SELECCIÓN DEL MEJOR ESPERMATOZOIDE

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1 SELECCIÓN DEL MEJOR ESPERMATOZOIDE MIGUEL ANGEL FERNÁNDEZ PÉREZ INTRODUCCIÓN Los continuos avances en el campo de la reproducción asistida han contribuido a la mejora de los resultados de los diversos tratamientos aplicados en parejas estériles. Pero aún así, todavía quedan muchos casos por resolver en los que la aplicación de las técnicas actuales no son suficientes para obtener el resultado deseado. En los programas de fecundación in vitro la obtención de ovocitos es limitada en cuanto a su número, pues obviamente no podemos obtener todos los que quisiéramos, ya sea para elegir el que creemos que es el mejor, o para fecundar muchos y elegir luego el embrión de mejor calidad para su transferencia. Entre otros factores, la calidad de los óvulos está muy vinculada a la estimulación ovárica, siendo esta la que decida probablemente en gran medida si los ovocitos obtenidos son competentes o no. Los espermatozoides, a diferencia de los óvulos, sí se disponen de mucha más cantidad (la mayoría de las veces) entre los cuales poder elegir el mejor. Y todos sabemos que el espermatozoide va a determinar el desarrollo temprano y tardío del embrión, así como su euploidia 1, 2. Por tanto, la necesidad de saber elegir el mejor espermatozoide es fundamental de cara a tener éxito en el tratamiento, ya que de esta manera reduciríamos el riesgo de fecundar el mejor ovocito obtenido con un espermatozoide defectuoso, comprometiendo el resultado 3. Además, en aquellos países donde la limitación del número de óvulos a fecundar está impuesta por cuestiones legales, se hace especialmente interesante la selección del mejor espermatozoide 4. Actualmente en los procesos de ICSI la selección de los espermatozoides se realiza fundamentalmente en base a su morfología y a su motilidad. Es decir, siguiendo los criterios de la OMS 5 para la identificación de un espermatozoide normal. Pero estos criterios son muy relativos y limitados, ya no solo para la realización de ICSI 6, sino como herramienta diagnóstica, pues no necesariamente son datos que indiquen una buena salud espermática 7. [1]

2 Actualización Obstetricia y Ginecología 2011 El objetivo fundamental del presente estudio es abordar los diferentes métodos de selección espermática existentes en la bibliografía, con especial atención a la selección de espermatozoides a alta magnificación como método de selección adecuado en los procesos de ICSI. TECNICAS DE SELECCIÓN ESPERMATICA Entre los métodos actuales de selección espermática, el empleo de la centrifugación por gradientes de densidad así como la técnica de Swim up, ambas conocidas por todos nosotros, seleccionan espermatozoides siguiendo estos criterios 8. Pero no son técnicas lo suficientemente eficaces para seleccionar el mejor espermatozoide, por lo que se hace necesario el desarrollo de nuevas técnicas con tal propósito. Multitud de estudios aportan nuevas ideas que se podrían emplear para ayudar a identificar el mejor espermatozoide. Entre ellos, el estado del ADN espermático 9, la presencia en la membrana de determinados marcadores apoptóticos 10 e indicadores de madurez espermática 11, así como la selección del espermatozoide en base a su morfología observada a gran magnitud (IMSI) 12 son marcadores recientes que pueden ayudar en la identificación del mejor espermatozoide. En base a estos hallazgos, existen actualmente determinadas técnicas desarrolladas las cuales vamos a analizar en cuanto a eficacia, ventajas e inconvenientes, así como su aplicación clínica. MAGNETIC ACTIVATED CELL SORTING (MACS) Esta técnica se basa en las diferencias fisiológicas de los espermatozoides a nivel molecular que determinan su viabilidad, las cuales pueden ser utilizadas para la selección del espermatozoide competente: La presencia de fosfatidilserina (PS) 13 en la membrana externa del espermatozoide se ha correlacionado con un alto índice de apoptosis en el espermatozoide, determinando por tanto una relación directa entre la presencia de PS y viabilidad espermática. La externalización de ubiquitina 14 (molécula utilizada por la maquinaria celular para marcar sustratos defectuosos intracelulares con el propósito de ser eliminados) en las membranas de los espermatozoides también parece ser un indicador de viabilidad, al encontrarse en grandes cantidades en aquellos espermatozoides con formas anormales y reducción de la motilidad. El Factor de activación plaquetario (PAF) 15 es un fosfolípido que también está relacionado con la movilidad, reacción acrosómica y viabilidad espermática, especialmente la presencia de su receptor en las membranas espermáticas. [2]

3 Reproducción El ácido hialurónico (AH), y su unión al espermatozoide, nos indicaría buena salud espermática al presentar este en su superficie receptores para el AH, pudiéndose por tanto emplear también como marcador 16. Estas moléculas, debido a su relación con la viabilidad celular, se pueden emplear como marcadores de cara a seleccionar el mejor espermatozoide 17. La técnica MACS consiste en el uso de MicroBeads (MB), unas partículas coloidales magnéticas pequeñas de unos 50 nanómetros de diámetro unidas a anexina V, que se conjugan con anticuerpos específicos del marcador que queramos utilizar. De este modo, los espermatozoides alterados se unirán específicamente a estas microesferas, y mediante el empleo de un intenso campo magnético los espermatozoides marcados quedarán retenidos por su unión a estas microesferas en la matriz de una columna, realizándose así la separación física de los espermatozoides 18. En la bibliografía se publican mejoras en la selección espermática tras la aplicación de MACS en términos de movilidad, viabilidad, reducción en la incidencia de fragmentación del DNA, así como un aumento del potencial de fecundación 19. Mejoras en tasas de división embrionaria, embarazo clínico, y mejoras en la supervivencia espermática tras la descongelación 20. Por el contrario, en prácticamente todos los artículos se hace mención a la necesidad de realizar estudios clínicos adicionales para obtener una valoración real de dicha tecnología, así como su seguridad en su empleo. POLSCOPE El uso de luz polarizada también es un método de selección espermática, basado en la birrefringencia de los espermatozoides generada a partir de la textura protoplásmica de estos, la cual tiene propiedades anisotrópicas. Los espermatozoides, células muy condensadas y DNA compacto, presentan una alta birrefringencia cuando se le incide con luz polarizada 21. Aquellos con presencia de vacuolas no generan tal índice de refringencia, así como aquellos con morfología alterada ya sea en cabeza, pieza intermedia y flagelo. Además, se pueden llegar a distinguir espermatozoides con reacción acrosómica 22. Se trataría pues, de un método de selección no invasivo para ICSI. La escasa bibliografía publicada arroja resultados prometedores, siendo necesarios muchos más estudios clínicos para determinar su eficacia. ELECTROFORESIS De todos es bien sabido el papel que tiene el estado fisiológico del DNA en los espermatozoides de cara a su viabilidad. El índice de fragmentación del DNA o la alte [3]

4 Actualización Obstetricia y Ginecología 2011 ración en el número de cromosomas también se puede valorar mediante el empleo de la Electroforesis, la cual permite la selección de los espermatozoides en base a su electronegatividad y al tamaño de su genoma 23. Ainsworth publica su primer nacimiento mediante el uso de esta técnica en 2007, alabando las ventajas de dicha técnica en cuanto a capacidad de selección espermática independientemente de su origen y/o cantidad de estos, con respecto a motilidad, viabilidad, morfología e integridad del DNA 24. No obstante, se necesitan más estudios clínicos que valoren objetivamente dicha técnica, mencionando además la dificultad y complejidad que tiene poner dicha técnica a punto. IMSI La selección morfológica a gran magnitud ( x) de los espermatozoides es una técnica relativamente reciente que últimamente ha adquirido cierta expansión en cuanto a su aplicación. Varios estudios avalan el empleo de dicha técnica especialmente en casos de factor masculino severo en términos de tasa de embarazo y especialmente en la reducción de la incidencia de abortos, pues permite la selección del mejor espermatozoide en tiempo real y por tanto su empleo directo en la ICSI (IMSI Intracitoplasmic morphologically selected sperm injection) 25. Bartoov 26 en 2002 definió unos criterios de selección espermática a alta magnificación que denominó MSOME (Motile Sperm Organelle Morphology Examination), basado en el análisis de 6 orgánulos subcelulares del espermatozoide. Así, la normalidad morfológica de un espermatozoide se define por la presencia de un núcleo y acrosoma normal, región post acrosómica, mitocondrias, pieza intermedia y cola también normales, sin gotas citoplásmicas alrededor de la cabeza. Con ello, estableció una normalidad morfológica de 3,3 ± 0,5%. Los autores concluyeron que solo la normalidad de la cabeza constituía un parámetro clave y decisivo, pues encontraron diferencias significativas en cuanto a tasa de fecundación y la tasa de embarazo clínico. Wittemer 27 en 2006 estableció que si la normalidad estricta de la cabeza del espermatozoide a muchos aumentos estaba por debajo del 8% en el eyaculado, se debería realizar ICSI para evitar fallos de fecundación en una FIV convencional. La selección de dichos espermatozoides provoca una mejor tasa de formación de blastocistos 28, lo que sugiere un claro efecto paterno sobre la viabilidad del embrión. Además, se ha relacionado la morfología del espermatozoide a alta magnificación con su estado fisiológico en términos de función mitocondrial, estructura de la cromatina (integridad y fragmentación del DNA) así como incidencia de aneuploidías, estableciéndose una relación directa entre la normalidad morfológica y buena salud espermática 29, lo que explicaría no solo la sutil mejora en términos de embarazo clínico, sino también la mejora sustancial en cuanto a tasas de aborto clínico 30, 31 [4]

5 Reproducción Recientemente se ha investigado bastante la presencia y tamaño de vacuolas en la cabeza del espermatozoide mediante alta magnificación 32, 33, 28, aparentemente debido a sus implicaciones clínicas en término de embarazo y aborto. Dichas vacuolas parecen estar relacionadas con daños en la cromatina, fragmentación del DNA espermático y alteraciones cromosómicas. Debido a esto, incluso el estudio de los espermatozoides mediante MSOME ha sido propuesto como herramienta diagnóstica a incluir en los laboratorios de andrología como método rutinario de análisis de semen 34, debido a su objetividad, eficacia y sensibilidad 35 Como inconveniente, el tiempo empleado en la búsqueda y selección de los espermatozoides adecuados que puede variar entre 1 4 horas, y el elevado coste del equipo necesario, hacen que dicha técnica no llegue a implementarse en las clínicas de fertilidad de manera generalizada. Por tanto, la necesidad de conocer con estudios bien controlados y aleatorizados la repercusión de la selección del espermatozoide a este nivel sobre los resultados globales en los tratamientos de FIV es obvia. Recientemente se ha publicado un meta análisis comparando el uso de ICSI frente IMSI, concluyéndose que la IMSI no solo mejora de manera significativa el porcentaje de embriones de buena calidad, las tasas de implantación y de embarazo, sino que además reduce la tasa de aborto comparado con la ICSI 31. Aún así, se necesitan más estudios que avalen dicha técnica, pues tan solo 2 artículos reunieron los criterios de inclusión. En nuestro laboratorio incorporamos recientemente un equipo de IMSI, concretamente un Leica AM6000. Este equipo tiene la enorme ventaja de poder realizar en la misma placa de Petri tanto la selección del espermatozoide como posteriormente la IMSI, al disponer de objetivos de inmersión de 20x y de 40x. Mediante el empleo de un zoom variable de lentes incorporado en el microscopio, es posible conseguir un rango de aumentos de 6600x 12000x. CONCLUSIONES Los métodos de selección de espermatozoides son de vital importancia de cara a ofrecer buenos resultados reproductivos y ciertas garantías de conseguir un bebé sano en casa. Los métodos tradicionales de selección no son objetivos, además de no ser suficientemente eficientes en la identificación de espermatozoides viables. Multitud de técnicas de selección pretenden este objetivo, pero son necesarios la realización de amplios estudios bien controlados que demuestren la eficacia de cada una de ellas. La técnica IMSI, gracias a la selección morfológica de los espermatozoides a alta magnificación en tiempo real, a pesar de ser una técnica costosa y requerir tiempo para su realización, parece demostrar ser una técnica efectiva cuando las causas de [5]

6 Actualización Obstetricia y Ginecología 2011 esterilidad son por factor masculino severo o abortos de repetición tras ciclos de FIV, por lo que su uso en Reproducción Asistida podría llegar a ser frecuente y estar presente en todos los centros de FIV. Al tratarse de una técnica no invasiva, la seguridad en su aplicación está garantizada. Además, su uso como herramienta diagnóstica ayudaría en gran modo a diagnosticar determinados problemas de fertilidad masculina, pues la presencia de vacuolas en la cabeza del espermatozoide parece tener una estrecha relación con el potencial de viabilidad de este. BIBLIOGRAFIA 1 Tesarik J 2005 Paternal effects on cell división in the human preimplantation embryo. Reproductive Biomedicine Online 10, Shoukir Y, Chardonnens D, Campana A et al Blastocyst development from supernumerary embryos after intracytoplasmic sperm injection: a paternal influence? Human Reproduction 13, De Vos A, Van De Velde H, Joris H et al Influence of individual sperm morphology on fertilization, embryo morphology, and pregnancy outcome of intracytoplasmic sperm injection. Fertility and Sterility 79, Antinori M, Licata E, Dani G et al Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection: a prospective randomized trial. Reproductive Biomedicine online 16, World Health Organization Laboratory Manual for the Examination of Human Semen And Sperm Cervical Mucus Interaction (3 rd edition) Cambridge University Press. Cambridge, UK. 6 Nagy ZP, Liu J, Joris H et al The result of intracytoplasmic sperm injection is not related to any of the three basic sperm parameters. Human Reproduction 10, Svalander P, Jakobsson AH, Forsberg AS et al The outcome of intracytoplasmic sperm injection is unrelated to strict criteria sperm morphology. Human Reproduction 11, Vanderzwalmen P, Bertin Segal G, Geerts L et al Sperm morphology and IVF pregnancy rate: comparison between Percoll gradient centrifugation and swim up procedures. Human Reproduction 22 (Suppl. 1), i59 i60. 9 Barroso G, Morshedi M, Oehninger S 200 Analysis of DNA fragmentation, plasma membrane translocation of phosphatidylserine and oxidative stress in human spermatozoa. Human Reproduction 15, Marchetti C, Marchetti P 2005 Detection of apoptotic markers in human ejaculated spermatozoa as new methods in human reproductive biology. Gynécologie Obstétrique and Fertilité 33, [6]

7 Reproducción 11 Cayli S, Jakab A, Ovari L et al Biochemical markers of sperm function: male fertility and sperm selection for ICSI. Reproductive BioMedicine Online 7, Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F 2001 Selection of spermatozoa with normal nuclei to improve the pregnancy rate with intracytoplasmic sperm injection. New England Journal of Medicine 345, Aziz N, Said T, Paasch U et al The relationship between human sperm apoptosis, morphology and the sperm deformity index. Human Reproduction 22, Varum S, Bento C, Sousa AP et al Characterization of human sperm population using conventional parameters surface ubiquitination and apoptotic markers. Fertility and Sterility 87, Ali A, Virirak Kattygnarath T, Benkhalifa M et al Essential role of platelet activating factor in male reproduction: A review. Reproductive Biomedicine Online 14, Huszar G, Ozenci CC, Cayli S, et al Hyaluronic acid binding by human sperm indicates cellular maturity, viability and unreacted acrosomal status. Fertility and Sterility 79, Suppl Muratori M, Marchiani S, Tamburrino L et al Markers of human sperm functions in the ICSI era. Frontiers in Bioscience 16, Said TM, Agarwal A, Zborowski M, et al Utility of magnetic cell separation as a molecular sperm preparation technique. Journal of Andrology 29, Grunewald S, Reinhardt M, Blumenauer V et al Increased sperm chromatin decondensation in selected nonapoptotic spermatozoa of patients with male infertility. Fertility and Sterility 92, Said TM, Grunewald S, Paasch U et al Effects of magnetic activated cell sorting on sperm motility and cryosurvival rates. Fertility and Sterility 83, Gianaroli L, Magli MC, Collodel G, et al Sperm head s birefringence: A new criterion for sperm selection. Fertility and Sterility 90, Gianaroli L, Magli MC, Ferraretti AP et al Birefringence characteristics in sperm heads allow for the selection of reacted spermatozoa for intracytoplasmic sperm injection. Fertility and Sterility 93, Ainsworth C, Nixon B, Aitken RJ, 2005 Development of a novel electrophoretic system for the isolation of human spermatozoa. Human Reproduction 20, Ainsworth C, Nixon B, Jansen RP et al First recorded preganacy and normal birth using electrophoretically isolated spermatozoa. Human Reproduction 22, [7]

8 Actualización Obstetricia y Ginecología Souza Setti A, Ferreira RC, Paes de Almeida Ferreira Braga D, et al Intracytoplasmic sperm injection outcome versus intracytoplasmic morphologically selected sperm injection outcome: a meta analysis. Reproductive Biomedicine Online 21, Bartoov B, Berkovitz A, Eltes F et al Real time fine morphology of motile human sperm cells is associated with IVF ICSI outcome. Journal of Andrology 23, Wittemer C, pujol A, Boughali H et al The impact of high magnification evaluation of sperm on ART outcome. Human Reproduction 22 (Suppl. 1), i59 i Vanderzwalmen P, Hiemer A, Rubner P et al Blastocyst development after sperm selection at high magnification is associated with size and number of nuclear vacuoles. Reproductive BioMedicine Online 17, Garolla A, Fortini D, Menegazzo M, et al High power microscopy for selecting spermatozoa for ICSI by physiological status. Reproductive Biomedicine Online 17, Figueira RD, Braga DP, Setti AS et al Morphological nuclear integrity of sperm cells is associated with preimplantation genetic aneuploidy screening cycle outcomes. Fertility and Sterility Dec Wilding M, Coppola G, Di Matteo L et al 2010 Intracytoplasmic injection of morphologically selected spermatozoa (IMSI) improves outcome after assisted reproduction by deselecting physiologically poor quality spermatozoa. Journal of Assisted Reproduction an Genetics Nov Franco JG, Baruffi RL, Mauri AL et al Significance of large nuclear vacuoles in human spermatozoa: implications for ICSI. Reproductive Biomedicine Online 17, Berkovitz A, Eltes F, Ellenbogen A et al. 2006a Does the presence of nuclear vacuoles in human sperm selected for ICSI affect pregnancy outcome? Human Reproduction 21, Nadalini M, Tarozzi N, Distratis V et al Impact of intracytoplasmic mophologically selected sperm injection on assisted reproduction outcome: a review. Reproductive Biomedicine Online 19 Suppl 3, Oliveira J, Petersen C, Massaro F et al 2010 Motile sperm organelle morphology examination (MSOME): intervariation study of normal sperm and sperm with large nuclear vacuoles. Reproductive Biology and Endocrinology 8:56. [8]

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