del medio de cultivo, así como la actividad enzimática. 35

36 Los tipos de reguladores, sus combinaciones y rangos de concentraciones deben ser optimizados para cada especie, genotipo y etapa de multiplicación. Así mismo, las condiciones del cuarto de incubación tales como fotoperíodo e intensidad lumínica y las condiciones de temperatura tienen una alta incidencia en la respuesta del explante. La temperatura a la que está expuesto el explante cultivado in Vitro afecta a la mayoría de procesos fisiológicos y por consiguiente es un factor fundamental a controlar. Normalmente, se pueden obtener resultados satisfactorios con temperaturas de incubación que oscilan entre los 20 y 28 C, con valores promedio de 25 º C. La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los organismos autótrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en los cultivos in Vitro. Los aspectos relacionados con la luz que son importantes en los cultivos in Vitro son: La cantidad de luz: LA IRRADIACIÓN (alrededor de 25 W/m 2 o 100 µmol/m 2 s ) La calidad de la luz: EL ESPECTRO (la fuente de luz más usada es la lámpara fluorescente luz día. La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO (En forma general se utilizan 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad) En esta etapa si hay presencia de compuestos fenólicos que producen oxidación y liberación de exudados al medio, se puede inhibir el crecimiento de los explantes. Para controlar y limitar al mínimo la producción y oxidación de los compuestos fenólicos, se pueden emplear agentes absorbentes de fenoles en el medio de 36

37 cultivo, tales como el carbón activado y la polivinilpirrolidona o antioxidantes como el ácido ascórbico o el ácido cítrico. Es recomendable además lograr que la tasa de intercambio gaseoso entre los ambientes del recipiente y externo sea óptima, evitándose la acumulación de CO 2 y de etileno por una parte y por otra parte el manejo de la humedad relativa. En este sentido, el sellado del recipiente es importante, teniendo en cuenta que el intercambio gaseoso es más limitado con el empleo de una tapa de aluminio, que con un film de polietileno extensible. En algunos casos la utilización de una tapa perforada con tapón de gasa es altamente recomendable Etapa 3: Enraizamiento En esta etapa se produce la formación de raíces adventicias. En las especies herbáceas es relativamente fácil mientras que en las especies leñosas es complicado por su limitada capacidad rizogénica. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex Vitro. En el primer caso pueden emplearse varios tipos de sustratos y reguladores de crecimiento (auxinas) para promover la rizogénesis. En un medio solidificado con agar, los nutrientes se reducen de 1/2 a 1/4 de la composición original, y la sacarosa se reduce a una concentración final de 1-2%. El empleo de agar aunque por un lado favorece la rizogénesis en forma más sincrónica como resultado del contacto íntimo del material con el medio de cultivo, por otro lado produce raíces usualmente delgadas y poco funcionales. Etapa 4: Endurecimiento Una planta que se ha originado in Vitro difiere en muchos aspectos de las originadas in Vivo. Las plantas cultivadas in vitro tienen generalmente la cutícula escasamente desarrollada, Las células en empalizada tampoco están muy desarrolladas, son pequeñas y se encuentran en pequeñas cantidades. 37

38 Debido a la alta humedad (90-100%), Los estomas no son suficientemente operativos, siempre están abiertos. Como consecuencia, cuando se transfiere la planta al suelo, se produce una transpiración cuticular extra, ya que la humedad del aire en las condiciones in vivo es muy baja. Así mismo las hojas de una planta producida in vitro son frecuentemente finas, blandas, y fotosintéticamente poco activas, y en consecuencia mal adaptada a las condiciones que pueden encontrar in Vivo, además de existir una pobre conexión vascular entre vástagos y raíces. Por lo anterior, las plantas producidas in Vitro requieren un cierto tiempo para aconstumbrarse a las condiciones in Vivo, de tal manera que quedan endurecidas para afrontar el medio ambiente. En esta etapa las plantas enraizadas in Vitro o para enraizar in Vivo, pero obtenidas in Vitro, se sacan del medio gelatinoso retirando los residuos del medio adheridas a la planta, siendo sembradas en un sustrato estéril contenido en cámaras de vidrio o plásticas, utilizando como sustratos escoria fina, vermiculita más tierra (relación 1:2), cascarilla de arroz más tierra ( relación 1:3) y suelo cernido. Las plantas así sembradas deben cubrirse con bolsas plásticas o con vasos desechables, manteniendo una alta humedad relativa, e incorporando fertilizantes foliares, la cobertura se irá retirando de manera secuencial hasta que no exista dicha cobertura. Factores que influyen sobre la micropropagación Genotipo: la capacidad de regeneración es muy variada, generalmente regeneran mejor las Dicotiledóneas que las Monocotiledóneas, y se presenta mayor regeneración entre plantas herbáceas que en las leñosas. Además existen grandes diferencias en la capacidad de división celular y regeneración en plantas de la misma variedad pero de distinta variedad o cultivar. Edad fisiológica del explante: Mientras más joven y menos diferenciado esté el tejido mejor será la respuesta in Vitro. 38

39 Posición del explante dentro de la planta: o topófisis que indica como la influencia de la posición del explante, afecta el crecimiento y desarrollo in Vitro, pudiendo explicarse este fenómeno por la acumulación endógena de fitoreguladores y por la edad en tiempo del material donante de explantes. El explante: Siendo una parte de un tejido o de un órgano al aislarlo, el tamaño del explante puede tener influencia en el proceso de micropropagación, teniendo en cuenta que es más difícil inducir una respuesta en estructuras muy pequeñas que en estructuras de mayor tamaño, debido a la acumulación de sustancias de reserva y contenidos hormonales, por otra parte el proceso de desinfección es más complejo en estructuras grandes que en estructuras de menor tamaño. Superficie de exposición: Si la superficie de exposición es demasiado grande se producirá etileno, que es perjudicial para el proceso de micropropagación, pero por otra parte cuanto mayor sea la superficie, mayor será la capacidad de absorción de nutrientes y reguladores. Teniendo en cuenta los anteriores aspectos, como criterios deseables para obtener éxito en el proceso de micropropagación in Vitro se pueden considerar: Que se mantenga la estabilidad genética de las plántulas obtenidas, para ello es deseable la utilización de meristemos, yemas y segmentos nodales donde se mantiene la estabilidad genética. Realización de una selección cuidadosa del material de partida. Es deseable que la transferencia de etapa a etapa no sea compleja. Así mismo la propagación in vitro no debe ser compleja. No debe perderse la capacidad de regeneración, para ello es conveniente no utilizar muchos repicados. Debe ser económicamente viable. 39

40 Lección 41. Fases de laboratorio En el laboratorio se presentan tres fases que siempre ocurrirán sin tener en cuenta el tipo de explante o la metodología de micropropagación utilizada, estas son: Fase de aislamiento Los explantes deben separarse de la planta donante, esta labor de corte y separación del explante se puede realizar sobre una placa de cristal estéril, presentando como desventaja que los instrumentos cortantes pierden rápidamente su filo, o también sobre papel de filtro estéril, siempre debe tenerse en cuenta el tamaño de la sección cortada. Fase de inoculación. Durante la inoculación o siembra, el tubo o frasco conteniendo el medio de cultivo sólido debe estar en principio en posición horizontal, pues, esto reduce fuertemente la posibilidad de contaminación, sobre todo cuando no se trabaja con cámara de flujo laminar. El flameado del cuelo de tubo o frasco es desaconsejable por la entrada de etileno en el recipiente. El método de inoculación sobre medios sólidos depende en gran medida del tipo de explante con que se trabaje, las semillas y embriones se ubican sobre el medio, al igual que los meristemos; mientras explantes de hojas, yemas, segmentos nodales, se introducen ligeramente en el medio. Fase de repicado. Esta fase involucra principalmente el paso del explante y de la plántula obtenida a las diferentes etapas de la micropropagación, o por otra parte al número de veces que separo brotes obtenidos in Vitro para aumentar el material propagado. 40